陳茹 劉洪伯 馬麗麗

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，新疆 烏魯木齊 830011)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是全球第三大常見的癌癥類型，致死率也位居全球第三位，每年造成約7萬例患者死亡[1]。隨著人們飲食和生活方式的變化，CRC發(fā)病率也呈上升趨勢。盡管近幾十年來CRC的診斷和治療均取得了一定進展，但尚未開發(fā)出有效的方法來治療晚期轉(zhuǎn)移性CRC，據(jù)統(tǒng)計，局部CRC患者的5年生存率為80%，而遠處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率僅為10%～20%[2]。目前，基于手術(shù)的綜合治療仍是晚期CRC治療的最佳策略，其中常用的一線化療藥物包括氟尿嘧啶、亞葉酸鈣和奧沙利鉑等[3-4]，但這些藥物的長期重復使用會導致耐藥性產(chǎn)生，從而限制了其臨床應(yīng)用。基質(zhì)細胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，也稱為CXC趨化因子配體12(CXCL12)，是一類具有強大趨化潛能的穩(wěn)態(tài)細胞因子，與跨膜G蛋白偶聯(lián)受體CXCR4相互作用，參與一系列生理和病理過程，例如參與多種組織器官發(fā)育、細胞生長、腫瘤進展、血管生成及轉(zhuǎn)移[5-6]。AMD3100是SDF-1/CXCR4軸的特異性拮抗劑，通過特異性的與CXCR4結(jié)合抑制SDF-1/CXCR4軸之間的相互作用，進一步阻斷該軸參與的生理和病理過程，并且與其他趨化因子受體無交叉反應(yīng)[7]。目前，靶向SDF-1已經(jīng)成為多種實體瘤的治療策略之一，本研究旨在探討通過AMD3100靶向SDF-1阻斷SDF-1/CXCR4軸后對結(jié)直腸癌化療敏感性的影響及其作用機制，以期為結(jié)直腸癌的治療提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級BALB/c裸鼠30只，4周齡，體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，溫度為22～25℃，相對濕度為40%～60%，每日光照/黑暗交替各12 h，期間自由飲水與飲食。本研究通過醫(yī)院動物倫理委員會審核通過。

1.2 主要材料與試劑 人結(jié)直腸癌細胞系LoVo和人單核細胞系THP-1購自購于中國科學院上海細胞庫。胎牛血清購自杭州四季青；青霉素-鏈霉素雙抗、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；佛波酯(PMA)、白細胞介素-4(IL-4)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)和SDF-1抑制劑AMD3100購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國ThermoFisher Scientific公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒購自日本Takara公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒及ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物研究所；免疫組織化學染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；APC標記CD86抗體、PE標記CD206抗體、eFluor 450 標記F4/80抗體、APC標記CD11c抗體以及兔抗人SDF-1、iNOS、Arg-1抗體購自英國Abcam公司；兔抗人GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物有限公司。其他使用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與誘導 將凍存的LoVo細胞浸入37℃水浴鍋復蘇后，加入適量含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。在THP-1細胞中添加RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整密度為1×106個/mL，吸取100 μL接種于6孔板中，每孔加入20 ng/mL PMA，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，誘導細胞貼壁分化為M0型巨噬細胞，再換用20 ng/mL IL-4繼續(xù)培養(yǎng)72 h，誘導獲得TAMs細胞。

1.3.2 流式細胞術(shù) 收集誘導后的TAMs細胞，PBS洗滌細胞并重懸，并在細胞懸液中加入等體積血清，于室溫下封閉30 min，接著加入APC標記CD86抗體與PE標記CD206抗體，于4℃暗室反應(yīng)30 min，PBS洗滌細胞后再次重懸，通過流式細胞儀檢測細胞表面CD86和CD206表達情況。

