白艷梅，張立佳，汪 洋，劉麗君，謝瑞龍，段建華，李翠枝

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

隨著工業(yè)化的發(fā)展，越來越多的化學(xué)合成物產(chǎn)生，這些化學(xué)物質(zhì)給人類帶來方便的同時也會造成不可忽視的傷害。最近幾年備受關(guān)注的環(huán)境污染物壬基酚是洗滌劑、紡織產(chǎn)品、皮革涂飾和包裝材料中常見的化工原料。研究發(fā)現(xiàn)，壬基酚也是一種具有擬雌激素作用的環(huán)境污染物，不易降解，長期暴露在自然環(huán)境中可通過食物鏈進入人體，擾亂機體激素分泌，可導(dǎo)致人類性早熟及免疫力下降等，尤其是對剛發(fā)育的嬰幼兒更加明顯[1-2]。而最新研究發(fā)現(xiàn)，大鼠暴露于壬基酚環(huán)境中可增強肝臟、腎臟和心臟功能的損傷[3-4]。乳粉是嬰幼兒的主要食物來源，乳粉安全對嬰幼兒健康至關(guān)重要。食品及食品包裝材料中禁止添加壬基酚，但乳粉的加工、運輸、包裝等各環(huán)節(jié)可能存在壬基酚污染的風(fēng)險[5-8]。近幾年壬基酚被各國列為環(huán)境污染物，并出臺嚴(yán)格的管控標(biāo)準(zhǔn)，美國國家環(huán)保局推薦，淡水中壬基酚的含量不應(yīng)高于6.6 μg/L，咸水中不應(yīng)高于1.7 μg/L，目前我國食品中尚無限量標(biāo)準(zhǔn)。壬基酚作為環(huán)境污染物，容易引起食品安全風(fēng)險，威脅著人民的身體健康，作為乳品企業(yè)，為保障人民的飲食健康，需制定嚴(yán)格的質(zhì)量體系，監(jiān)控每個環(huán)節(jié)，降低食品安全風(fēng)險。雖然針對壬基酚的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險相關(guān)研究較多，但國內(nèi)沒有可依據(jù)的乳制品相關(guān)國家檢測標(biāo)準(zhǔn)。2014年食藥監(jiān)食監(jiān)三便函[2014]73號通知《國家食品安全監(jiān)督抽檢和風(fēng)險監(jiān)測》針對嬰幼兒食品及食用植物油等食品指定了檢驗方法，該方法使用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法凈化處理，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該方法對乳粉中包埋在內(nèi)部的壬基酚提取效率較低。2019年國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布食品補充檢驗方法BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質(zhì)的測定》，該方法采用塑料材質(zhì)的固相萃取柱，具有本底污染嚴(yán)重、穩(wěn)定性差等相關(guān)問題[9]。因此，亟需建立一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定的乳粉中壬基酚檢測方法。

壬基酚殘留的檢測方法主要為氣相色譜-質(zhì)譜法[10-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-16]等，檢測對象主要為包裝材料[17-20]、食品和環(huán)境水[21-23]等，其中氣相色譜-質(zhì)譜法對目標(biāo)物進行衍生化處理，衍生化方法過程繁瑣，前處理時間長，限制了該方法的使用。液相色譜-質(zhì)譜法在大氣壓條件下電離，對目標(biāo)物進行準(zhǔn)確分析，靈敏度高、檢測時間短，是目前檢測壬基酚的常用方法。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，檢測乳粉中壬基酚的文獻較多，如直接提取上機檢測、有機試劑提取后凝膠色譜法除脂、冷凍除脂、塑料固相萃取柱除脂[24-28]等。直接提取法快速、簡單但本底值高，基質(zhì)效應(yīng)強，污染檢測儀器。凝膠色譜法除脂試劑消耗量大，檢測成本高。冷凍除脂法耗時且除脂效果不明顯。采用塑料固相萃取柱存在壬基酚溶出風(fēng)險，導(dǎo)致本底值高，影響定量結(jié)果。本研究通過乳粉質(zhì)控樣進行方法準(zhǔn)確性評價，解決了現(xiàn)行方法乳粉基質(zhì)中壬基酚提取效率差、前處理流程復(fù)雜、操作時間長、有機試劑消耗量大、凈化設(shè)備昂貴等不足。本研究建立一種使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乳粉中壬基酚的方法，對乳粉中的壬基酚殘留量進行檢測，為乳粉產(chǎn)品風(fēng)險管控提供有力技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉為市場隨機抽取的6 種乳粉；質(zhì)控樣為內(nèi)蒙古伊利集團自主制備，壬基酚理論添加量33.36、300.00 μg/kg，每個添加量6 份。

