韓 琦，楊煥民，李士澤，張 旭，逯靜靜，徐 彬

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

越來越多的研究證據(jù)表明，環(huán)境的異常變化對機(jī)體有著較大的影響，會影響代謝、呼吸、血液循環(huán)，還會增加死亡率。寒冷作為北方常見的應(yīng)激原，是制約畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。長期暴露在冷環(huán)境中，會引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)。冷應(yīng)激會降低動物機(jī)體的抵抗力，增加患病的風(fēng)險。因此探明冷應(yīng)激對機(jī)體功能的影響，對闡明冷應(yīng)激的機(jī)理以及防止寒冷傷害具有重要意義。

腎臟作為人體泌尿系統(tǒng)中最重要的器官，在血液循環(huán)中，承擔(dān)著濾過代謝廢物并排出體外及重吸收各種營養(yǎng)物質(zhì)的重要使命。有研究表明低溫會損傷腎小管上皮細(xì)胞[1]，導(dǎo)致腎功能下降，進(jìn)而造成腎臟的損傷。有文獻(xiàn)指出，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)會參與腎臟損傷的過程[2]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種多用途的細(xì)胞器，存在于大多數(shù)細(xì)胞中，其主要功能之一是對新生成蛋白的翻譯后折疊和對錯誤折疊蛋白的再加工[3]。ER功能易受外界環(huán)境變化影響，如氧氣供應(yīng)不足等會破壞ER腔內(nèi)穩(wěn)態(tài)，引起ER功能損傷，導(dǎo)致未折疊及錯誤折疊蛋白的堆積，誘發(fā)ERS[4-7]。細(xì)胞為了降解ER中堆積的未折疊蛋白會啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unsaturated polyester resins,UPR)。研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞通過3種不同的機(jī)制處理UPR，第1種是增強(qiáng)對未折疊蛋白的折疊；第2種是降低對蛋白質(zhì)的翻譯；第3種是通過ER的降解作用降解未折疊和錯誤折疊蛋白[8]。UPR具有雙重性，短暫的ERS作用下UPR能夠幫助細(xì)胞回歸穩(wěn)定狀態(tài)，但在嚴(yán)重和持久的ERS條件下，因UPR的適應(yīng)性不能消除堆積的未折疊蛋白，ER功能恢復(fù)正常狀態(tài)而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生的其他機(jī)制[9]。綜上，本試驗旨在探究冷暴露對腎臟造成損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物5周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠(體質(zhì)量為22～24 g)，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。在人工智能氣候室中：(24±2)℃，40%相對濕度下，明/暗：12 h/12 h，小鼠自由飲水進(jìn)食。

1.2 試驗方法將5周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為室溫對照組和冷暴露組。室溫對照小鼠于(24±2)℃環(huán)境中飼養(yǎng)。冷暴露組小鼠在早上8點(diǎn)到晚上8點(diǎn)之間隨機(jī)在4℃環(huán)境中刺激3 h，共刺激3周。

1.3 主要儀器人工智能氣候室(濟(jì)南旭邦電子科技有限公司)、酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、電泳儀、電泳槽(BIO-RAD，美國)、化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)、球磨儀(弗爾德儀器設(shè)備有限公司)。

1.4 主要試劑BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗；P-eiF2α、eiF2α、XBP1、GRP78、Chop、LC3、P62、Beclin1、ATG7一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.5 q-PCR檢測腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)向腎臟組織中加入1 mL TRIzol 進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.6 HE染色取小鼠腎臟組織，用4%的多聚甲醛固定，包埋，切片，二甲苯脫蠟，水化，蘇木精染色，分化，伊紅染色，脫水，封片，最后用顯微鏡觀察。

1.7 對小鼠腎臟ERS和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測剪取腎臟組織樣本，提取總蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒測定樣品蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度，樣品按統(tǒng)一濃度用RIPA稀釋，加入Buffer混勻，煮沸7 min。蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，4℃孵育一抗，室溫孵育二抗。最后用Image Lab軟件對蛋白灰度進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)與對照組相比，冷暴露組小鼠腎臟組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)顯著升高(圖1)。

***. P<0.001； **.P<0.01。下同

2.2 慢性冷暴露后小鼠腎臟的病理學(xué)變化HE染色結(jié)果可觀察到與對照組相比，冷暴露組小鼠腎臟組織中炎癥細(xì)胞增多，腎小管上皮細(xì)胞可見變性壞死(圖2)。

A.對照組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)； B.冷暴露組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)