1.3.3 實時熒光定量PCR 使用5 μg·mL-1SDF-1抑制劑AMD3100處理TAMs細胞24 h后，收集細胞，PBS洗滌細胞。Trizol試劑分別提取TAMs細胞與SDF-1抑制劑AMD3100處理后TAMs細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA純度與濃度，選擇OD260/OD280值在1.8～2.0間的樣品，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增實驗檢測各基因在mRNA上的表達水平，具體根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書操作，設(shè)內(nèi)參基因為GAPDH。擴增條件為：95℃ 3 min，1個循環(huán)；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，40個循環(huán)，根據(jù)2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。引物具體序列如下：SDF-1上游引物5′-CCTGTGTGTCATGCCCTCTT-3′，下游引物5′-AGTCCAGCCTGCTATCCTCA-3′；iNOS上游引物5′-ATGACTGAATATAACTTGTG-3′，下游引物5′-GAGAAGGACAAGAAAGCC-3′；TNF-α上游引物5′-TCTTCTCATTCCTGCTTGTG G-3′，下游引物5′-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3′；Arg-1上游引物5′-AGGGCAGAGTCAAGATGA AC-3′，下游引物5′- TGTGGTTGTCAGTGGAGCT TG-3′； TGF-β上游引物5′-ACCTCGGCTGGAAGT GGATC-3′，下游引物5′-CCTTGCTGTACTGCGTG TCC-3′；GAPDH上游引物：5′-AACGGATTTGGTC GTATTG-3′,下游引物：5′-GGAAGATGGTGATGG GATT-3′。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡 在經(jīng)AMD3100處理和未處理的TAMs細胞中加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法測定總蛋白質(zhì)質(zhì)量。制備10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，取蛋白樣品等量上樣，通過電泳分離蛋白質(zhì)，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗人SDF-1抗體(1∶1000)，設(shè)內(nèi)參蛋白為GAPDH(1∶1000)，4℃下共同孵育過夜；次日，棄去一抗工作液，TBST洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST再次洗膜，ECL化學發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.3.5 共培養(yǎng)體系的建立與實驗分組 取對數(shù)生長期的LoVo細胞和經(jīng)不同處理的TAMs細胞，將LoVo細胞以5×104個的密度接種在Transwell小室的6孔板底部，將TAMs細胞以1×105個的密度接種在Transwell小室的上層，分別加入適量新鮮培養(yǎng)基，以建立LoVo細胞與TAMs細胞的共培養(yǎng)體系。實驗分組包括空白對照組、奧沙利鉑組(使用不同濃度0、0.5、5、50、500 μmol/L奧沙利鉑處理LoVo細胞48 h)，TAMs+奧沙利鉑組(LoVo細胞與TAMs細胞共培養(yǎng)，再用0、0.5、5、50、500 μmol/L奧沙利鉑處理LoVo細胞48 h)，AMD3100+TAMs+奧沙利鉑組(使用5 μg·mL-1SDF-1抑制劑AMD3100預先處理TAMs細胞24 h再與LoVo細胞共培養(yǎng)，之后使用0、0.5、5、50、500 μmol/L奧沙利鉑處理LoVo細胞48 h)。

1.3.6 CCK-8法 收集奧沙利鉑組、TAMs+奧沙利鉑組、AMD3100+TAMs+奧沙利鉑組LoVo細胞，根據(jù)CCK-8試劑盒分別檢測細胞增殖活性，各組設(shè)置6個復孔，在每個細胞孔中加入10 μL CCK-8試劑液，輕輕混勻，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，通過酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處各孔光密度值(OD值)。

1.3.7 動物移植瘤模型建立 取生長狀態(tài)良好的LoVo細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，吹打呈單細胞懸液，以4000 rpm/min離心10 min，棄上清，并用適量的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞懸液密度為1×107個/mL，取30只BALB/c裸鼠，并吸取0.5 mL的細胞懸液注射到裸鼠右側(cè)腋窩皮下，觀察注射部分移植瘤長出情況。待腫瘤長出，取12只腫瘤大小為100 mm3的模型裸鼠，將其根據(jù)隨機數(shù)字表法分為3組，包括對照組、奧沙利鉑組、AMD3100+奧沙利鉑組，每組4只，奧沙利鉑組腹腔注射8 mg/kg奧沙利鉑，AMD3100+奧沙利鉑組腹腔注射5 mg/kg SDF-1抑制劑AMD3100和8 mg/kg奧沙利鉑，對照組同時注射等體積生理鹽水，每日一次，持續(xù)18 d。首次給藥后，在第0、3、6、9、12、15、18 d使用游標卡尺測量各組裸鼠腫瘤塊的長徑和短徑，計算腫瘤體積V=1/2×腫瘤長徑×腫瘤短徑2。末次給藥后，脫頸椎處死各組裸鼠，解剖取其腫瘤組織并稱重，固定在10%福爾馬林溶液中備用。

