王 哲 韓前河 程傳宇

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的一種，生存預(yù)后較差[1]。近年來中國男性前列腺癌發(fā)病率逐漸升高，且高齡或轉(zhuǎn)移性患者比例較高，因而病死率較高[2]。在惡性腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞能量代謝重編程與細(xì)胞增殖、耐藥、局部浸潤、惡性轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)[3]。有氧糖酵解是腫瘤細(xì)胞獲取能量的重要手段，抑制有氧糖酵解阻斷腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)也是抗癌治療的有效策略之一[4]。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，具有多種生物學(xué)活性[5]。體內(nèi)體外研究表明Res對肺癌、肝癌及乳腺癌等多種癌細(xì)胞均具有一定抑制作用，可同時抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡并抑制其糖酵解過程[6]。目前關(guān)于Res對前列腺癌的抑制作用僅停留在影響細(xì)胞增殖層面[7]，關(guān)于Res對前列腺癌細(xì)胞糖酵解作用的影響結(jié)論不夠明確。本研究分析了Res對前列腺癌細(xì)胞糖酵解作用的影響，為Res作為抗前列腺癌藥物在臨床的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145購置于上海普諾賽生物公司；Res(≥99%，美國Sigma公司)；兔抗人己糖激酶2(Hexokinase 2，HK2)抗體；M2型丙酮酸激酶(M2 isoform pyruvate kinase，PKM2)抗體；3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)抗體(武漢Proteintech)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)PC3和DU145細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力將對數(shù)生長期的PC3和DU145細(xì)胞(1×104個/孔)接種于96 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(0、5、10、15、20、25、50 μmol/L)的Res，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μl 5 mg/ml四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液，避光孵育4 h。棄培養(yǎng)液，每孔中加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測取吸光度(OD)值，計算細(xì)胞存活率和IC50值。細(xì)胞存活率=實驗組OD均值/對照組OD均值×100%。

1.2.3 葡萄糖攝能力和乳酸分泌量檢測取對數(shù)生長期的PC3和DU145細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后采用Res處理48 h，并設(shè)置對照組。參照試劑盒說明書測定培養(yǎng)基中的葡萄糖和乳酸含量[8]。葡萄糖攝入量=(原培養(yǎng)液中的葡萄糖含量-處理組培養(yǎng)液中的葡萄糖含量)/細(xì)胞數(shù)目。乳酸分泌量=(處理組培養(yǎng)液中的乳酸含量-原培養(yǎng)液中的乳酸含量)/細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 HK和PK活性檢測將對數(shù)生長期的PC3和DU145細(xì)胞(1×104個/孔)接種于96 孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入Res處理48 h，并設(shè)置對照組。處理結(jié)束后，離心收集細(xì)胞沉淀，加入提取液，超聲破碎，4 ℃離心10 min，取上清，采用己糖激酶(Hexokinase，HK)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)檢測酶活性。

1.2.5 Western blot檢測HK 2 PKM 2蛋白表達(dá)將對數(shù)生長期的PC3和DU145細(xì)胞(1×104個/孔)接種于96孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后加入Res處理48 h，并設(shè)置對照組。處理結(jié)束后，離心收集細(xì)胞沉淀，采用細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取蛋白，并使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取25 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入HK2、PKM2和GAPDH(1∶1000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光成像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Res對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響采用梯度濃度的Res(0、5、10、15、20、25、50 μmol/L)分別作用PC3和DU145細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著Res濃度升高，PC3和DU145細(xì)胞存活率逐漸降低。Res作用于PC3和DU145細(xì)胞48 h的IC50值分別為23.36 μmol/L和28.47 μmol/L，因此選用25 μmol/L的Res進(jìn)行后續(xù)實驗。與0 μmol/L Res處理PC3細(xì)胞比較，P<0.05；與0 μmol/L Res處理DU145細(xì)胞比較，P<0.05。見圖1。

