江金蘭

(三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所/福建省山區(qū)作物遺傳改良與創(chuàng)新利用重點實驗室，福建 沙縣 365051)

石斛屬(Dendrobium)植物為蘭科(Orchidaceae)多年生附生草本植物，其中超過50種被認(rèn)定有藥用價值[1]。在自然界中，石斛屬植物生長緩慢且繁殖能力極低，加之野生資源遭到嚴(yán)重破壞，因此培育石斛新品種變得越來越重要[2]。雜交育種是目前藥用石斛品種創(chuàng)新和種質(zhì)改良的主要手段[3]。

鐵皮石斛(D.officinale)和重唇石斛(D.hercoglossum)均為中藥石斛的基原植物，且具有較高的觀賞價值。鐵皮石斛是近年來發(fā)展最迅速、栽培最廣泛、品質(zhì)較好的藥用石斛[4]；重唇石斛是鐵皮石斛的近緣種，莖常被加工成扁黃草和“雞爪蘭”楓斗[5]，具有環(huán)境適應(yīng)性強和生物產(chǎn)量大等特點。因此，開展鐵皮石斛與重唇石斛的雜交，有望得到品質(zhì)好、產(chǎn)量高的雜交后代。2013年以來，三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所開展了藥用石斛種間雜交試驗[4,6-9]，獲得了鐵皮石斛×重唇石斛等石斛雜交后代株系。

石斛屬植物試管苗增殖主要通過原球莖增殖和芽增殖兩種方式進(jìn)行[10]。目前，黑毛石斛×鼓槌石斛[2]、金釵石斛×細(xì)莖石斛[11]、鐵皮石斛×鉤狀石斛[12]等雜交后代的組織培養(yǎng)已有報道，但尚未見鐵皮石斛×重唇石斛雜交后代組織培養(yǎng)的相關(guān)報道。在鐵皮石斛×重唇石斛雜交后代組織培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)存在增殖速度慢、增殖率低和苗較弱等問題，可能與培養(yǎng)基配方有關(guān)。因此，本研究比較了激素(6-BA、NAA)和有機(jī)質(zhì)(香蕉泥)對鐵皮石斛×重唇石斛種間雜交蒴果無菌播種長出的原球莖及小苗增殖的影響，以期為其雜交后代種苗規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以無菌播種的鐵皮石斛×重唇石斛F1代原球莖和小苗為供試材料，由三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院種苗繁育中心提供。

1.2 試驗方法

試驗于2021年8月進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光照強度為1 500～2 000 lx,光照為14 h·d-1。

1.2.1 F1代原球莖的增殖 采用三因素三水平正交試驗(表1)進(jìn)行激素(6-BA、NAA)和有機(jī)質(zhì)(香蕉泥)的配比，以優(yōu)化鐵皮石斛×重唇石斛F1代原球莖的增殖培養(yǎng)基配方。各處理以1/2MS+30 g·L-1蔗糖+1 g·L-1AC+5.6 g·L-1瓊脂粉為基本培養(yǎng)基，pH值為5.6～5.8。每瓶接種20粒原球莖為1個重復(fù)，每個處理5個生物學(xué)重復(fù)。接種30 d后統(tǒng)計生長速度、折干率(60 ℃下烘干至恒質(zhì)量)。生長速度=(增殖后原球莖質(zhì)量-接種時原球莖質(zhì)量)/接種時原球莖質(zhì)量，折干率/%=(干質(zhì)量/鮮質(zhì)量)×100。

表1 鐵皮石斛×重唇石斛F1代原球莖增殖正交試驗因素和水平設(shè)計表1)

1.2.2 F1代小苗的增殖 采用三因素三水平正交試驗(表2)進(jìn)行激素(6-BA、NAA)和有機(jī)質(zhì)(香蕉泥)的配比，以優(yōu)化鐵皮石斛×重唇石斛F1代小苗的增殖培養(yǎng)基配方。各處理以1/2MS+30 g·L-1蔗糖+1 g·L-1AC+5.6 g·L-1瓊脂粉為基本培養(yǎng)基，pH值為5.6～5.8。每瓶接種20株小苗(株高1～2 cm)為1個重復(fù)，每個處理5個生物學(xué)重復(fù)。接種4個月后統(tǒng)計生長速度、增殖系數(shù)。生長速度=(增殖后苗質(zhì)量-接種時苗質(zhì)量)/接種時苗質(zhì)量，增殖系數(shù)=增殖后的苗數(shù)/接種時的苗數(shù)。

表2 鐵皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖正交試驗因素和水平設(shè)計表1)

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素和有機(jī)質(zhì)對 F1代原球莖增殖的影響

接種30 d后，統(tǒng)計增殖后的原球莖生長速度及折干率(表3)。從表3可見，處理8原球莖生長速度最快(55.49)，極顯著高于其他處理；折干率位居前三的依次為處理3(8.44%)、處理5(7.99%)和處理8(7.60%)，且三者間差異不顯著。因此，綜合考慮生長速度和折干率，最適宜原球莖增殖的為處理8，即：2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。極差分析結(jié)果(表3)表明，3個因素對生長速度的影響依次為：6-BA>香蕉泥>NAA，對折干率的影響依次為：香蕉泥>NAA>6-BA。根據(jù)各列k值大小可知，生長速度的最優(yōu)組合(A3B2C1)為：2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，折干率的最優(yōu)組合(A2B2C3)為： 1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+100 g·L-1香蕉泥。

表3 激素和有機(jī)質(zhì)對鐵皮石斛×重唇石斛F1代原球莖增殖的影響1)