1.3.8 不同亞型巨噬細胞分選 將裸鼠腫瘤組織切成大約1 mm3小塊，加入裂解液置于冰上孵育30 min，通過細胞裂解儀處理，再經(jīng)過濾、離心、重懸的步驟制備單細胞懸液。PBS洗滌細胞，調(diào)整細胞懸液密度為1×107個/mL，吸取90 μL移至無菌離心管中，加入10 μL eFluor 450抗鼠F4/80抗體，分選F4/80陽性細胞后，再次加入10 μL APC標記CD11c抗體和10 μL PE標記CD206抗體，進行二次分選。在F4/80陽性基礎(chǔ)上，CD11c陽性為M1型巨噬細胞，CD206陽性為M2型巨噬細胞，通過流式細胞儀進行分析。

1.3.9 免疫組織化學染色 取固定好的腫瘤組織制備常規(guī)石蠟切片，厚度為4 μm，切片置于烤箱高溫處理1 h后，脫蠟脫水，蒸餾水浸洗，使用檸檬酸鈉對切片進行抗原修復，滴加3%過氧化氫，室溫孵育10 min，PBS沖洗切片，滴加稀釋的10%山羊血清封閉45 min，清除切片周圍的液體，加入兔抗人iNOS(1∶100)抗體、兔抗人Arg-1抗體(1∶100)，4℃冰箱內(nèi)孵育過夜；次日，棄一抗工作液，PBS 沖洗切片，加入HRP的山羊抗兔IgG(1∶1000)，室溫孵育1 h。PBS再次沖洗切片，滴加DAB顯色液，流水沖洗，Harris蘇木素復染1 min，1%鹽酸酒精分化，自來水水洗返藍，再將切片進行程序化脫水、透明，置于通風櫥晾干，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞陽性表達，陽性表達為胞質(zhì)著色棕黃色至棕色，隨機選擇6個視野，計算目的蛋白的陽性表達率。

2 結(jié)果

2.1 TAMs細胞的鑒定 通過倒置顯微鏡觀察THP-1細胞形態(tài)變化，觀察到誘導前細胞形態(tài)為規(guī)則圓形，邊緣清晰，呈懸浮狀，未附著在培養(yǎng)皿底部；經(jīng)過PMA、PMA+IL-4誘導后細胞貼壁生長，細胞形態(tài)不規(guī)則，顆粒較大，為混合圓形或紡錘形，細胞突起較明顯，見圖1。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與誘導前細胞比較，PMA+IL-4誘導后的細胞中M1型巨噬細胞表面標記物CD86表達水平明顯減少，同時M2型巨噬細胞表面標志物CD206表達水平明顯增加，見圖2。

圖1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)(100×, 50 μm)

圖2 流式細胞術(shù)檢測誘導前后細胞中CD86和CD206表達

2.2 各組TAMs細胞中SDF-1表達比較 qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與未經(jīng)SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細胞比較，經(jīng)過SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細胞中SDF-1 mRNA相對表達量與蛋白相對表達量均顯著下調(diào)(P<0.01)，說明TAMs細胞中SDF-1表達受到抑制，見圖3。

圖3 TAMs細胞SDF-1表達檢測

2.3 各組TAMs細胞中iNOS、TNF-α、TGF-β及Arg-1表達比較 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與未經(jīng)SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細胞比較，經(jīng)過SDF-1抑制劑AMD3100處理的TAMs細胞中iNOS mRNA和TNF-α mRNA的相對表達量均顯著升高(P<0.01)，TGF-β mRNA和Arg-1 mRNA的相對表達量則顯著降低(P<0.01)，見圖4。

圖4 qRT-PCR檢測兩組TAMs細胞中iNOS、TNF-α、TGF-β及Arg-1表達

2.4 各組LoVo細胞化療敏感性比較 CCK-8檢測結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度(0.5、5、50、500 μmol/L)奧沙利鉑處理LoVo細胞后，細胞存活率較空白對照組(0 μmol/L)均顯著下降(P<0.01)，見圖5。經(jīng)不同濃度(0.5、5、50、500 μmol/L)奧沙利鉑處理后，CCK-8檢測結(jié)果顯示，與奧沙利鉑組比較，TAMs+奧沙利鉑組LoVo細胞存活率顯著升高(P<0.01)；與TAMs+奧沙利鉑組比較，AMD3100+TAMs+奧沙利鉑組LoVo細胞存活率顯著下降(P<0.01)，見表1。