圖1 Res對PC3和DU145細(xì)胞存活率的影響

2.2 Res對前列腺癌細(xì)胞葡萄糖攝取能力及乳酸分泌量的影響與對照組比較，Res組PC3和DU145細(xì)胞的葡萄糖攝取能力及乳酸分泌量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，P<0.05。見圖2。

圖2 Res對PC3和DU145細(xì)胞葡萄糖攝取能力及乳酸分泌量的影響

2.3 Res對糖酵解關(guān)鍵酶酶活性的影響與對照組比較，Res組PC3和DU145細(xì)胞中HK和PK的活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，P<0.05。見圖3。

圖3 Res對PC3和DU145細(xì)胞HK和PK的活性的影響

2.4 Res對糖酵解關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)的影響Western Blot結(jié)果顯示，與對照組比較，Res組PC3和DU145細(xì)胞中HK2和PKM2蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，P<0.05。見圖4。

圖4 Res對PC3和DU145細(xì)胞HK2和PKM2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，由于其發(fā)病和進(jìn)展機制復(fù)雜，目前尚未有徹底有效的治療方法，因此研究和開發(fā)新的藥物方案尤為重要[9]。Res是一種天然的多酚類化合物，被證實具有抗炎、抑制血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)作用等多種生物學(xué)作用，且有一定抗腫瘤效用[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)Res對前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145的增殖具有明顯抑制作用[11,12]。本研究采用MTT實驗發(fā)現(xiàn)Res能顯著抑制前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞的增殖能力，且呈梯度濃度依賴性，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，提示Res具有一定抗前列腺癌作用。糖酵解途徑是腫瘤細(xì)胞能量代謝過程中的主要供能方式，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。糖酵解不僅能為腫瘤細(xì)胞快速生長提供核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等增殖、生長所需的營養(yǎng)，且其中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物均具有一定抗氧化、促轉(zhuǎn)移作用[14]。由于糖酵解在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，因此靶向糖酵解的治療策略有望為癌癥的治療帶來新的思路和機遇。類似于大多數(shù)實體瘤細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞活動所需的能量供應(yīng)也主要依賴于有氧糖酵解。HK和PK是調(diào)節(jié)有氧糖酵解最關(guān)鍵的2個限速酶。研究發(fā)現(xiàn)抑制HK活性可降低有氧糖酵解水平，使癌細(xì)胞代謝方式由有氧糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄?，同樣發(fā)現(xiàn)抑制PK活性能促進(jìn)有氧代謝取代糖酵解，提高腫瘤放、化療效果[15,16]。HK2是一種PK同工酶，是糖酵解途徑關(guān)鍵酶，與腫瘤相關(guān)性較高。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，抑制HK2活性可降低有氧糖酵解水平[17,18]。PKM2也是一種糖酵解途徑中關(guān)鍵的一種限速酶，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，也是腫瘤治療的潛在靶點[19]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，PKM2過表達(dá)可明顯增強有氧糖酵解，并促進(jìn)腫瘤生長，而抑制PKM2抑制腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解及增殖能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-21]。本研究結(jié)果顯示，Res可顯著抑制前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞葡萄糖攝取能力以及乳酸產(chǎn)生量，表明其可抑制前列腺癌細(xì)胞的糖酵解作用。同時，加入Res后HK和PK的酶活性被顯著抑制，提示Res可能是通過抑制HK和PK活性阻斷前列腺癌細(xì)胞的糖酵解作用。此外，Res還可顯著抑制HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平，證實Res確實可通過抑制前列腺癌細(xì)胞中糖酵解限速酶和關(guān)鍵蛋白HK2和PKM2表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的糖酵解作用，從而發(fā)揮抗癌作用。

綜上所述，Res可能通過抑制HK2和PKM2的表達(dá)和糖酵解過程的限速酶活性，進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的糖酵解作用和增殖活性。目前關(guān)于Res的各種藥理學(xué)研究大多仍停留在體外實驗和基礎(chǔ)實驗，尚缺乏臨床試驗證據(jù)，因此Res應(yīng)用于臨床仍需進(jìn)一步研究的開展。