于晨晨，徐萌，李升云，袁友衛(wèi)，齊國輝，田益玲，3，4*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；3.河北省核桃工程技術(shù)中心，河北 邢臺 054000；4.河北?。ㄐ吓_）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 邢臺 054000）

核桃雄花（walnut staminate flowers）是核桃生殖生長過程中的副產(chǎn)物，少量用于授粉，其余均予疏除，因而其產(chǎn)量與核桃相當(dāng)。剛采摘的核桃雄花蛋白質(zhì)含量達18.8%，干燥后的核桃雄花高達21%～25%，不僅高于核桃仁，而且是干蕨菜和脫水白菜蛋白質(zhì)的3倍[1-3]。在少數(shù)地區(qū)核桃雄花被用做蔬菜食用，制作炸菜、炒菜、涼拌菜等[4]。核桃雄花還具有抗氧化、抗炎、降血糖等功能活性，這與其多酚含量高有關(guān)[5-6]。研究表明，核桃花中槲皮素與山萘酚的含量分別達0.23%和0.08%[7]。Chrzanowski等[8]在核桃花序中鑒定出綠原酸、香草酸、對羥基苯甲酸等11種酚酸，其中香草酸為雄花中主要成分，含量達359.5 μg/g。賈忠等[9]通過核磁共振波譜法對核桃花中黃酮類物質(zhì)進行分析，鑒定出山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素等7個黃酮類物質(zhì)。然而，加工處理儲藏方式對其生物活性物質(zhì)影響方面的研究較少。

另外，多酚類化合物是引發(fā)褐變的主要因素之一，其在酶促褐變和非酶促褐變中都起著重要的作用，因此，深入研究核桃雄花中酚類物質(zhì)的組分不僅有助于了解其褐變物質(zhì)及作用機制，還為核桃雄花產(chǎn)品開發(fā)和防褐變提供一定的依據(jù)。超高分辨液相色譜質(zhì)譜技術(shù)（ultra-high resolution liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）是植物化學(xué)成分分析和鑒定的重要技術(shù)，具有高分辨率、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點[10]。本研究以新鮮、真空冷凍干燥和自然晾干核桃雄花為研究材料，采用UHPLC-MS/MS法，結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻報道對其多酚類化合物的質(zhì)譜裂解途徑和結(jié)構(gòu)進行分析，為進一步研究核桃雄花提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試核桃雄花（綠嶺）采于河北省綠嶺有限公司生產(chǎn)基地。

乙醇、甲醇、甲酸（均為分析純）：天津富宇化工有限公司；乙腈（色譜純）：美國Sigma-Aldrich化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q Exactive Plus Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司；5425R低溫離心機：德國Eppendorf公司；scilogex可調(diào)混合儀：上海珂淮儀器有限公司；LG10冷凍干燥機：新陽速凍設(shè)備制造有限公司；DiKMA Platisil ODS色譜柱：中國Dikma公司。

1.3 采收后核桃雄花的不同處理

將新鮮采摘的核桃雄花分別進行真空冷凍干燥（真空度 100 Pa、溫度-50℃、24 h）、冷凍（-20℃、12 h）和自然晾干（25℃、5 d）處理。

1.4 樣品溶液制備

取適量新鮮、真空冷凍干燥和自然晾干核桃雄花樣，在乙醇濃度60%、料液比1∶25（g/mL）、溫度60℃、提取時間60 min下通過超聲輔助提取多酚類化合物，再經(jīng)大孔樹脂純化、濃縮、凍干得核桃雄花多酚純化物，-20℃條件保存?zhèn)溆?。將核桃雄花多酚粉末溶?0%甲醇，超聲30 min，14 000 r/min離心5 min取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待UHPLC-MS/MS分析。

1.5UHPLC-MS/MS分析條件

色譜條件：Dionex Ultimate 3000超高效液相系統(tǒng)；色譜柱：DiKMA Platisil Octadecylsilyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL；波長：280 nm；梯度洗脫程序：0～2 min，8%～10%A；2 min～27 min，10%～30%A；27 min～50 min，30%～90%A；50 min～52 min，90%～100%A；52 min～56 min，100%A；56 min～60 min，100%～8%A。

