王燦，司文騰

(鄭州市骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

內(nèi)生軟骨瘤病是正常軟骨內(nèi)成骨障礙導(dǎo)致的一種發(fā)育異常，以長骨干骺端圓形或柱狀軟骨性腫塊為主要病理特征。該病較為罕見，多發(fā)生于兒童和青少年。目前，內(nèi)生軟骨瘤病的病因尚未明確，可能與胚胎期遺留的骨骼內(nèi)成軟骨細(xì)胞未正常發(fā)育成熟有關(guān)[1]。內(nèi)生軟骨瘤病尚無特效治療方法，新型靶向治療藥物的研發(fā)成為研究的主要方向[2-3]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種誘導(dǎo)酶，與前列腺素的合成關(guān)系密切，在炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在膜內(nèi)成骨以及軟骨內(nèi)成骨過程中發(fā)揮重要作用[7-9]。為了進(jìn)一步探討COX-2與軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟的相關(guān)機(jī)制，我們開展了此項(xiàng)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料SV40病毒大T抗原介導(dǎo)永生化小鼠軟骨細(xì)胞(mouse chondrocytes immortalized by SV40 large T antigen，MCT)由北京中源合聚生物科技公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，免疫熒光染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，TRIzol試劑(美國Life Technologies公司)，外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、實(shí)時定量PCR SYBR PRemix EX Taq試劑盒、羊抗兔COX-2一抗(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，山羊抗鼠膠原蛋白α-1(X)[Collagen alpha-1(X)chain，COL10A1]一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記免疫球蛋白G二抗(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，COX-2抑制劑NS-398(美國APExBIO公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)，超凈工作臺(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，熒光半定量PCR儀、蛋白電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國GENE公司)。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1分析溫度對MCT發(fā)育成熟的影響 分別于2塊6孔板中加入等量的含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，取等量的MCT接種于培養(yǎng)基中，放置于溫度32 ℃、CO2濃度8%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待MCT匯合率至80%時，將1塊6孔板繼續(xù)在溫度 32 ℃、CO2濃度8%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)(32 ℃培養(yǎng)組)，將另1塊6孔板放置于溫度37 ℃、CO2濃度8%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)(37 ℃培養(yǎng)組)；每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)72 h后，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入胰蛋白酶消化后收集MCT；采用SP法進(jìn)行染色后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用CIAS大恒細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測量細(xì)胞長徑、短徑，計(jì)算細(xì)胞體積[10]；每個復(fù)孔隨機(jī)選取4個視野，每個視野下隨機(jī)測定20個細(xì)胞的數(shù)據(jù)。分別提取各復(fù)孔中MCT的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用實(shí)時定量PCR檢測MCT中COX-2、COL10A1的mRNA表達(dá)水平；提取各復(fù)孔中MCT的總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測MCT中COX-2、COL10A1的蛋白表達(dá)水平。

2.1.2篩選NS-398的最佳抑制濃度 取一定量的MCT接種與6孔板內(nèi)，于溫度32 ℃、CO2濃度8%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率至80%時，按照NS-398終濃度為0.2 μmol·L-1、1 μmol·L-1、2 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、25 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1、60 μmol·L-1將MCT分為10個干預(yù)組，分別加入等體積不同濃度的NS-398，空白對照組加入等體積的二甲亞砜?？瞻讓φ占懊總€濃度梯度各做1塊6孔板(6個復(fù)孔)。將6孔板置于溫度37 ℃、CO2濃度8%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，提取各復(fù)孔中MCT的RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用實(shí)時定量PCR檢測MCT中COX-2的mRNA表達(dá)量，比較和篩選NS-398抑制MCT中COX-2表達(dá)的最佳濃度。

2.1.3分析NS-398最佳抑制濃度對MCT發(fā)育成熟的影響 以2.1.2中NS-398最低濃度為對照，分析NS-398最佳抑制濃度對MCT發(fā)育成熟的影響。取一定量的MCT接種于6孔板內(nèi)，于溫度32 ℃、CO2濃度8%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率至80%時，按照NS-398終濃度為0.2 μmol·L-1、40 μmol·L-1將MCT分為0.2 μmol·L-1NS-398干預(yù)組和40 μmol·L-1NS-398干預(yù)組，分別加入等體積不同濃度的NS-398，每組各做1塊6孔板(6個復(fù)孔)。將6孔板置于溫度37 ℃、CO2濃度8%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，采用2.1.1中方法測定MCT的細(xì)胞體積，檢測MCT中COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2種不同溫度培養(yǎng)組MCT細(xì)胞體積及COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表達(dá)量的組間比較均采用t檢驗(yàn)；11種NS-398濃度組MCT中COX-2的mRNA表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗(yàn)；COX-2 mRNA表達(dá)量、COL10A1 mRNA表達(dá)量與MCT細(xì)胞體積的相關(guān)性分析采用Person相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 溫度對MCT發(fā)育成熟影響的分析結(jié)果32 ℃培養(yǎng)組MCT表現(xiàn)為持續(xù)增殖狀態(tài)，37 ℃培養(yǎng)組MCT表現(xiàn)肥大狀態(tài)(圖1)。37 ℃培養(yǎng)組MCT細(xì)胞體積大于32 ℃培養(yǎng)組[(2 336.19±24.69)μm3，(1 195.27±13.28)μm3，t=70.488，P=0.000]，COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表達(dá)量均高于32 ℃培養(yǎng)組(表1)。

