馮 瑞，王子銘，黃富碩，李玉龍，張貴學(xué)

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

在疾病或感染期間，睪丸會受到損傷，會影響機體生育能力[1-2]。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致不育的一個因素，主要是由活性氧 (ROS) 產(chǎn)量過多引發(fā)，表現(xiàn)為精子數(shù)量和質(zhì)量下降[3-4]。睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中精原細胞凋亡是必須的[5]，所以異常的凋亡會影響到生殖障礙。睪丸支持細胞 (SCs) 保障精子發(fā)生和成熟，生長在各級生精細胞周圍，參與血睪屏障的形成，具有多種生理功能，起到支撐、保護和提供營養(yǎng)的作用[6-7]。Connexin43是血睪屏障重要組成蛋白，在睪丸內(nèi)細胞之間相互交流和精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[8]。研究已經(jīng)證明，SCs是各種毒物、感染劑的靶細胞，也是測定雄性生殖系統(tǒng)毒性的模型[9-10]。所以，在犢牛生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中，研究其SCs受到感染和應(yīng)激損傷還是非常有意義的。

脂多糖(LPS) 是革蘭陰性細菌外膜的主要成分，可以造成不同細胞的氧化應(yīng)激和凋亡[11-12]。Nrf2/HO-1信號通路參與調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時，Nrf2會進入細胞核內(nèi)激活超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽 (GSH) 以及血紅素加氧酶-1 (HO-1) 的轉(zhuǎn)錄，抵抗氧化應(yīng)激帶來的損傷[13-14]。細胞凋亡途徑有很多，p53的激活和Caspase3表達增多都是誘發(fā)細胞凋亡的重要因素[15]。

褪黑素 (N-乙?；?5甲氧基色胺) 主要由哺乳動物的松果腺產(chǎn)生，參與調(diào)控抗氧化、抗凋亡和抗炎等應(yīng)激反應(yīng)[16-17]。已經(jīng)有研究證實，褪黑素可以減弱氧化應(yīng)激和DNA損傷保護小鼠睪丸，緩解脂毒性造成精子發(fā)生和生育能力下降[18]，還可以減輕睪丸中鎘誘導(dǎo)的細胞應(yīng)激和生殖細胞凋亡[19]。

因此，本試驗利用體外模型，探究褪黑素對LPS誘導(dǎo)的犢牛SCs氧化應(yīng)激、細胞凋亡和Connexin43表達下調(diào)的保護作用。

1 材料與方法

1.1 SCs細胞培養(yǎng)實驗室先前凍存的犢牛SCs復(fù)蘇后[20]，使用含有89% DMEM/F12 (Sigma,USA)、10% FBS (Sigma) 和1%雙抗 (Biosharp,China) 的培養(yǎng)液，在5% CO2、37.5℃的環(huán)境條件下進行培養(yǎng)，等待細胞生長密度達到90%左右進行傳代和后續(xù)試驗。褪黑素 (Sigma,USA)使用DMSO (Sigma,USA) 配置 (DMSO濃度小于0.01%)，LPS (Sigma,USA) 使用無菌水配置。

1.2 CCK-8分析使用CCK-8試劑盒 (Bimake，USA) 進行細胞活力測定，按照說明書操作。將狀態(tài)好的細胞以2×104的密度傳代到96孔板中，培養(yǎng)12 h后，加入褪黑素(50 μmol/L)和 LPS(5 mg/L)進行培養(yǎng)，等待24 h后加入10 μL CCK-8試劑，在5% CO2、37.5℃的環(huán)境條件下進行孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度，計算細胞活力。

1.3 RT-PCR分析使用TRIzol (Invitrogen) 試劑提取各處理組的細胞的總RNA，通過計算調(diào)平后使用TaKaRa (Japan) 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后用DEPC水稀釋cDNA用于后續(xù)試驗。

引物詳細信息如表1所示，在QuantStudioTM設(shè)計分析軟件 (Applied Biosystems,USA)上檢測基因。反應(yīng)混合物 (10 μL) 由5 μL FastStart Universal SYBR Master (ROX) (Roche,USA) 組成，正、反向引物各0.3 μL。PCR條件95.0℃ 10 min，然后融化曲線程序用于40周期在95.0℃，持續(xù)15 s，60.0℃ 1 min和95.0℃ 15 s (增加溫度從60.0到95.0℃，保持1.0℃條件下每10 s上升0.5℃)，并執(zhí)行連續(xù)熒光測量。比較2-ΔΔCt方法用于定量mRNA表達，β-actin作為對照。