質(zhì)譜條件：Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜；掃描范圍m/z 100～1 200、離子源電壓3.2 kV、鞘氣流速40 L/min、輔助氣體流量15 L/min、毛細管溫度320℃、輔助燃氣加熱器溫度350℃。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Compound discover 3.2軟件進行原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)特征峰提取，以對供試樣品溶液中多酚成分的保留時間和質(zhì)譜信息進行分析；通過mzcloud在線數(shù)據(jù)庫和本地自建mzvault天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫對化學(xué)成分作進一步推斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理的核桃雄花

對核桃雄花進行不同處理后的結(jié)果見圖1。

圖1 核桃雄花Fig.1 Walnut staminate flowers

由圖1可知，真空冷凍干燥能較好地保留核桃雄花原本的綠色特征，而自然晾干及低溫冷凍的核桃雄花發(fā)生嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象，呈褐色。真空冷凍干燥過程中不僅降低環(huán)境中的氧氣分壓，而且能夠去除氧化反應(yīng)介質(zhì)水分，從而有效地阻止酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)，因此保持其綠色，而凍藏和自然晾干發(fā)生較大的褐變。

2.2 核桃雄花中多酚物質(zhì)的UHPLC-MS/MS分析

采用UHPLC-MS/MS對不同處理核桃雄花多酚提取物的化學(xué)成分進行定性分析，在電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）正負離子模式下，樣品中的化合物具有良好的響應(yīng)，結(jié)果見圖2。

通過利用化合物主要碎片離子、保留時間、分子離子峰等信息，結(jié)合相關(guān)文獻報道及mzcloud和mz－Vault數(shù)據(jù)庫收錄的天然產(chǎn)物，對新鮮、真空冷凍干燥和自然晾干后的核桃雄花中主要多酚類物質(zhì)進行分析，表1匯總了初步鑒定的41種活性成分，包含17種黃酮類、9種單寧類、9種酚酸類和6種香豆素類。

表1 不同處理核桃雄花中多酚類成分的鑒定分析結(jié)果Table 1 Identification and analysis of polyphenols in walnut staminate flowers with different treatments

續(xù)表1 不同處理核桃雄花中多酚類成分的鑒定分析結(jié)果Continue table 1 Identification and analysis of polyphenols in walnut staminate flowers with different treatments

由表1可知，山奈酚、金絲桃苷和槲皮苷等為新鮮、真空冷凍干燥及自然晾干褐變核桃雄花的共有組分，新鮮樣品還有異鼠李素、高黃芩素、瑞香素等為褐變樣中未檢測到物質(zhì)，而肉桂酸和7-羥基香豆素為自然晾干褐變后核桃雄花獨有成分。推測鮮樣中檢測到的物質(zhì)為發(fā)生褐變的主要酚類物質(zhì)，而肉桂酸和7-羥基香豆素為褐變產(chǎn)物，但其發(fā)生過程有待進一步深入研究。

2.2.1 黃酮類物質(zhì)分析

黃酮類化合物主要有脫去中性碎片、失去羰基、逆狄爾斯-阿德爾（retro-diels-alder，RDA）裂解重排、糖苷鍵斷裂等裂解方式。例如化合物18母離子為m/z 287[M+H]+，裂解的二級離子峰有m/z 121[M-H-COH2O-C6H4O]+，m/z 153[M+H-134]+，m/z 241[M+H-COH2O]+，與已有報道結(jié)果相一致[11-12]，因此推測化合物18為山奈酚。

化合物36負離子模式下母離子為m/z 301[M-H]-，由此得知其分子量為302，同時化合物36具有特征碎片離子m/z 179和m/z 151，結(jié)合文獻[13]及數(shù)據(jù)庫推斷化合物36為槲皮素。由于槲皮素A、B苯環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，質(zhì)譜裂解產(chǎn)生碎片主要在C環(huán)的RDA裂解，由此可知碎片離子m/z 179為母離子通過發(fā)生RDA裂解獲得，丟失一分子CO產(chǎn)生碎片m/z 151，繼續(xù)掉下CO2得到m/z 107碎片?；衔?5母離子為m/z 463[M-H]-，確定分子量為464。碎片離子m/z 301[M-H-Glc]-是母離子失去葡萄糖殘基得到，碎片m/z 301再裂解生成m/z 179和m/z 151兩個特征離子，或發(fā)生RDA裂解得碎片m/z 151，再失去一個CO2獲得m/z 107離子。結(jié)合斷裂信息和文獻[14]，確定化合物25為異槲皮苷?；衔?2準(zhǔn)分子離子峰為m/z 447[M-H]-，二級裂解得碎片m/z 301和m/z 283，經(jīng)分析，m/z 301是母離子失去一分子鼠李糖基得到，m/z 283是失去一分子己糖基團得到，與槲皮苷的裂解規(guī)律一致，結(jié)合數(shù)據(jù)庫及已有文獻[15]報道，確定化合物32為槲皮苷。