2.3 慢性冷暴露對小鼠腎臟ERS的影響蛋白質(zhì)免疫印跡試驗結(jié)果表明，與對照組相比慢性冷暴露組內(nèi)小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(p-eiF2α、eiF2α、CHOP、XBP1、GRP78)蛋白的表達(dá)水平升高(圖3)。

A.Western blot；B.p-eiF2α/eiF2α比值;C.XBP1相對表達(dá)水平;D.GRP78相對表達(dá)水平;E.CHOP相對表達(dá)水平

2.4 慢性冷暴露對小鼠腎臟自噬的影響蛋白質(zhì)免疫印跡試驗結(jié)果表明，與對照組相比慢性冷暴露組小鼠腎臟自噬相關(guān)蛋白(ATG7、Beclin1、LC3、P62)蛋白的表達(dá)水平升高(圖4)。

A.Western blot；B.ATG7相對表達(dá)水平;C.Beclin1相對表達(dá)水平;D.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值;E.P62相對表達(dá)水平

3 討論

在北方高寒地區(qū)，低溫環(huán)境對畜禽養(yǎng)殖造成了很大的影響。徐晶等[10]研究發(fā)現(xiàn)急性冷暴露會影響仔豬腎臟的功能。本課題組前期試驗猜測冷暴露對小鼠腎臟功能也會有影響。于是本試驗對腎臟相關(guān)的血液生化指標(biāo)尿素、肌酐及尿酐比的水平進(jìn)行了檢測。肌酐水平可以反映出腎小球濾過功能受損的程度[11]。試驗結(jié)果顯示與對照組相比，冷暴露組小鼠肌酐水平升高，這提示冷暴露可能影響腎臟的功能，與本研究猜想相符合。

腎臟是機(jī)體一個重要的器官，其可以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物并重吸收有用的物質(zhì)。葉翠[12]研究發(fā)現(xiàn)腎小球濾過功能受損會導(dǎo)致腎病的發(fā)生。根據(jù)組織學(xué)和q-PCR結(jié)果顯示，冷暴露組小鼠腎臟組織中有炎癥細(xì)胞的浸潤，炎癥因子TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)顯著升高。這表明慢性冷暴露會促進(jìn)腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)。

已有研究證實(shí)ERS的激活參與腎小囊上皮細(xì)胞損傷、腎小球系膜細(xì)胞損傷及腎小管上皮細(xì)胞損傷[13]。因此本試驗檢測了ERS相關(guān)蛋白GRP78、XBP1的表達(dá)。GRP78主要參與UPR，當(dāng)未折疊蛋白在ER中累積時，GRP78與跨膜蛋白分離，使跨膜信號蛋白聚集，感應(yīng)并傳遞UPR信號[14-15]。XBP1可作為ERS的傳感器，調(diào)控UPR。同時有報道稱ERS激活會引起凋亡基因CHOP表達(dá)升高，CHOP的過度表達(dá)觸發(fā)凋亡途徑，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[16]。本試驗中，CHOP、GRP78和XBP1在冷暴露組小鼠腎臟組織中表達(dá)較對照組升高。得出結(jié)論，當(dāng)機(jī)體受到冷刺激后，會促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘發(fā)ERS。

ERS與自噬的相互作用在很多生理與病理過程中都存在，ERS可通過多種分子機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬[17-18]，減輕ER壓力并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[19]。然而，高強(qiáng)度或持久的應(yīng)激可啟動細(xì)胞依賴自噬的死亡程序。Beclin-1是自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一[20]，可形成 Beclin1-Vps34-Vps15 復(fù)合結(jié)構(gòu)而啟動自噬、促進(jìn)吞噬泡成核并召募蛋白形成自噬前體[21]。eiF2α的激活是多種疾病中錯誤折疊蛋白積累引起自噬激活所必需的，其激活可以促進(jìn)LC3的轉(zhuǎn)化。LC3是參與自噬的關(guān)鍵蛋白[22]，其包括2種可以相互轉(zhuǎn)化的形式，分別是LC3Ⅰ和LC3Ⅱ[23]。LC3Ⅱ隨著自噬體膜的數(shù)量增多而增加。P62是自噬過程重要的受體，其與泛素化蛋白和LC3Ⅱ結(jié)合成復(fù)合體，啟動自噬體形成[24]。在本研究中，對自噬相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，慢性冷暴露會導(dǎo)致小鼠腎臟自噬激活。

綜上所述慢性冷暴露會促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引發(fā)ERS，誘發(fā)細(xì)胞自噬。而關(guān)于慢性冷暴露引起腎臟損傷的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。