李少華

武夷學(xué)院康復(fù)治療系

馬健錦

福州市市場監(jiān)管監(jiān)測服務(wù)中心

范世明*

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院

梔子主產(chǎn)于我國南部地區(qū)，目前全國栽培面積約1.7 萬公頃[1]，尤以江西、福建等省所產(chǎn)量大質(zhì)優(yōu)，為道地產(chǎn)區(qū)[2]。作為常用中藥材，其質(zhì)量與臨床療效及用藥安全息息相關(guān)。傳統(tǒng)上梔子以“皮薄、飽滿、色紅黃者” 為優(yōu)[2-3]，主要以外部特征對梔子品質(zhì)進(jìn)行評判，具有簡便高效的特點，但主觀性較強(qiáng)，且不能準(zhǔn)確說明中藥材的品質(zhì)。因此，當(dāng)代梔子質(zhì)量研究除強(qiáng)調(diào)傳統(tǒng)的性狀鑒別外，更加強(qiáng)了對梔子特征性活性成分的研究[3-6]。

近年來研究表明不同產(chǎn)地、不同采收時間、不同用藥部位、不同炮制工藝等影響梔子品質(zhì)關(guān)鍵因素與化學(xué)成分差異間具有較大的關(guān)聯(lián)度。如田瑞華等[3]采用高效液相色譜特征圖譜法，對江西、福建等3 個產(chǎn)區(qū)的梔子進(jìn)行分析，各產(chǎn)區(qū)梔子中的環(huán)烯醚萜類成分無明顯差異，藏紅花素成分、酚酸類成分質(zhì)量表征差異較大。王雨婷等[7]采用高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法對安徽、江西等5個產(chǎn)區(qū)的梔子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)江西產(chǎn)區(qū)梔子的京尼平龍膽雙糖苷、京尼平苷酸、綠原酸等成分含量具有優(yōu)勢。羅靜玲等[8]對不同成熟期梔子果中梔子苷等4 種活性成分進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)不同成熟期西紅花苷Ⅰ及梔子酸含量差異顯著。付小梅等[9]通過檢測不同采收期梔子中 8 種成分的含量，發(fā)現(xiàn)4 個環(huán)烯醚萜類成分及綠原酸均隨著果實的成熟呈緩慢下降的趨勢，3 個西紅花苷隨著果實的成熟呈急劇上升，西紅花苷Ⅰ與梔子顏色及成熟度呈強(qiáng)相關(guān)性。此外雷磊、楚越等[10-11]研究認(rèn)為炮制工藝對梔子化學(xué)成分改變有較大影響。

上述研究的基礎(chǔ)均是建立在可靠穩(wěn)定的梔子有效成分含量分析方法之上。目前文獻(xiàn)報道梔子活性成分主要包括環(huán)烯醚萜、藏紅花素、酚酸及黃酮等四類成分，但當(dāng)前報道的高效液相色譜含量測定方法主要關(guān)注環(huán)烯醚萜類、藏紅花素類及酚酸類成分[3,7-9]，黃酮類成分報道較少，為更加全面客觀評價梔子質(zhì)量，本文建立了同時測定梔子中環(huán)烯醚萜、藏紅花素、酚酸及黃酮等四類13 種活性成分液相分析方法，以期為梔子質(zhì)量研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀配DAD 檢測器（美國安捷倫公 司）、SQP SECURA2250-1CN 十萬分之一分析天平(德國Sartorius 公 司)、Milli-Q 純 水機(jī)（美國Millipore 公司）、DS-8510 DTH 超聲波清洗器(上海生析超聲儀器有限公司）、TGL-16B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、移液槍（德國艾本德公司），上述儀器均經(jīng)福建省計量科學(xué)研究院校準(zhǔn)。

