劉芳 王布 張長洪 鄒芳 郭志青 宋宇烜 劉建華

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院 1.呼吸與危重癥醫(yī)學科;2.RICU,河北 張家口 075000)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是臨床醫(yī)生面臨的一個重大挑戰(zhàn)[1]，它是一種急性進行性肺功能不全或呼吸衰竭，由肺部各種內外因素引起，死亡率高達40%[2]。此外，由于肺泡屏障通透性增加，以肺泡上皮和毛細血管內皮為特征的快速肺泡損傷導致空氣水腫和炎癥[3-4]，也是ALI發(fā)展的重要因素。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的肺損傷模型已廣泛應用于肺損傷的研究。ALI沒有特定的治療方案，目前，輔助通氣和藥物治療是主要的臨床應用方法[5]。因此，開發(fā)新的有效策略對于臨床治療ALI具有重要意義。C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白3(CTRP3)是一種新型的脂肪因子，屬于脂聯素分支蛋白中高度保守的CTRP超家族[6]。它主要在脂肪組織中表達，也在心臟和肝臟中發(fā)現[7]。以往研究表明，CTRP3是LPS的內源性拮抗劑[8]，CTRP3的異常表達與多種類型的人類疾病有關，如關節(jié)炎[9]和心肌功能障礙[6]等。盡管如此，CTRP3在ALI中的生物學作用和潛在的分子機制仍不清楚。本研究旨在確定CTRP3對LPS誘導的ALI小鼠中的作用，并闡明潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 慢病毒CTRP3(LV-CTRP3)和(LV-NC)載體購自上海吉瑪公司；ELISA試劑盒購自美國Millipore公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)購自南京建成生物公司；抗體購自美國CST公司。

1.2 實驗動物 40只雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡，20～24 g)購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2018-004。所有小鼠飼養(yǎng)在(22±2)℃和50%濕度的塑料籠中，在12 h的光/暗循環(huán)中自由獲取食物和水。本研究通過醫(yī)院動物倫理委員會審核批準。

1.3 動物模型及分組 氣管內滴注LPS建立ALI小鼠模型[4]，隨機分為對照組、LPS組、LPS+LV-NC(2 mg/kg)組、LPS+LV-CTRP3(2 mg/kg)4組，每組各10只。LPS組小鼠氣管內滴注3 mg/kg LPS建立ALI模型。同時，對照組小鼠氣管內滴注等量生理鹽。LPS+LV-CTRP3組小鼠靜脈注射LV-CTRP3慢病毒(2×107轉導單位/mL)，LPS+LV-NC組小鼠靜脈注射等量LV-NC慢病毒。LPS處理前，LPS+LV-NC組和LPS+LV-CTRP3組每天注射一次，連續(xù)3 d。LPS誘導48 h后人道處死小鼠。打開胸腔，右肺用0.9%生理鹽水灌洗。收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，并使用冷卻離心機(4000 rpm)在4℃下離心15 min。BALF上清液儲存在-80℃下，直至進一步分析。稱量一小塊左肺，用冰冷的生理鹽水沖洗，然后在10%中性福爾馬林液中固定，并用于后續(xù)實驗分析。

1.4 qRT-PCR實驗 使用TRIzol試劑(大連寶生物公司)從肺組織中提取總RNA，并根據照制造商的說明，將其反向轉錄為互補DNA(cDNA)。使用SYBRP remix Ex TaqTM試劑盒(日本Takara公司)進行對其qRT-PCR 檢測。使用2-△△Ct方法分析其mRNA表達量。CTRP3正向引物 5′-ATGGAGGTG AGCAGAAGAGC-3′，CTRP3反向引物5′-CACAGT CCCCGTTTTAGCAT-3′；β-actin正向引物 5′-GATC ATTGCTCCTCCTGAG-3′，β-actin反向引物5′-ACT CCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

1.5 蘇木精-伊紅(H&E)染色 新鮮肺標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，然后進行5 μm切片。按照標準程序[10]對肺組織的石蠟切片進行H&E染色以進行組織學檢查。在光學顯微鏡下隨機拍攝圖像，并由兩位經驗豐富的病理學家雙盲評估。