二氯甲烷（色譜純）、甲醇（液相色譜-質(zhì)譜級）、乙腈（液相色譜-質(zhì)譜級） 上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉（分析純） 天津福晨化學(xué)試劑有限公司；4-壬基酚（純度100%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；3,6,3-壬基酚-13C6內(nèi)標(biāo)（純度100%） 默克化學(xué)試劑公司；水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水；ProElut PAEs Glass固相萃取柱（500 mg，6 mL） 迪馬科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 6500高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（配備電噴霧電離源） 美國AB Sciex公司；AL204分析天平（感量0.01 mg/0.1 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司；KQ-300DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；渦旋振蕩器 德國IKA公司；Thermo冷凍離心機美國賽默飛公司；Biotage氮吹儀 瑞典拜泰齊公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取1 g試樣（精確到0.1 mg），置于40 mL玻璃離心管中，加入3 mL 40～50 ℃溫水將其充分溶解，準(zhǔn)確加入100 μL 1 μg/mL 3,6,3-壬基酚-13C6內(nèi)標(biāo)中間液混勻，靜置10 min，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，添加2 g氯化鈉，渦旋振蕩5 min使其充分混勻。超聲提取15 min后，0～4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液，待凈化。

1.3.2 固相萃取凈化

依次用6 mL二氯甲烷和6 mL乙腈活化固相萃取柱，取1.3.1節(jié)的上清液5 mL轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，自然流干，再用4 mL乙腈淋洗固相萃取柱，抽干，收集全部流出液置于玻璃離心管中，在40 ℃水浴下氮氣吹干，1 mL甲醇復(fù)溶，0～4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液上機分析。

實驗中所用的器具均為玻璃材質(zhì)，使用前用馬弗爐400 ℃烘烤4 h。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）或其他等效柱；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫40 ℃；流動相A：超純水，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.4 質(zhì)譜分析條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測；離子化電壓-4 500 V；離子源溫度500 ℃；輔助加熱器壓力50 psi（345 kPa）；噴霧氣壓力50 psi（345 kPa）。離子采集參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

稱取壬基酚10 mg，甲醇定容并稀釋為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃保存。再將100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋至1 μg/mL，得壬基酚外標(biāo)中間工作液，0～8 ℃保存，有效期3 個月。

精密量取3,6,3-壬基酚-13C6儲備液1 mL，置于100 mL容量瓶，甲醇稀釋、定容，得1 μg/mL壬基酚內(nèi)標(biāo)中間工作液，0～8 ℃保存，有效期3 個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取壬基酚中間工作液（1 μg/mL）適量，加入同位素內(nèi)標(biāo)中間工作液（1 μg/mL），逐級稀釋得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、40、80、100、200 ng/mL，質(zhì)量濃度由低到高進行檢測，以外標(biāo)定量離子峰面積/內(nèi)標(biāo)離子峰面積-質(zhì)量濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.3.6 結(jié)果計算

試樣中壬基酚的含量按下式計算。

式中：X為試樣中壬基酚殘留量/（μg/kg）；ρ為試樣上機溶液中壬基酚殘留量/（ng/mL）；ρ0為空白實驗中壬基酚殘留量/（ng/mL）；V為樣液最終定容體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀Analyst工作站軟件對壬基酚進行定性及定量分析，Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加水量的優(yōu)化

稱取1.0 g乳粉質(zhì)控樣（壬基酚含量300 μg/kg）各4 份，分別加入0、2、3、4 mL水，均加入10 mL乙腈，比較提取率。由圖1可知，質(zhì)控樣采用乙腈直接提取的提取率較低，為40%～60%，隨著水的加入，提取率呈上升趨勢，加水量3、4 mL時提取率均達到100%左右，最終選擇加水3 mL溶解。實驗證明，加水后乳粉中的壬基酚更容易被乙腈溶劑提取，主要原因為乳粉為干性樣品，加水后能使其充分溶解分散，加上乙腈的沉淀蛋白作用，使提取率明顯提升。為了提高結(jié)果準(zhǔn)確度，選擇加水3 mL溶解后再進行提取。

圖1 加水量對提取率的影響（n=6）Fig.1 Effect of the amount of added water on the extraction efficiency of nonylphenol (n = 6)

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

加標(biāo)回收率是實驗室在分析檢測過程中常用的一種質(zhì)量控制方式，當(dāng)加標(biāo)回收率在一定范圍時，表明該分析方法適用[29]。取空白基質(zhì)乳粉加入壬基酚標(biāo)準(zhǔn)工作液，壬基酚添加量為10 μg/kg，分別用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）和乙腈提取后比較加標(biāo)回收率。由表3可知，基質(zhì)加標(biāo)后分別用乙酸乙酯-環(huán)己烷和乙腈進行提取，加標(biāo)回收率沒有明顯差異，均符合國標(biāo)規(guī)定。

表3 壬基酚加標(biāo)回收率比較（n=6）Table 3 Effect of extraction solvents on the recovery of nonylphenol (n = 6)