表1 不同濃度奧沙利鉑對各處理組LoVo細胞存活率的影響

圖5 CCK-8檢測經(jīng)奧沙利鉑處理的LoVo細胞存活率

2.5 各組裸鼠腫瘤生長比較 裸鼠首次給藥后，在第6、9、12、15、18 d時經(jīng)過測量發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑組和AMD3100+奧沙利鉑組的裸鼠腫瘤體積均較對照組顯著下降(P<0.01)，且在第12、15、18 d時，相較于奧沙利鉑組，AMD3100+奧沙利鉑組的裸鼠腫瘤體積進一步下降(P<0.01)，見圖6A；在18 d后取各組裸鼠腫瘤組織，可見奧沙利鉑組和AMD3100+奧沙利鉑組裸鼠的腫瘤塊和重量均小于對照組(P<0.01)，同時AMD3100+奧沙利鉑組較奧沙利鉑組也顯著減小(P<0.01)，見圖6B、C。

圖6 各組裸鼠腫瘤生長情況

2.6 各組裸鼠腫瘤組織中M1、M2 亞型巨噬細胞比例比較 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，AMD3100+奧沙利鉑組裸鼠腫瘤組織中M1亞型巨噬細胞標記物F4/80+CD11c+表達顯著增加(P<0.01)，M2亞型巨噬細胞標記物F4/80+CD206+表達顯著減少(P<0.01)，而奧沙利鉑組較對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖7。

圖7 流式細胞術(shù)檢測腫瘤組織M1、M2 亞型巨噬細胞比例

2.7 各組裸鼠腫瘤組織中iNOS和Arg-1表達比較 免疫組織化學染色檢測結(jié)果顯示，AMD3100+奧沙利鉑組裸鼠腫瘤組織中iNOS陽性表達率較對照組顯著升高(P<0.01)，Arg-1陽性表達率較對照組顯著下降(P<0.01)，而奧沙利鉑組和對照組的腫瘤組織中iNOS陽性表達率和Arg-1陽性表達率之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖8。

圖8 免疫組織化學染色檢測腫瘤組織中iNOS和Arg-1表達(100×)

3 討論

CRC全球每年約有136萬例新增病例，是導致人類癌癥死亡的主要原因之一，嚴重威脅著人類的健康[2]。目前，手術(shù)切除仍是CRC治療最有效的方法，但化學療法也是術(shù)后輔助治療和轉(zhuǎn)移性癌癥治療中不可缺少的。而在化學藥物治療過程中產(chǎn)生的副作用，包括神經(jīng)毒性和胃腸道毒性，會顯著影響患者的生活質(zhì)量[8]。另外，許多患者在化學藥物治療過程中表現(xiàn)出了明顯的耐藥性。因此，迫切需要探索新策略以增強腫瘤細胞的化療敏感性。

奧沙利鉑屬于第三代鉑化合物，能夠誘導癌細胞中鏈內(nèi)鳥嘌呤-鳥嘌呤和鳥嘌呤-腺嘌呤DNA連接的形成，以DNA為作用的靶部位，使鉑離子與DNA鏈交聯(lián)以阻斷其轉(zhuǎn)錄復制過程，從而誘導癌細胞死亡[9]。如今，基于奧沙利鉑的化學療法被認為是CRC的一線治療方法，此外，也用于其他癌癥的治療當中，如胃癌和胰腺癌[10-11]。然而，單獨或聯(lián)合使用奧沙利鉑治療中獲得性耐藥的產(chǎn)生會導致治療失敗，并且?guī)缀跛修D(zhuǎn)移性CRC最終都會產(chǎn)生耐藥性，因此，探究提高CRC治療中腫瘤細胞對奧沙利鉑的敏感性具有重要意義。