1.6 肺濕/干比測量 分離小鼠右肺并稱重作為濕重，然后在80℃下干燥48 h并測量其干重。濕/干比作為肺水腫的指標。

1.7 ELISA試驗 根據制造商的方案,使用ELISA試劑盒評估TNF -α, IL-6 和 IL-1β在BALF樣本中表達。

1.8 SOD,CAT,GSH-Px和MDA測定 切除小鼠肺組織并制備勻漿液。按照制造商說明，使用診斷試劑盒測定上清液中SOD、CAT、GSH-PX和MDA的含量。

1.9 免疫組織化學(IHC)肺組織的石蠟切片在脫石蠟和再水化之后，用檸檬酸修復抗原，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。然后，孵育特異性一抗(抗SIRT1和抗p-NF-κB p65)4℃過夜。PBS洗滌3次后，將切片與二抗結合在37℃下孵育1 h，用二氨基聯苯胺(DAB)對載玻片進行染色。IHC陽性結果以棕色表示，使用Image Pro Plus 6.0軟件計算平均光密度(AOD)。

1.10 Western Blot用RIPA裂解 緩沖液在4℃下提取肺肌組織總蛋白，使用BCA試劑盒(北京碧云天公司)測定蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE) 對目標蛋白進行電泳，然后轉移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，用稀釋的一抗SIRT1、磷酸化p65、p65和乙?；痯53于 4 ℃環(huán)境中孵育過夜。用TBST洗滌3次后，與辣根過氧化物酶結合的二抗在室溫下孵育1 h，并用ECL化學發(fā)光試劑顯示信號。β-actin用作內參對照。

2 結果

2.1 CTRP3在LPS誘導的ALI小鼠肺中下調 本研究構建了LPS誘導的小鼠肺損傷模型，48 h后收集小鼠肺組織進行HE染色。與對照組相比，LPS組肺泡外膜增厚、出血和肺水腫。此外，與對照組相比，ALI小鼠肺組織中CTRP3的表達顯著下調(P<0.05)。見圖1。

圖1 CTRP3在ALI小鼠中下調

2.2 CTRP3過表達 減弱LPS誘導的肺損傷為了證實提高體內CTRP3的表達是否可以緩解小鼠ALI過程，本研究通過尾靜脈注射攜帶CTRP3基因的慢病毒載體(LV-CTRP3)。與LPS組相比，CTRP3的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)。此外，與LPS組相比，ALI小鼠肺泡外膜增厚、出血和肺水腫顯著減輕。與對照組相比，LPS組肺損傷評分和肺含水量明顯增加 (P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過表達顯著降低肺損傷評分和肺濕干比(P<0.05)。見圖2。

圖2 CTRP3過表達對肺組織損傷的影響

2.3 CTRP3過表達 緩解LPS誘導的炎癥反應與對照組相比，LPS顯著增加BALF中的總炎癥細胞和中性粒細胞計數(P<0.05)，顯著提高肺組織MPO活性(P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過表達顯著抑制LPS誘導的總炎癥細胞和中性粒細胞計數的增加(P<0.05)，顯著抑制LPS誘導的MPO活性(P<0.05)。與對照組相比，ALI小鼠BALF中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高 (P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過表達顯著降低ALI小鼠BALF中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平 (P<0.05)，表明CTRP3過表達緩解了ALI小鼠中的炎癥反應。見圖3。

圖3 CTRP3過表達對ALI小鼠炎癥反應的影響

2.4 CTRP3過表達 減少LPS誘導的氧化應激與對照組相比，LPS組的MDA含量顯著增加，SOD、CAT 和 GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過表達顯著逆轉了氧化參數的變化(P<0.05)，表明CTRP3過表達可減少ALI小鼠中的氧化應激。見圖4。

圖4 CTRP3過表達對ALI小鼠氧化應激的影響

2.5 CTRP3通過SIRT1在體內調節(jié)p53/NF-κB信號通路 與LPS組相比，CTRP3過表達顯著增加SIRT1陽性細胞，減少p-p65陽性細胞數。Western blot分析用于評估CTRP3對LPS誘導的ALI小鼠肺中SIRT1表達、NF-κB p65磷酸化和p53乙?；挠绊憽ＥcLPS組相比，CTRP3過表達消除了LPS對ALI小鼠肺組織中SIRT1蛋白表達的抑制作用(P<0.05)。此外，CTRP3過表達還逆轉了LPS對ALI小鼠肺NF-κB p65磷酸化和p53乙?；拇龠M作用(P<0.05)，結果表明CTRP3可以在體內調節(jié)SIRT1介導的NF-κB和p53信號通路。見圖5。

