王 哲 韓前河 程傳宇

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的一種，生存預后較差[1]。近年來中國男性前列腺癌發(fā)病率逐漸升高，且高齡或轉移性患者比例較高，因而病死率較高[2]。在惡性腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤細胞能量代謝重編程與細胞增殖、耐藥、局部浸潤、惡性轉移等生物學行為密切相關[3]。有氧糖酵解是腫瘤細胞獲取能量的重要手段，抑制有氧糖酵解阻斷腫瘤細胞能量供應也是抗癌治療的有效策略之一[4]。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，具有多種生物學活性[5]。體內體外研究表明Res對肺癌、肝癌及乳腺癌等多種癌細胞均具有一定抑制作用，可同時抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡并抑制其糖酵解過程[6]。目前關于Res對前列腺癌的抑制作用僅停留在影響細胞增殖層面[7]，關于Res對前列腺癌細胞糖酵解作用的影響結論不夠明確。本研究分析了Res對前列腺癌細胞糖酵解作用的影響，為Res作為抗前列腺癌藥物在臨床的應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料前列腺癌細胞PC3和DU145購置于上海普諾賽生物公司；Res(≥99%，美國Sigma公司)；兔抗人己糖激酶2(Hexokinase 2，HK2)抗體；M2型丙酮酸激酶(M2 isoform pyruvate kinase，PKM2)抗體；3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)抗體(武漢Proteintech)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)PC3和DU145細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖活力將對數(shù)生長期的PC3和DU145細胞(1×104個/孔)接種于96 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，加入不同濃度(0、5、10、15、20、25、50 μmol/L)的Res，每個濃度設6個復孔。培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μl 5 mg/ml四甲基偶氮唑藍(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液，避光孵育4 h。棄培養(yǎng)液，每孔中加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，使用酶標儀在570 nm波長處測取吸光度(OD)值，計算細胞存活率和IC50值。細胞存活率=實驗組OD均值/對照組OD均值×100%。

1.2.3 葡萄糖攝能力和乳酸分泌量檢測取對數(shù)生長期的PC3和DU145細胞接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞貼壁后采用Res處理48 h，并設置對照組。參照試劑盒說明書測定培養(yǎng)基中的葡萄糖和乳酸含量[8]。葡萄糖攝入量=(原培養(yǎng)液中的葡萄糖含量-處理組培養(yǎng)液中的葡萄糖含量)/細胞數(shù)目。乳酸分泌量=(處理組培養(yǎng)液中的乳酸含量-原培養(yǎng)液中的乳酸含量)/細胞數(shù)目。

1.2.4 HK和PK活性檢測將對數(shù)生長期的PC3和DU145細胞(1×104個/孔)接種于96 孔板中培養(yǎng)，細胞貼壁后加入Res處理48 h，并設置對照組。處理結束后，離心收集細胞沉淀，加入提取液，超聲破碎，4 ℃離心10 min，取上清，采用己糖激酶(Hexokinase，HK)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)檢測酶活性。

1.2.5 Western blot檢測HK 2 PKM 2蛋白表達將對數(shù)生長期的PC3和DU145細胞(1×104個/孔)接種于96孔板中培養(yǎng)，細胞貼壁后加入Res處理48 h，并設置對照組。處理結束后，離心收集細胞沉淀，采用細胞蛋白提取試劑盒提取蛋白，并使用BCA法進行蛋白定量。取25 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，并將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入HK2、PKM2和GAPDH(1∶1000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光法曝光成像。以GAPDH作為內參，分析HK2和PKM2蛋白表達水平。

2 結果

2.1 Res對前列腺癌細胞增殖的影響采用梯度濃度的Res(0、5、10、15、20、25、50 μmol/L)分別作用PC3和DU145細胞，結果顯示，隨著Res濃度升高，PC3和DU145細胞存活率逐漸降低。Res作用于PC3和DU145細胞48 h的IC50值分別為23.36 μmol/L和28.47 μmol/L，因此選用25 μmol/L的Res進行后續(xù)實驗。與0 μmol/L Res處理PC3細胞比較，P<0.05；與0 μmol/L Res處理DU145細胞比較，P<0.05。見圖1。