主體間效應(yīng)檢驗(表4)表明，6-BA、NAA和香蕉泥對鐵皮石斛×重唇石斛F1代原球莖增殖的影響不顯著，三者對增殖生長速度影響的主次關(guān)系為：6-BA>NAA>香蕉泥。9個處理的原球莖增殖形態(tài)見圖1。從圖1可見，生長速度最高的處理8(圖1H)原球莖大部分顏色深綠且簇生多，長勢均勻，增殖程度最佳；折干率最高的處理3(圖1C)原球莖大部分顏色深綠，近40%的原球莖冒出芽尖，長勢中等。

表4 激素和有機(jī)質(zhì)對鐵皮石斛×重唇石斛F1代原球莖增殖影響的主體間效應(yīng)

A～I(xiàn)分別為處理1～9增殖的原球莖形態(tài)。

2.2 激素和有機(jī)質(zhì)對F1代小苗增殖的影響

小苗接種4個月后，統(tǒng)計增殖后苗的生長速度及增殖系數(shù)(表5)。從表5可見，生長速度位于前二位的為處理1(78.55)、處理3(70.13)，二者的差異不顯著；增殖系數(shù)位于前二位的為處理3(4.51)、處理2(3.91)，二者的差異不顯著。綜合考慮生長速度和增殖系數(shù)，最有利于小苗增殖為處理3，即： 1 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA+100 g·L-1香蕉泥。極差分析結(jié)果(表5)表明， 3個因素對生長速度的影響依次為：6-BA>香蕉泥>NAA，對增殖系數(shù)的影響依次為：6-BA>香蕉泥>NAA。根據(jù)各列k值大小可知，生長速度的最優(yōu)組合(A1B1C1)為：1 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，增殖系數(shù)的最優(yōu)組合(A1B3C3)為： 1 mg·L-16-BA+0.6 mg·L-1NAA+100 g·L-1香蕉泥。

表5 激素和有機(jī)質(zhì)對鐵皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖的影響1)

主體間效應(yīng)檢驗(表6)表明，NAA和香蕉泥對小苗增殖的影響不顯著，6-BA對小苗增殖的影響達(dá)顯著水平(P<0.05)。3個因素對鐵皮石斛×重唇石斛雜交F1代小苗生長速度的影響依次為：NAA>香蕉泥>6-BA，對小苗增殖系數(shù)的影響依次為：6-BA>香蕉泥>NAA。9個處理的小苗增殖見圖2。從圖2可見，生長速度最快的處理1(圖2A)苗深綠色，長勢均勻整齊，莖稈粗壯，根部具少量原球莖；增殖系數(shù)最大的處理3(圖2C)苗綠色，長勢整齊，稍弱，根部具少量原球莖。

表6 激素和有機(jī)質(zhì)對鐵皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖影響的主體間效應(yīng)1)

A～I(xiàn)分別為處理1～9增殖苗的形態(tài)。

3 討論與結(jié)論

3.1 激素對鐵皮石斛×重唇石斛雜交F1代增殖的影響

組織培養(yǎng)中，適合的激素濃度和配比有利于石斛的增殖，反之則不然。付傳明等[12]研究表明，當(dāng)6-BA為2.0 mg·L-1時，鐵皮石斛與鉤狀石斛(D.aduncum)雜交后代原球莖會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。陳春[13]研究表明，獨角石斛原球莖在6-BA為3.0 mg·L-1時出現(xiàn)玻璃化。本研究也表明，過高的6-BA會導(dǎo)致鐵皮石斛×重唇石斛F1代種苗過于細(xì)弱。當(dāng)6-BA濃度在最優(yōu)條件下，NAA質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0 mg·L-1時，原球莖平均生長速度為22.24、55.49、15.00，表明一定濃度的NAA會促進(jìn)原球莖增殖，濃度過高易造成原球莖大量分化，對原球莖增殖影響顯著。此結(jié)論與宋麗娟等[14]的研究相一致，即在鐵皮石斛培養(yǎng)中，隨著NAA濃度的升高，原球莖的分化率相應(yīng)提高。因此，篩選出適宜的激素濃度和配比有利于原球莖的增殖，但不同種石斛對激素的響應(yīng)存在一定差異。任海虹等[15]在鐵皮石斛、許丁帆等[16]在玫瑰石斛(D.crepidatum)原球莖增殖中篩選出最適宜的培養(yǎng)基均為：1/2MS+1 mg ·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，增殖系數(shù)分別達(dá)23、6.04。本試驗篩選出鐵皮石斛×重唇石斛F1代原球莖增殖的適宜激素配比為：2 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA，生長速度達(dá)55.49。相比之下，本試驗中6-BA質(zhì)量濃度偏高，可能由于培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件不同所致。

3.2 有機(jī)質(zhì)對鐵皮石斛×重唇石斛雜交F1代增殖的影響

組織培養(yǎng)中常常添加香蕉泥等有機(jī)質(zhì)來促進(jìn)石斛的生長或提高增殖率，如鐵皮石斛[14,17]、串珠石斛[18]、鐵皮石斛與鉤狀石斛雜交后代[12]、玫瑰石斛[16]的芽苗分化、生根壯苗培養(yǎng)。本研究也表明，在鐵皮石斛×重唇石斛F1代小苗增殖階段，100 g·L-1香蕉泥可提高增殖系數(shù)和促進(jìn)種苗株高、莖粗的生長。

本文以鐵皮石斛與重唇石斛雜交F1代為試驗材料，通過探討原球莖與小苗增殖的激素與有機(jī)質(zhì)配比實現(xiàn)了F1代增殖技術(shù)的優(yōu)化，將進(jìn)一步研究F1代壯苗生根及移栽等技術(shù)，以期為選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的石斛雜交品種提供新種質(zhì)。