另取已知添加量的低、高濃度壬基酚乳粉質(zhì)控樣，分別選擇乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）和乙腈2 種溶劑提取，比較質(zhì)控樣實際提取量。由表4可知，用乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液和乙腈提取質(zhì)控樣，壬基酚測定結(jié)果差異較大，乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液提取目標(biāo)物效果較差，而乙腈提取效果明顯改善。

表4 質(zhì)控樣提取率比較Table 4 Comparison of extraction efficiencies of different solvents for nonylphenol from quality control sample

乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液提取率低的原因為主要檢測游離態(tài)壬基酚，對乳粉包埋壬基酚提取效果較差。而當(dāng)乙腈作為提取溶劑時，在有效提取目標(biāo)物的同時具有沉淀蛋白的作用，對游離態(tài)壬基酚與包埋壬基酚提取效果均較優(yōu)，綜合考慮選用乙腈作為提取溶劑。

2.3 氯化鈉添加量的選擇

采用PAEs固相萃取柱，由于填料含硅膠，水會影響固相萃取柱的柱效，凈化時需控制水量。利用氯化鈉在乙腈中的溶解能力弱及易溶于水的性能，可以使兩相分層，同時減少目標(biāo)物在水中的溶解。稱取1 g質(zhì)控樣（壬基酚含量300 μg/kg），加入3.0 mL水溶解，加入10 mL乙腈提取，加入不同質(zhì)量的氯化鈉（0、2、3、4 g），其余操作不變，比較提取效果。由圖2可知，由于氯化鈉的加入使乙腈層與水層分離明顯，且壬基酚更完全地溶于乙腈層中，提高了提取效率。不加氯化鈉時，壬基酚測定值為250 μg/kg，氯化鈉添加量2、3 g時壬基酚提取效率明顯提升。綜合考慮，為了提高壬基酚測定結(jié)果準(zhǔn)確度，選擇氯化鈉添加量2 g進行測定。

圖2 氯化鈉添加量對提取率的影響（n=6）Fig.2 Effect of the amount of added sodium chloride on the extraction efficiency of nonylphenol (n = 6)

2.4 凈化條件的優(yōu)化

通過陰性樣品加標(biāo)和乳粉質(zhì)控樣，考察PAEs玻璃固相萃取柱（PSA/硅膠串聯(lián)，500 mg，6 mL）、炭黑固相萃取柱（Carbon，500 mg，6 mL）、聚苯乙烯-二乙烯基苯固相萃取柱（HLB，500 mg，6 mL）3 種固相萃取柱對結(jié)果的影響。由表5可知：HLB和Carbon固相萃取柱本底含量超過定量限（5.0 μg/kg），影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，而PAEs柱低于檢出限（1 ng/mL）；PAEs固相萃取柱加標(biāo)回收率和質(zhì)控樣回收率均為100%。HLB和Carbon固相萃取柱回收率和質(zhì)控樣回收率較低。為了提高方法的準(zhǔn)確度，綜合考慮，選擇PAEs玻璃固相萃取柱進行前處理。

表5 3 種固相萃取柱的比較Table 5 Comparison of purification efficiencies of three kinds of solid phase extraction column

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

由表6可知，本方法的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99，乳粉中壬基酚的定量限為5.0 μg/kg，滿足信噪比（RS/N）≥10的要求。

表6 壬基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限Table 6 Standard curve, limit of detection and limit of quantification for nonylphenol

2.5.2 方法的加標(biāo)回收率和精密度

選取不含壬基酚的基質(zhì)樣品進行加標(biāo)回收率實驗，分別添加5、40、300 μg/kg共3 個水平的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)水平做6 次平行實驗。由表7可知，壬基酚的加標(biāo)回收率為81.10%～107.39%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97%～9.73%，說明該方法測定乳粉中壬基酚殘留時具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表7 壬基酚的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n =6）Table 7 Recoveries and RSDs of nonylphenol from spiked sample (n = 6)

2.6 實際樣品中壬基酚的測定

取市售的多品牌乳粉進行分析，樣本數(shù)量40 個，壬基酚含量均小于5 μg/kg，表明目前大部分乳粉企業(yè)對工藝、運輸及包裝材料的控制非常嚴(yán)格，消費者可放心食用。

3 結(jié) 論

采用質(zhì)控樣進行檢測方法的準(zhǔn)確度評價，優(yōu)化提取試劑和凈化條件，提升了準(zhǔn)確度和檢測效率，采用同位素內(nèi)標(biāo)法建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳粉中壬基酚的定量檢測方法。結(jié)果表明，乳粉中壬基酚添加量5～300 μg/kg時，加標(biāo)回收率為81.10%～107.39%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97%～9.73%，此方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。采用簡單的固相萃取柱替換傳統(tǒng)的凝膠色譜儀等昂貴的前處理設(shè)備，解決了乳粉基質(zhì)中壬基酚提取率低的難題，前處理簡單、節(jié)約成本、靈敏度高，適用于乳粉基質(zhì)中的檢測，為乳制品企業(yè)食品安全風(fēng)險監(jiān)測提供了技術(shù)保障。