1.4 Western blot分析將各處理組的細胞溶解在比例為100∶1的RIPA (Santa Cruz,USA) 和蛋白酶抑制劑 (Santa Cruz,USA) 混合液中，放置室溫裂解10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，隨后去除底部沉淀，吸取上清。根據(jù)制造商的說明，用BCA試劑盒 (biyutian，China) 測量蛋白濃度，隨后按比例加入上樣緩沖液進行煮沸5 min得到蛋白樣品，進行電泳。用10%和12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜 (Roche,USA) 上，然后在室溫下用5%脫脂牛奶封閉液封閉PVDF膜2 h。封閉后，與一抗在4℃孵育過夜，用TBST洗3次，用二抗在室溫下洗2 h，之后用TBST洗3次，然后用增強ECL顯色液曝光。蛋白條帶采用ECL Western blot檢測系統(tǒng) (SmartchemiTMImage Analysis System,Beijing Sage Creation Science Co.LTD.China)。采用Image J軟件 (NIH,Bethesda,MD) 分析條帶密度。試驗所用抗體均購于Proteintech (China)。

1.5 ROS分析使用ROS檢測試劑盒 (南京建成) 進行性檢測，DCFH-DA用DMEM/F12稀釋，稀釋倍數(shù)為1∶1 000，最終濃度為10 μmol/L。等待處理細胞24 h后，吸出各處理組培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入稀釋的DCFH-DA，在5% CO2、37.5℃的環(huán)境中孵育30 min，孵育后使用PBS洗滌3次，在免疫熒光顯微鏡下進行拍照，得到的圖片使用Image J 軟件進行熒光強度分析，計算ROS，每個組重復(fù)3次。

表1 引物信息

1.6 SOD活性和GSH表達分析根據(jù)SOD和GSH試劑盒 (南京建成) 說明書進行操作，配置好需要的工作液。處理完細胞后，使用PBS輕輕洗滌3次，進行消化和離心，收集細胞沉淀到EP管中，隨后使用超聲破碎儀進行破碎。加入GSH工作液，混勻后，37℃孵育20 min，室溫靜置5 min，使用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測吸光度；加入SOD工作液，混勻后，37℃孵育20 min。使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度。最后根據(jù)說明書的公式計算各組的酶活性，每個組重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素和LPS對SCs活率的影響使用50 μmol/L 褪黑素和5 mg/L LPS處理檢測細胞活率(圖1)。與對照組相比，LPS細胞活率顯著下降(P<0.01)；與LPS組相比，共處理組細胞活率顯著上調(diào) (P<0.01)。

圖1 褪黑素和LPS對SCs活率的影響

2.2 褪黑素和LPS對SCs氧化應(yīng)激的影響使用50 μmol/L褪黑素和5 mg/L LPS處理SCs細胞檢測ROS、GSH表達量和SOD活性。與對照組相比，LPS處理細胞后，顯著增加ROS的表達量 (圖2 A、B) (P<0.01)；與LPS組相比，共處理組顯著降低ROS的表達量 (P<0.01)。

A.ROS免疫熒光圖；B.ROS熒光強度分析；C.SOD表達量；D.GSH表達量

與對照組相比，LPS處理細胞后，顯著降低SOD (圖2C) (P<0.05) 的活性和GSH (圖2D)(P<0.01) 的表達；與LPS組相比，共處理組顯著升高SOD(P<0.05) 的活性和GSH(P<0.01) 的表達。

2.3 褪黑素和LPS對Nrf2/HO-1信號通路的影響使用50 μmol/L褪黑素和5 mg/L LPS處理SCs細胞檢測Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達量。與對照組相比，LPS處理細胞后，顯著下調(diào)Nrf2 mRNA和蛋白的表達量 (圖3A、C、D) (P<0.05)，顯著下調(diào)HO-1 mRNA和蛋白的表達量 (圖3B、D、E) (P<0.01)；加入50 μmol/L褪黑素后，顯著上調(diào)Nrf2 mRNA (P<0.01) 和蛋白 (P<0.05) 的表達量，顯著上調(diào)HO-1 mRNA (P<0.01) 和蛋白 (P<0.05) 表達量，恢復(fù)至正常水平。

A.Nrf2 mRNA表達量分析；B.HO-1 mRNA表達量分析；C.Nrf2/β-actin蛋白灰度比值分析；D.Nrf2和HO-1蛋白條帶；E.HO-1/β-actin蛋白灰度比值分析

2.4 褪黑素和LPS對凋亡基因的影響使用50 μmol/L 褪黑素和5 mg/L LPS處理細胞檢測p53和Caspase3 mRNA和蛋白的表達量。與對照組相比，LPS處理細胞后，顯著上調(diào)p53 mRNA和蛋白的表達量(圖4A、C、D) (P<0.01)，顯著上調(diào)Caspase3 mRNA和蛋白的表達量(圖4B、D、E)(P<0.01)；加入50 μmol/L褪黑素后，顯著下調(diào)p53 mRNA (P<0.01) 和蛋白 (P<0.05) 的表達量，顯著下調(diào)Caspase3 mRNA和蛋白的表達量(P<0.01)。