3 討論

ALI是呼吸系統(tǒng)的一種嚴重疾病。炎癥反應失衡、肺泡通透性增加以及上皮細胞和血管內皮細胞破壞引起的凝血通路異常激活是ALI發(fā)病機制的主要特征[11]。ALI的病因多樣，發(fā)病機制復雜，因此深入了解ALI的發(fā)生、發(fā)展和調節(jié)機制至關重要。由于體內研究肺部病理變化的局限性，動物模型是研究ALI的最佳選擇[12]。因此，本研究采用LPS誘導ALI。注射LPS后，小鼠出現明顯的肺損傷，表明ALI模型已誘導成功。

圖5 CTRP3對小鼠肺中p53/NF-κB通路的影響

LPS誘導的ALI可導致肺水腫，肺組織體積和重量增加，這是急性肺損傷的主要特征之一。計算肺組織的W/D值，客觀評價肺水腫的程度，W/D值越高，肺水腫越嚴重。促炎細胞因子，如TNF-α和IL-1β，增加肺上皮的通透性，進而誘導肺組織損傷和中性粒細胞的聚集，導致肺水腫[1]。IL-6在患者的BALF中增加，并且更高水平會增加死亡率。此外，在LPS誘導的ALI中，大量的中性粒細胞向肺組織內轉移并參與炎癥反應。MPO活性是ALI的一個敏感和特異的標記物，用于評估組織中中性粒細胞積聚的量化[13]。本研究中，與LPS組相比，CTRP3過表達顯著減少BALF中的中性粒細胞數和肺組織中的MPO活性，抑制BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。這些結果表明，CTRP3過表達可以抑制中性粒細胞向肺組織的遷移，從而減輕肺組織的炎癥損傷。

活性氧(ROS)可以作為信號分子參與細胞分裂、凋亡和免疫應答等過程[14]。通過相關酶去除多余的ROS，維持機體相對穩(wěn)定的狀態(tài)。發(fā)生氧化應激反應時，抗氧化劑(SOD、CAT和GSH-Px)會大量消耗[15]，以清除體內的ROS。SOD是體內唯一能清除O2-的酶[16]，在CAT和GSH-Px的作用下繼續(xù)生成H2O，并從體內排出，從而消除ROS，保護身體免受氧化攻擊。MDA是脂質過氧化的產物[17]，通常用來反映氧化應激水平。本研究中，CTRP3在LPS誘導的小鼠ALI模型中具有良好的抗氧化活性，CTRP3過表達顯著抑制小鼠肺組織MDA的生成，提高SOD、CAT和GSH-Px的含量。

SIRT1是多種細胞和機體過程的調節(jié)劑，包括新陳代謝，免疫應答和衰老[18]。SIRT1可能通過調節(jié)下游信號通路發(fā)揮其功能[19]。研究發(fā)現CTRP3可以通過激活SIRT1來減輕器官損傷[20]。本研究中，與正常對照組小鼠相比，LPS誘導的ALI小鼠肺組織中SIRT1表達顯著下調。為了更好地闡明CTRP3/SIRT1軸保護作用的分子機制，我們評估NF-κB通路和p53通路。NF-κB途徑的激活與炎癥過程密切相關[21]。p53乙?；徽J為有助于組織和器官損傷的發(fā)生[22]。在本研究中，與正常對照組小鼠相比，LPS誘導的ALI小鼠的肺中p65磷酸化水平和p53乙?；斤@著增加。CTRP3過表達通過調節(jié)SIRT1介導的NF-κB途徑和p53途徑減輕ALI小鼠的肺損傷。這些結果表明，CTRP3通過SIRT1/NFκB/p53軸對小鼠ALI發(fā)揮保護作用。

4 結論

綜上所述，本研究揭示了CTRP3對LPS誘導的小鼠ALI的保護作用。此外，CTRP3可通過調節(jié)SIRT1介導的p53/NF-κB信號通路發(fā)揮保護作用。這為理解ALI發(fā)展的分子機制提供了新的見解，表明CTRP3/SIRT1/NF-κB/p53軸可能是ALI患者的一個有希望的治療靶點。