1.2 對照品

梔 子 苷（ 批 號：Z-003-180222，純度：＞98%）、京尼平苷 酸（ 批 號：J-015-170504，純度：＞98%）、西紅花苷Ⅰ（批號：X-002-171228，純度：＞98%）、西 紅 花 苷Ⅱ（ 批 號：X-003-180731，純度：＞98%）、藏紅花酸（批號：Z-052-180426，純度：＞98%）、石吊蘭素（批號：S-028-181216，純度：＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；綠原酸（批號：L-007-181112，純度：＞98%）、新綠原酸（批號：X-014-180410，純度：＞98%）、隱綠原酸（批號：Y-067-180425，純度：＞98%）購自成都曼思特生物科技有限公司。山梔苷（批號：PF220520-12，純度：＞98%）、京尼平龍膽雙糖苷（批號：PS220103-16，純度：＞98%）購自美國Stanford Chemicals 公 司；蘆?。ㄅ枺篋RE-6880000，純度：94.56%） 購 自 德 國Dr.Ehrenstorfer 公司；槲皮素（批號：100081-201610， 純 度：99.1%）購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 試劑與樣品

乙腈（色譜純）；無水乙醇（色譜純）；甲醇（色譜純）；水為超純水。梔子樣品購于福建省福州市各零售藥店及安徽省亳州市藥材批發(fā)市場，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明正高級實驗師鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果實，詳細(xì)信息見表1。

表1 梔子樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備

分別精密稱取上述13 種對照品約10mg，置于10ml 容量瓶中，用75%甲醇溶解至刻度（蘆丁常溫下在甲醇中溶解度不如乙醇，該標(biāo)樣使用乙醇溶解），得濃度為1mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液（梔子苷為10mg/ml）；分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，加入10ml 容量瓶中以75%甲醇定容，制成約20μg/ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

2.1.2 供試品溶液制備

精密稱取梔子粉末（過五號篩）0.4g，置25ml 容量瓶中，加入75%甲醇溶液適量，振搖后超聲處理60min，放冷至室溫后再定容，搖勻后吸取適量混懸液離心4min（10000rpm），取上清液經(jīng)0.22μm 有機(jī)濾頭濾過，即得。

2.2 色譜條件

以0.1 % 磷酸水溶液為流動相A 相，乙腈為流動相B 相，梯度洗脫，梯度洗脫程序：0min，95%A ；0～8min，95% → 91%A ；8～16min，91% →82%A ；16～24min，82% →72%A ；24～32min，72% →64%A ；32～48min，64% →40%A ；48～53min，40% →10%A ；53～57min，10%A；57～60min，10%→95%A；后運行6min。色譜柱為中譜科技RD-C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流 速 為1ml/min；柱溫為30℃；檢測波長：藏紅花酸為230nm，梔子苷、山梔苷、京尼平苷酸、京尼平龍膽雙糖苷為237nm，蘆丁、槲皮素為256nm，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、石吊蘭素為330nm，西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ為440nm；進(jìn)樣體積10μl，各成分分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 梔子液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性考察

用75%甲醇將混標(biāo)液稀釋成0.1～20μg/ml 系列混標(biāo)工作液（梔子苷1～2111.6μg/ml、京尼平龍膽雙糖苷0.1～385μg/ml、山梔苷0.1～140μg/ml、西紅花苷Ⅰ0.1～149μg/ml、石吊蘭素0.05～20μg/ml），詳見表2。以混標(biāo)溶液中13 個成分實際濃度為橫坐標(biāo)，檢出峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸擬合，由R2可知，各成分在線性范圍內(nèi)濃度與峰面積相關(guān)性良好。

表2 四類13 種活性成分線性范圍、線性回歸方程、R2

2.3.2 精密度

將供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣8次，以峰面積分別計算各組分RSD 值分別為0.59%～3.61%，說明本方法精密度良好，結(jié)果詳見表3。

2.3.3 穩(wěn)定性

將供試品溶液，室溫下分別于 0，2，4，8，12，18，24h進(jìn)樣測定。以峰面積分別計算24h 各組分穩(wěn)定性，RSD 值介于1.19%～3.62%，說明樣品溶液24h 內(nèi)較為穩(wěn)定，結(jié)果詳見表3。