化合物39分子離子峰為m/z 285[M-H]-。丟失中性分子H2O得離子m/z 267[M-H-H2O]-，再連續(xù)失去一分子CO得碎片m/z 239[M-H-H2O-CO]-和m/z 211[MH-H2O-2CO]-；C環(huán)發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生m/z 167和m/z 117離子，結(jié)合分析及數(shù)據(jù)庫檢索推斷化合物39為高黃芩素。

化合物40準(zhǔn)分子離子峰m/z 315[M-H]-，二級裂解產(chǎn)生典型碎片離子m/z 300[M-H-CH3]-，再丟失一個CHO得碎片m/z 271；母離子發(fā)生RDA裂解得碎片離子m/z 151。與文獻[16]報道一致，因此確定化合物40為異鼠李素。

2.2.2 單寧類物質(zhì)的分析

化合物1母離子為m/z 305[M-H]-，二級碎片離子為 m/z 179[M-H-C6H6O3]-、m/z 165[M-H-C7H8O3]-、m/z 137、m/z 125[M-H-C9H8O4]-，因此推測其分子式為C14H15O7，結(jié)合文獻[17]數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫，推斷化合物1為表沒食子兒茶素?；衔?6分子離子峰為m/z 457[M-H]-，進而確定其分子量為458。二級特征碎片離子為 m/z 305、m/z 169、m/z 125。其中碎片離子 m/z 305[M-H-152]-為母離子通過RDA反應(yīng)產(chǎn)生；離子m/z 169和m/z 125是表兒茶素/兒茶素沒食子酸酯的特征離子碎片，表明化合物16的結(jié)構(gòu)中含有沒食子酰基[18]。由上述質(zhì)譜信息及數(shù)據(jù)庫檢索，推斷化合物16為表沒食子兒茶素沒食子酸酯。

化合物6母離子為m/z 577[M-H]-，分子量為578，是兩個單體通過C4-C8或C4-C6鍵連接的二聚體典型分子量。其二級裂解的主要碎片離子有：m/z 407、m/z 289、m/z 245、m/z 125，其中最強峰離子 m/z 125[M-H-452]-為母離子發(fā)生雜環(huán)裂解（heterocyclic ring fission，HRF）反應(yīng)，丟失一分子間苯三酚所產(chǎn)生；分子離子先發(fā)生RDA反應(yīng)再丟失一分子水獲得碎片離子m/z 407[M-H-C8H8O3-H2O]-；離子m/z 289和m/z 245分別為母離子由分子間斷裂失去C15H12O6，再失去一分子CO2產(chǎn)生。此結(jié)果與文獻[19]報道相似，因此推斷化合物6為B型原花青素二聚體。

化合物10負離子模式下母離子m/z 169[M-H]-，進而推斷其分子量為170，二級碎片離子為m/z 151、m/z 125和m/z 107。其中m/z 125和m/z 151是沒食子酸特征碎片離子[20]，沒食子酸脫水得到離子峰m/z 151，m/z 125失去一分子水得到碎片m/z 107，因此推斷化合物10為沒食子酸。

2.2.3 酚酸類物質(zhì)的分析

化合物2正離子模式下出現(xiàn)分子離子峰m/z 181[M+H]+，分子量為180。二級碎片離子有m/z 163、m/z 135以及m/z 117，由母離子脫水、脫羧和連續(xù)脫水獲得，說明化合物2結(jié)構(gòu)中可能含有羧基和鄰二羥基，因此推斷化合物2為咖啡酸?；衔?8準(zhǔn)分子離子峰為m/z 207[M-H]-，則分子量為208，其二級碎片離子為m/z 179、m/z135和m/z134，其中m/z 179為咖啡酸，再掉下一分子CO2得到碎片m/z 135，失去一分子羧酸得到碎片m/z 134，結(jié)合數(shù)據(jù)庫及文獻[21]確定化合物38為咖啡酸乙酯。