A.p53 mRNA表達量分析；B.Caspase3 mRNA表達量分析；C.p53/β-actin蛋白灰度比值分析；D.p53和Caspase3蛋白條帶；E.Caspase3/β-actin蛋白灰度比值分析

2.5 褪黑素和LPS對Connexin43的影響使用50 μmol/L 褪黑素和5 mg/L LPS處理細胞檢測Connexin43 mRNA和蛋白的表達量。與對照組相比，LPS處理細胞后，顯著下調(diào)Connexin43 mRNA和蛋白的表達量(圖5A、C) (P<0.05)；加入50 μmol/L褪黑素后，抑制Connexin43 mRNA和蛋白的表達量 (P<0.01) 的下調(diào)。

A.Connexin43 mRNA表達量分析；B.Connexin43/β-actin蛋白灰度比值分析；C.p53和Caspase3蛋白條帶

3 討論

氧化應(yīng)激是細胞抗氧化系統(tǒng)不能抵抗ROS過量產(chǎn)生的狀態(tài)，而且SCs含有較高活性的SOD和GSH保護免受氧化應(yīng)激的損傷[21]。已有研究表明，LPS可以降低SOD和GSH的活性，誘導(dǎo)大鼠睪丸SCs產(chǎn)生氧化應(yīng)激[22]。在本研究中，5 mg/L LPS可以顯著增加ROS的表達量，顯著降低SOD活性和GSH表達量，這說明LPS破壞了ROS含量的動態(tài)平衡，降低了SOD的活性和GSH清除自由基的能力，造成細胞的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激的發(fā)生和Nrf2/HO-1信號通路有密切的關(guān)系[23]。本研究中，LPS可以上調(diào)Nrf2和HO-1的表達量顯著降低，這說明LPS可以調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。所以，LPS誘導(dǎo)犢牛SCs產(chǎn)生氧化應(yīng)激的機制可能是通過Nrf2/HO-1信號通路實現(xiàn)的，這也可能是細胞ROS過量產(chǎn)生，SOD活性下降和GSH表達減少的主要原因。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的形式之一，對生理內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[24]。已有研究證明，睪丸中的生殖細胞的數(shù)量和SCs的數(shù)量直接相關(guān)[25]。在本研究中，5 mg/L LPS可以顯著增加p53和Caspase3的表達量，這說明LPS激活了細胞凋亡途徑。p53的激活會進入線粒體促進凋亡因子的表達[26]，Caspase3的激活會導(dǎo)致SCs (TM4) DNA損傷發(fā)生，促進細胞凋亡數(shù)量增多[27]。所以，LPS可以誘導(dǎo)犢牛SCs凋亡途徑的激活，并且造成細胞凋亡，這也可能是本試驗SCs活力減少的主要原因。

已有研究證明，LPS可以降低大鼠星形膠質(zhì)細胞中Connexin43表達，并且小鼠支持細胞缺失Connexin43會抑制精子的發(fā)生[28-29]。本研究中，LPS處理SCs后，Connexin43的表達量也會降低，但是LPS導(dǎo)致Connexin43下調(diào)的具體原因還不能確定，可能是通過氧化應(yīng)激或者細胞凋亡引起的，需要進一步研究證實。由此可見，犢牛睪丸細菌感染后很可能會對生精過程，細胞之間的交流以及血睪屏障的形成有嚴重的影響。

LI等[30]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以降低ROS和Caspase3的表達量，提升SOD和GSH的含量，從而緩解豬SCs的氧化應(yīng)激和細胞凋亡；KUMAR等[31]研究發(fā)現(xiàn)使用褪黑素可以抑制Bisphenol S (BPS) 激活Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮抗氧化作用，并且抑制Connexin43的下調(diào)，從而緩解睪丸損傷。在本研究中，50 μmol/L褪黑素可以顯著降低ROS的表達量，提高SOD活性和GSH的表達量，抑制Nrf2/HO-1信號通路的激活，從而降低細胞的氧化應(yīng)激；降低p53和Caspase3的表達量，從而緩解細胞凋亡和細胞活力的下降，并且對Connexin43的表達下調(diào)也有緩解作用。這些結(jié)果可以證明，褪黑素對犢牛SCs受到細菌感染帶來的損傷具有積極的保護作用，起到抗氧化和抗凋亡的作用。

綜上所述，褪黑素可以緩解LPS誘導(dǎo)犢牛SCs的氧化應(yīng)激和凋亡，其機制可能通過Nrf2/HO-1和凋亡信號通路實現(xiàn)的，并且對細胞Connexin43的表達也有保護作用。