2.3.4 重復(fù)性

按“2.1.2” 項 下 方 法，連續(xù)制備8 份梔子供試品溶液，各組分平均含量分別為3.71～55412.17μg/g，RSD 分別為0.41%～2.87%（見表3），表明方法重現(xiàn)性較好。

2.3.5 加標(biāo)回收率

取供試品6 份，每份0.2g，精 密 稱 定， 參 照“2.3.3” 項下梔子含量，精密加入梔子苷等四類13 種對照品適量，按“2.1.2” 項 下 方 法 制 備， 測定。各成分平均加標(biāo)回收率在95.27%～104.61% 之 間，RSD在0.59%～3.65%之間，詳細(xì)結(jié)果見表 3。

表3 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性表加標(biāo)回收率（n=6）

2.4 樣品測定

對收集的21 批次樣品粉末，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按本方法中色譜條件進(jìn)行檢測，計算樣品中13 個活性成分的含量，結(jié)果表明：環(huán)烯醚萜類含量＞藏紅花素類含量＞酚酸類含量＞黃酮類含量，以環(huán)烯醚萜類梔子苷含量最高，其次為藏紅花素類西紅花苷Ⅰ，測定結(jié)果詳見表4。通過分析以上數(shù)據(jù)可知，該方法可應(yīng)用于梔子中四類13 種活性成分的分析檢測。

表4 梔子樣品中各成分含量測定結(jié)果（n=3，μg/g）

3 討論

3.1 樣品溶液制備

考慮研究中多組分極性差異較大，本研究比較了不同濃度的甲醇與乙醇的提取效果，在相同條件下，使用75%乙醇作為溶劑提取上述成分時，山梔苷約53%，新綠原酸約68%，隱綠原酸約82%，但梔子苷、槲皮素提取率可達(dá)104%、120%，而75% 甲醇各成分提取率在90%～110% 之間，較為均衡，最終選擇以75%甲醇作為提取溶劑。同時，比較了不同超聲時間對提取的影響，超聲60min 比30min 提取率均有不同程度提高，且重復(fù)性實驗RSD 更低，此外，超聲過程中應(yīng)注意控制水溫，盡量不超過60℃以免成分損失。

3.2 對照品溶液的保存

實驗中發(fā)現(xiàn)隱綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ等對照品溶液即使在冷藏狀態(tài)下，72 小時后仍會逐漸分解，隱綠原酸會逐漸轉(zhuǎn)為新綠原酸及微量綠原酸；西紅花苷轉(zhuǎn)換成分未知。因此，上述成分對照品溶液建議即配即用，不可長期保存使用。

3.3 流動相的選擇

本實驗比較了甲醇-0.1%甲酸，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.1%磷酸為流動相，由于檢測成分基質(zhì)較為復(fù)雜，采用了梯度洗脫，實驗中含量0.1%的甲酸或磷酸水溶液均可以作為流動相對成分進(jìn)行分離，但甲酸水溶液在梯度比例急速增大時，基線產(chǎn)生劇烈波動，不如磷酸穩(wěn)定?？紤]乙腈末端吸收波長較優(yōu)于甲醇，因此，選擇以乙腈-0.1%磷酸體系為流動相，并進(jìn)一步優(yōu)化流動梯度，可使得目標(biāo)組分基線分離，且分離效果良好。

3.4 波長的選擇

通過查閱參考文獻(xiàn)報道及實驗確證（圖1）環(huán)烯醚萜類（梔子苷、山梔苷、京尼平苷酸、京尼平龍膽雙糖苷）波長確定為237nm，酚酸類（綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸）波長確定為330nm；西紅花素類（西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ）波長確定為440nm，黃酮類（蘆丁、槲皮素）波長確定為256nm。本研究中藏紅花酸在230nm 吸收度最大；石吊蘭素在280nm、330nm 均有較大吸收，因此將其與酚酸類共用330nm。