化合物4和12的準(zhǔn)分子離子峰均為m/z 353[MH]-，分子量為354；二級裂解得到離子m/z 191、m/z 179、m/z 173和m/z135，然而，它們的碎片離子豐度不同。經(jīng)分析，母離子失去1個咖啡?；胢/z 191，其再失去一分子水[191-H2O]-得到m/z 173，m/z 179為咖啡酸根，m/z 135為[179-COO]-，因此推測二者為綠原酸的兩個同分異構(gòu)體。結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析及文獻[22]，確定化合物4為隱綠原酸，化合物12為綠原酸。

化合物29正離子模式下對母離子m/z 149[M+H]+進行碰撞誘導(dǎo)裂解，得到主要碎片離子m/z131、m/z103、m/z 121和m/z 79。碎片m/z 121[M+H-CO]+為母離子失去一個CO產(chǎn)生；m/z 131[M+H-H2O]+為丟失一分子H2O形成，再失去一分子CO產(chǎn)生碎片m/z 103[M+H-H2OCO]+，二者分別為失去羰基和羧基形成的特征碎片離子。結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，推斷化合物29為肉桂酸。

化合物34經(jīng)母離子m/z 195裂解產(chǎn)生碎片離子m/z177、m/z164和m/z149，母離子失去一分子水得到碎片m/z 177[M+H-H2O]+，丟失一分子羧基產(chǎn)生m/z 149[M+H-COOH]+，與文獻報道一致[23]，再結(jié)合數(shù)據(jù)庫確定化合物34為阿魏酸。

2.2.4 香豆素類物質(zhì)的分析

該類化合物反映的主要特征是母離子丟失中性分子。例如化合物13的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 147，則分子量為146，其二級裂解碎片離子有m/z 119和m/z 91，碎片m/z 119[M+H-CO]+是由母離子失去一分子CO得到的，再失去一分子CO得到碎片m/z 91，即為C7H7+，因此確定化合物13為香豆素，此數(shù)據(jù)與文獻[24]質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。化合物5母離子m/z 161[M-H]-進行反應(yīng)，二級裂解產(chǎn)生特征碎片離子m/z 133、m/z 105和m/z 99，其反應(yīng)途徑為連續(xù)失去兩個CO基團，可能為環(huán)上的CO破裂，也可能是酯鍵上的CO破裂，而環(huán)上的CO更易失去[18]。碎片m/z 99為母離子連續(xù)失去一分子CO2和H2O所得。結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，推斷化合物5為7-羥基香豆素。

3 結(jié)論

本研究通過UHPLC-MS/MS法對不同處理后的核桃雄花多酚類化合物進行定性分析，共鑒定出41個活性成分，包括17種黃酮類、9種單寧類、9種酚酸類和6種香豆素類，其中山奈酚、金絲桃苷、槲皮苷、蘆丁、紫云英苷等為新鮮樣品、真空冷凍干燥樣品和自然晾干樣品的共有組分，自然晾干褐變后核桃雄花中另有7-羥基香豆素和肉桂酸兩種酚類組分。多酚類化合物是引發(fā)褐變的主要底物，黃烷醇類易與酚酸類反應(yīng)生成棕色聚合物，而山奈酚、金絲桃苷、槲皮苷、異鼠李素等在自然晾干褐變樣品中變化明顯，金絲桃苷、槲皮苷和紫云英苷等結(jié)構(gòu)中還含有糖苷鍵，易被水解并發(fā)生美拉德反應(yīng)生成糠醛，化學(xué)性質(zhì)活潑的糠醛經(jīng)過積累進而發(fā)生褐變。此結(jié)果表明核桃雄花發(fā)生的褐變與酚類物質(zhì)導(dǎo)致的非酶褐變有極大的關(guān)系，但酚類化合物與雄花褐變之間的具體相關(guān)性還需進行進一步穩(wěn)定性試驗來驗證。本研究通過對不同處理核桃雄花多酚的變化進行研究，從而發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致核桃雄花褐變的酚類成分，為核桃雄花防褐變研究提供一定參考。