圖1 培養(yǎng)72 h后2組SV40病毒大T抗原介導(dǎo)永生化小鼠軟骨細(xì)胞免疫組化染色圖片(×100)

表1 培養(yǎng)72 h后2組SV40病毒大T抗原介導(dǎo)永生化小鼠軟骨細(xì)胞環(huán)氧合酶-2、膠原蛋白α-1(X)mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果

3.2 NS-398最佳抑制濃度的篩選結(jié)果37 ℃下培養(yǎng)24 h后，11組MCT中COX-2的mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.074，P=0.000)。40 μmol·L-1-398干預(yù)組MCT中COX-2的mRNA表達(dá)量低于對照組和其他濃度NS-398干預(yù)組(P=0.001，P=0.001，P=0.001，P=0.001，P=0.002，P=0.001，P=0.001，P=0.001，P=0.001，P=0.001)。見表2。

表2 37 ℃下培養(yǎng)24 h后11組SV40病毒大T抗原介導(dǎo)永生化小鼠軟骨細(xì)胞環(huán)氧合酶-2 mRNA表達(dá)結(jié)果

3.3 NS-398最佳抑制濃度對MCT發(fā)育成熟影響的分析結(jié)果培養(yǎng)72 h后，40 μmol·L-1NS-398干預(yù)組MCT細(xì)胞體積大于0.2 μmol·L-1NS-398干預(yù)組[(995.64±10.98)μm3，(2 011.07±20.52)μm3，t=70.488，P=0.000]，COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表達(dá)量均低于0.2 μmol·L-1NS-398干預(yù)組(表3)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，COX-2 mRNA表達(dá)量與COL10A1 mRNA表達(dá)量、COX-2 mRNA表達(dá)量與MCT細(xì)胞體積、COL10A1 mRNA表達(dá)量與MCT細(xì)胞體積均呈正相關(guān)(r=0.552，P=0.011；r=0.658，P=0.001；r=0.590，P=0.003)。

表3 NS-398干預(yù)下培養(yǎng)72 h后2組SV40病毒大T抗原介導(dǎo)永生化小鼠軟骨細(xì)胞環(huán)氧合酶-2、膠原蛋白α-1(X)mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果

4 討 論

COX-2是前列腺素合成過程中的一個重要限速酶，介導(dǎo)炎癥因子、血管內(nèi)皮生長因子的生成與釋放，與關(guān)節(jié)炎性病變相關(guān)[11]。徐永明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在力學(xué)誘導(dǎo)的大鼠終板軟骨細(xì)胞退變模型中高表達(dá)。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn)，COX-2基因缺失型小鼠在骨折愈合過程中表現(xiàn)出明顯的修復(fù)障礙，認(rèn)為COX-2與骨折愈合存在顯著的相關(guān)性。骨折愈合過程涉及的膜內(nèi)成骨與軟骨內(nèi)成骨在機(jī)制上類似[14]。隨著COX-2抑制劑被發(fā)現(xiàn)，探究COX-2與骨關(guān)節(jié)疾病的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)[15]。張先啟[16]研究發(fā)現(xiàn)，抑制COX-2的表達(dá)能夠通過調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)抑制軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟。Li等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，抑制COX-2的活性能夠有效降低骨折愈合過程中軟骨內(nèi)成骨的速度。然而，目前對于COX-2與軟骨細(xì)胞發(fā)成熟的機(jī)制尚未完全明確。

COL10A1在肥大型軟骨細(xì)胞中特異性高表達(dá)，COL10A1表達(dá)與軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟關(guān)系密切[18-19]。李娜[20]研究發(fā)現(xiàn)，COL10A1表達(dá)上調(diào)與體外軟骨內(nèi)成骨細(xì)胞模型中軟骨細(xì)胞肥大相關(guān)。多項(xiàng)研究[21-23]發(fā)現(xiàn)，COL10A1是正常軟骨內(nèi)成骨過程中肥大型軟骨細(xì)胞的重要標(biāo)志基因，而COX-2是COL10A1基因的候選調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。本研究顯示，MCT在32 ℃下培養(yǎng)表現(xiàn)為增殖狀態(tài)，在37 ℃下培養(yǎng)表現(xiàn)為肥大狀態(tài)，37 ℃培養(yǎng)組MCT中COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表達(dá)量均高于32 ℃培養(yǎng)組，提示肥大狀態(tài)下的MCT中COX-2和COL10A1的表達(dá)均升高。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，COX-2 mRNA表達(dá)、COL10A1 mRNA表達(dá)及細(xì)胞體積之間均呈正相關(guān)；提示COX-2和COL10A1均參與了MCT的發(fā)育成熟。我們通過設(shè)計(jì)NS-398藥物濃度梯度實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NS-398終濃度為40 μmol·L-1時，MCT中COX-2的mRNA表達(dá)量最低，提示該濃度下NS-398對COX-2的抑制作用最強(qiáng)。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在37 ℃下，NS-398最佳抑制濃度能夠顯著抑制MCT中COX-2的mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)COL10A1的mRNA和蛋白表達(dá)，且能同時抑制細(xì)胞的發(fā)育成熟。

本研究結(jié)果表明，抑制COX-2表達(dá)能夠抑制軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟，其作用機(jī)制與COL10A1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。但本研究僅探究了COX-2與COL10A1的關(guān)系，尚未納入細(xì)胞成熟發(fā)育過程中的其他基因。因此，COX-2與軟骨細(xì)胞發(fā)育成熟的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。