圖1 Res對PC3和DU145細胞存活率的影響

2.2 Res對前列腺癌細胞葡萄糖攝取能力及乳酸分泌量的影響與對照組比較，Res組PC3和DU145細胞的葡萄糖攝取能力及乳酸分泌量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，P<0.05。見圖2。

圖2 Res對PC3和DU145細胞葡萄糖攝取能力及乳酸分泌量的影響

2.3 Res對糖酵解關鍵酶酶活性的影響與對照組比較，Res組PC3和DU145細胞中HK和PK的活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，P<0.05。見圖3。

圖3 Res對PC3和DU145細胞HK和PK的活性的影響

2.4 Res對糖酵解關鍵酶蛋白表達的影響Western Blot結果顯示，與對照組比較，Res組PC3和DU145細胞中HK2和PKM2蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，P<0.05。見圖4。

圖4 Res對PC3和DU145細胞HK2和PKM2蛋白表達的影響

3 討論

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，由于其發(fā)病和進展機制復雜，目前尚未有徹底有效的治療方法，因此研究和開發(fā)新的藥物方案尤為重要[9]。Res是一種天然的多酚類化合物，被證實具有抗炎、抑制血小板聚集、免疫調節(jié)作用等多種生物學作用，且有一定抗腫瘤效用[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)Res對前列腺癌細胞PC3和DU145的增殖具有明顯抑制作用[11,12]。本研究采用MTT實驗發(fā)現(xiàn)Res能顯著抑制前列腺癌PC3和DU145細胞的增殖能力，且呈梯度濃度依賴性，與現(xiàn)有研究結果一致，提示Res具有一定抗前列腺癌作用。糖酵解途徑是腫瘤細胞能量代謝過程中的主要供能方式，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[13]。糖酵解不僅能為腫瘤細胞快速生長提供核酸、蛋白質、脂質等增殖、生長所需的營養(yǎng)，且其中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物均具有一定抗氧化、促轉移作用[14]。由于糖酵解在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此靶向糖酵解的治療策略有望為癌癥的治療帶來新的思路和機遇。類似于大多數(shù)實體瘤細胞，前列腺癌細胞活動所需的能量供應也主要依賴于有氧糖酵解。HK和PK是調節(jié)有氧糖酵解最關鍵的2個限速酶。研究發(fā)現(xiàn)抑制HK活性可降低有氧糖酵解水平，使癌細胞代謝方式由有氧糖酵解轉變?yōu)檠趸姿峄?，同樣發(fā)現(xiàn)抑制PK活性能促進有氧代謝取代糖酵解，提高腫瘤放、化療效果[15,16]。HK2是一種PK同工酶，是糖酵解途徑關鍵酶，與腫瘤相關性較高。國內外研究發(fā)現(xiàn)，抑制HK2活性可降低有氧糖酵解水平[17,18]。PKM2也是一種糖酵解途徑中關鍵的一種限速酶，其異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關，也是腫瘤治療的潛在靶點[19]。國內外研究發(fā)現(xiàn)，PKM2過表達可明顯增強有氧糖酵解，并促進腫瘤生長，而抑制PKM2抑制腫瘤細胞的有氧糖酵解及增殖能力，并促進細胞凋亡[19-21]。本研究結果顯示，Res可顯著抑制前列腺癌PC3和DU145細胞葡萄糖攝取能力以及乳酸產(chǎn)生量，表明其可抑制前列腺癌細胞的糖酵解作用。同時，加入Res后HK和PK的酶活性被顯著抑制，提示Res可能是通過抑制HK和PK活性阻斷前列腺癌細胞的糖酵解作用。此外，Res還可顯著抑制HK2和PKM2蛋白表達水平，證實Res確實可通過抑制前列腺癌細胞中糖酵解限速酶和關鍵蛋白HK2和PKM2表達，抑制前列腺癌細胞的糖酵解作用，從而發(fā)揮抗癌作用。

綜上所述，Res可能通過抑制HK2和PKM2的表達和糖酵解過程的限速酶活性，進而抑制前列腺癌細胞的糖酵解作用和增殖活性。目前關于Res的各種藥理學研究大多仍停留在體外實驗和基礎實驗，尚缺乏臨床試驗證據(jù)，因此Res應用于臨床仍需進一步研究的開展。