目前，關(guān)于CRC細胞中奧沙利鉑抗藥性產(chǎn)生的分子機制尚未完全闡明，必須要更好地了解耐藥性產(chǎn)生中相關(guān)分子機制以開發(fā)提高CRC細胞化療敏感性的有效治療方法。SDF-1的生物學效應(yīng)與其觸發(fā)的趨化反應(yīng)、細胞增殖、細胞轉(zhuǎn)移以及基質(zhì)金屬蛋白酶和血管生成因子分泌的能力有關(guān)[12]。越來越多的研究表明，SDF-1及其受體的相互作用可激發(fā)下游信號傳導途徑，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤血管生成和化學抗性中發(fā)揮作用[13]。SDF-1/CXCR4相互作用使CXCR4磷酸化，促進鈣通量，并直接激活MAPK、PI3K、Wnt和Sonic-Hedgehog信號通路，從而誘導各種類型腫瘤細胞的增殖[14]。此外，SDF-1在膀胱癌、胃癌、肝細胞癌、前列腺癌中均高水平表達[15-16]，由此可見，SDF-1及其受體可能是癌癥治療的潛在靶標。本研究通過體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，使用SDF-1抑制劑AMD3100可提高結(jié)直腸癌對奧沙利鉑的敏感性，從而抑制了腫瘤生長。

腫瘤微環(huán)境在癌癥生物學的各個方面都具有關(guān)鍵作用，包括生長、轉(zhuǎn)移、血管生成和進展等。趨化因子及其受體最初被確定為炎性疾病的介體，但隨著研究的不斷深入，人們?nèi)找嬲J識到趨化因子及其受體是腫瘤細胞和基質(zhì)細胞之間的關(guān)鍵溝通橋梁，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了一個寬松的微環(huán)境。因此，一種關(guān)鍵的癌癥治療策略可能打破這種交流通道以破壞腫瘤進展。目前，在腫瘤微環(huán)境中靶向SDF-1及其受體的外源性分子與傳統(tǒng)化學療法相結(jié)合的研究已引起越來越多的關(guān)注。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)是腫瘤微環(huán)境中主要成分之一，在腫瘤間質(zhì)中浸潤，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，在腫瘤微環(huán)境中靶向調(diào)控TAMs已成為癌癥免疫療法的一項新策略，并且可以與傳統(tǒng)療法包括化學療法和放射療法結(jié)合使用以發(fā)揮協(xié)同治療作用，使腫瘤患者獲得更好的治療效果[17]。通常情況下巨噬細胞分為M1型和M2型，其中M1型巨噬細胞能夠產(chǎn)生促炎性細胞因子，具有促炎和抗腫瘤特性；M2型巨噬細胞能夠分泌抗炎性細胞因子，發(fā)揮抗炎和促腫瘤作用[18-19]。隨著腫瘤細胞的不斷發(fā)展，巨噬細胞逐漸趨向于M2型，促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展[20]。越來越多的證據(jù)表明，逆轉(zhuǎn)巨噬細胞從M1型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型可能會通過抑制細胞增殖與轉(zhuǎn)移、藥物依賴和免疫逃逸來阻止癌癥的發(fā)生和發(fā)展[21]。本研究中使用SDF-1抑制劑AMD3100作用TAMs后，M1型巨噬細胞相關(guān)標記物iNOS、TNF-α的表達升高，M2型巨噬細胞相關(guān)標記物TGF-β、Arg-1的表達則降低，表明SDF-1抑制劑AMD3100調(diào)控了TAMs亞型轉(zhuǎn)化。此外，經(jīng)過SDF-1抑制劑AMD3100作用結(jié)直腸癌移植瘤裸鼠后，腫瘤組織中M1亞型巨噬細胞標記物F4/80+CD11c+表達增加，iNOS陽性表達率升高，M2亞型巨噬細胞標記物F4/80+CD206+表達減少，Arg-1陽性表達率下降，這進一步從體內(nèi)證明了靶向SDF-1調(diào)控TAMs亞型轉(zhuǎn)化從而增強了結(jié)直腸癌對奧沙利鉑的敏感性。

4 結(jié)論

靶向SDF-1能夠提高結(jié)直腸癌腫瘤細胞對奧沙利鉑的敏感性，起到協(xié)同抑制腫瘤生長的作用，其機制可能與誘導結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)巨噬細胞的亞型轉(zhuǎn)化相關(guān)。本研究為結(jié)直腸癌的免疫治療提高了一種新思路，為針對SDF-1及其下游信號通路的免疫治療提供了理論依據(jù)。