李 琪，張 濤

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

艾司唑侖為苯二氮卓類抗焦慮藥，對慢性失眠、焦慮，抑郁癥、恐懼、抗癲癇及抗驚厥也有效[1]。苯二氮卓類藥物中阿普唑侖、三唑侖、咪達(dá)唑侖由CYP3A4代謝，CYP2C19、CYP3A4基因多態(tài)性與艾司唑侖的藥動學(xué)特征有密切聯(lián)系[2]。研究表明，艾司唑侖在肝臟中主要由CYP3A4代謝，生成4-羥基艾司唑侖，活性與艾司唑侖基本相似[3]。但CYP3A4在中國人中突變率很低。CYP3A占CYP450家族的30%[4]。CYP2C19*2和CYP219*3是CYP2C19基因突變的主要類型。中國人群的突變率分別為32.18%、3.16%[5]?；蚨鄳B(tài)性對藥物代謝底物的藥動學(xué)及藥效學(xué)有一定的影響。本論文通過探討CYP2C19基因多態(tài)性對艾司唑侖藥代動力學(xué)的影響，更全面的闡述在人體內(nèi)艾司唑侖血藥濃度個體差異性的原因。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

艾司唑侖、地西泮(中國藥品生物制品檢定所)，甲醇和乙腈為色譜純。DNA提取純化試劑盒，CYP2C19基因分型試劑盒。P230 II高效液相色譜儀，S1000 PCR擴(kuò)增儀，Tacon360凝膠成像分析儀，PowerPac TM 通用電泳儀。

1.2 血樣采集

選出符合藥動學(xué)實(shí)驗標(biāo)準(zhǔn)的39例健康受試者，實(shí)驗前一天夜間禁食12h以上，次日清晨空腹口服艾司唑侖2mg，溫水送服。在服藥前和服藥后0.5、1、2、2.5、3.5、5.5、7.5、10、12、24、36h取肘靜脈血4mL，其中2mL置無抗凝劑的真空管中，分離出血漿保存?zhèn)溆茫?4h內(nèi)進(jìn)行血藥濃度測定。另2mL置 EDTA抗凝采血管中-40℃保存，采用PCR-RFLP法對受試者的血液進(jìn)行基因分型檢測。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及血漿樣品的制備

艾司唑侖和地西泮分別精密稱定24.8mg和5.0mg， 溶于100mL和50mL甲醇中。取5mL置50mL和25mL甲醇中，得到0.0248mg·mL-1艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.02mg·mL-1的地西泮內(nèi)標(biāo)溶液。取血漿0.5mL，加艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)液10μL，地西泮內(nèi)標(biāo)液25 μL。經(jīng)漩渦離心后，取4 mL于玻璃試管內(nèi)，50℃下N2氣流吹干，甲醇溶解，作為血漿樣品溶液。按相同方法制備不含艾司唑侖和地西泮的空白對照溶液。

1.4 基因分型檢測

取受試者肘靜脈血4mL，用DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。采用PCR-RFLP方法，進(jìn)行CYP2C19 基因型分析，包括野生型(wild-type*1)和2種突變型等位基因(CYP2C19*2、CYP2C19*3)。根據(jù)CYP2Cl9基因型將健康受試者分為純合子強(qiáng)代謝型(*1/*1，homEM)、雜合子強(qiáng)代謝型(*1/*2 或*1/*3，hetEM)和弱代謝型(*2/*2 或*2/*3，PM )。

1.5 藥動學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 色譜條件及專屬性試驗

色譜柱：Hypersil ODS2 C18(4.6mm×250mm,5μm)；流動相：甲醇-乙腈-水(28：28：44)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：230nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL。

血漿中艾司唑侖保留時間為7.17min，地西泮的保留時間為13.12min，峰形分離良好，內(nèi)源性雜質(zhì)對樣品峰的含量測定沒有干擾，見圖1。

圖1 艾司唑侖和內(nèi)標(biāo)色譜圖

2.2 線性關(guān)系與最低定量限

加入艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)液分別為2、6、10、14、18、22、26、52μL，計算標(biāo)準(zhǔn)濃度(X)對其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)的線性回歸，線性范圍為0.0494μg·mL-1～1.289μg·mL-1，定量下限為0.0494μg·mL-1，見圖2。

圖2 線性關(guān)系圖

2.3 精密度及穩(wěn)定性試驗

以地西泮為內(nèi)標(biāo)，用空白血漿配制艾司唑侖濃度0.397μg·mL-1、0.249μg·mL-1、0.099μg·mL-1各5份，經(jīng)計算日內(nèi)及日間精密度RSD<15%，提取回收率>70%，RSD<10%。于0h、24h、48h取樣，穩(wěn)定性RSD%為5.85、10.55和9.13，結(jié)果表明艾司唑侖穩(wěn)定性良好。

2.4 不同基因型的藥動學(xué)特征的比較分析

圖3 CYP2C19基因型hetEM和PM分組的藥-時曲線

2.5 藥代動力學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件比較CYP2C19基因中雜合子強(qiáng)代謝型homEM和弱代謝型PM之間的藥代動力學(xué)參數(shù)的差異。無顯著性差異(P>0.05)。強(qiáng)代謝型和弱代謝型對Tmax、Cmax、T1/2Ke、AUC0-36、AUC0-∞的影響均無顯著性的影響，見表1。

表1 艾司唑侖藥動學(xué)參數(shù)在CYP2C19 homEM和PM的方差分析

3 討論

高效液相法適合于艾司唑侖的血藥濃度檢測，方法學(xué)考察均符合生物樣品分析的要求。CYP2C19的兩個等位基因CYP2C19*2和CYP2C19*3是突變的主要類型。實(shí)驗結(jié)果可知，CYP2C19的兩組代謝類型homEM和PM的藥動學(xué)參數(shù)比較中，各項藥動學(xué)參數(shù)都(P>0.05)，homEM和PM之間無顯著性差異，這與國外文獻(xiàn)的報道一致[6]。結(jié)果表明受試者中CYP2C19的基因多態(tài)性對艾司唑侖的藥代動力學(xué)并沒有顯著性的影響(P>0.05)。說明艾司唑侖在CYP2C19的雜合子強(qiáng)代謝型homEM和弱代謝型間PM的藥動學(xué)無顯著性差異。本文研究首次將CYP2C19基因多態(tài)性結(jié)合考察對中國人體內(nèi)艾司唑侖的藥代動力學(xué)的影響，艾司唑侖的個體間差異是否僅由CYP2C19產(chǎn)生的影響還需進(jìn)一步研究。