王宏坤 鄭沛鳴 鄭繪霞

乳腺癌是全球發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，在我國每年約有30 萬人確診乳腺癌，而因乳腺癌死亡人數(shù)超過7 萬人，死亡原因?yàn)榘l(fā)生侵襲、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或并發(fā)癥等。乳腺癌具有腫瘤類型多樣性及異質(zhì)性的特點(diǎn)，雖然目前已有多種治療手段，如針對(duì)HER-2 靶向藥赫賽?。℉erceptin），但HER-2 陽性患者預(yù)后較差，有些患者即使應(yīng)用赫賽汀治療，效果并不理想。而相比HER-2 陽性乳腺癌，三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）則是預(yù)后最差的乳腺癌類型，目前為止尚無能夠針對(duì)性治療TNBC 的靶向藥物，因此有必要探索乳腺癌新的治療靶點(diǎn)和/或預(yù)后分子生物標(biāo)志物，改善其在治療及預(yù)后評(píng)估方面的不足。本研究旨在通過對(duì)TCGA、CPTAC 及HPA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，探討上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2（Epithelial cell transforming sequence 2，ECT2）在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源通過訪問TCGA 數(shù)據(jù)庫門戶網(wǎng)站cBioPortal（http://www.cbioportal.org）分析乳腺癌差異表達(dá)基因，訪問HPA 網(wǎng)站（https://www.proteinatlas.org）分析ECT2 蛋白表達(dá)相關(guān)數(shù)據(jù)，訪問UALCAN 網(wǎng)站（http://ualcan.path.uab.edu）分析CPTAC 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫和TCGA 數(shù)據(jù)庫中ECT2 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，訪問GEPIA2 工具網(wǎng)站（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）及Kaplan-Meier Plotter工具網(wǎng)站（https://kmplot.com/analysis）分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中ECT2 表達(dá)與乳腺癌生存期的關(guān)系。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

1.2.1 cBioPortal 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫 在cBioPortal主頁選擇乳腺癌TCGA 數(shù)據(jù)庫，選擇mRNA 得到乳腺癌火山圖，找到ECT2 并標(biāo)注，再次輸入ECT2 后供本研究使用樣本有996 例（帶有突變和CNA 數(shù)據(jù)），找到癌基因圖譜（Oncoprint），應(yīng)用自帶GISTIC分析其基因拷貝數(shù)改變并下載相關(guān)結(jié)果圖。

1.2.2 UALCAN 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫 在UALCAN 主頁面選擇乳腺癌（第二次選擇TNBC），在250 個(gè)常見基因中找到有ECT2 的熱圖，點(diǎn)擊ECT2 得到ECT2在乳腺癌與正常組織中對(duì)照的表達(dá)圖，下載相應(yīng)結(jié)果圖。點(diǎn)擊下方菜單直接鏈接到CPTAC 數(shù)據(jù)庫，分析ECT2 蛋白在乳腺癌中的表達(dá)情況，下載結(jié)果圖，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 HPA 數(shù)據(jù)庫分析ECT2 表達(dá) 打開HPA 主頁，搜索框輸入ECT2，找到ECT2 在正常組織和乳腺癌中的表達(dá)情況，下載相關(guān)結(jié)果圖。

1.2.4 GEPIA2 和Kaplan-Meier Plotter 分 析TCGA 數(shù) 據(jù)庫中ECT2 表達(dá)與乳腺癌生存期的關(guān)系 在GEPIA2和Kaplan-Meier Plotter 分析網(wǎng)站，找到Survival Analysis，輸入ECT2，調(diào)整參數(shù)，下載Kaplan-Meier生存曲線圖，包括總生存期（Overall survival，OS）和無病生存期（Disease-free survival，DFS）。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中差異表達(dá)基因分析cBioPortal 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中乳腺癌差異表達(dá)基因共19 701個(gè)，高表達(dá)基因3 394 個(gè)，其中有意義的基因1 445個(gè)，將P 值由低到高排序，前20 個(gè)基因分別為ACTL6A、PDCD10、NFIL3、FNDC3B、MRPL47、MYNN、KPNA4、USB1、YEATS2、TES、PSAT1、CBX2、ECT2、NDUFB5、MFN1、GCNT2、TFRC、ATP11B、DESI2、MSANTD3，通過查閱文獻(xiàn)，篩選出第13 個(gè)基因ECT2 有較多樣本例數(shù)及文獻(xiàn)支撐，具有一定的研究價(jià)值，由圖1A 可見ECT2 在乳腺癌中的表達(dá)差異明顯。ECT2 基因三維立體圖及結(jié)構(gòu)域分布圖（見圖1B、C）顯示目前其突變位點(diǎn)較少，僅有3 處錯(cuò)義突變和2 處截?cái)嗤蛔?。GISTIC 分析結(jié)果顯示，ECT2 改變以擴(kuò)增為主（見圖1D），其中34 例發(fā)生改變，發(fā)生率為3.4%（34/996）。對(duì)發(fā)生改變與未發(fā)生改變ECT2 mRNA 表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示二者之間比較有顯著性差異（P＜0.001），見圖1E。分析不同類型乳腺癌ECT2基因突變情況（見圖1F），結(jié)果顯示乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中擴(kuò)增和獲得頻率最高，其余類型較低，依次為乳腺浸潤性小葉癌、乳腺浸潤性癌、乳腺浸潤性混合型黏液癌、浸潤性乳頭狀癌、化生性乳腺癌。

圖1 乳腺癌差異表達(dá)基因

2.2 ECT2 基因在乳腺癌中表達(dá)熱圖分析UALCAN分析熱圖顯示前250 個(gè)基因在乳腺癌中的表達(dá)，上部分為過表達(dá)基因熱圖，下部分為低表達(dá)基因熱圖，過表達(dá)基因熱圖中找到ECT2 表達(dá)的圖譜下載，然后再次打開TNBC 熱圖，找到ECT2 所在熱圖，見圖2A、B，圖中顏色由藍(lán)變紅，逐漸呈現(xiàn)過表達(dá)趨勢。從圖2C、D 中可知TNBC 樣本數(shù)高于HER-2陽性樣本數(shù)，而從顏色結(jié)果看，TNBC 樣本中ECT2表達(dá)陽性率高于HER-2 陽性樣本。

圖2 乳腺癌中ECT2 表達(dá)熱圖

2.3 HPA 數(shù)據(jù)庫分析ECT2 表達(dá)HPA 數(shù)據(jù)庫分析顯示ECT2 在大多數(shù)正常組織中均有不同程度的表達(dá)，包括腦皮質(zhì)、甲狀腺、消化道、肝膽胰、骨髓及免疫細(xì)胞（見圖3A），其中在正常乳腺組織中的平均表達(dá)量為11.8TPM；ECT2 在腫瘤中的表達(dá)主要見于肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌以及膠質(zhì)瘤和惡性黑色素瘤等（見圖3B），其中乳腺癌樣本1 075 例，平均表達(dá)量為9.3FPKM，但未顯示具體的乳腺癌亞型表達(dá)情況。

圖3 ECT2 在正常組織及泛癌中的表達(dá)情況

2.4 CPTAC 數(shù)據(jù)庫分析ECT2 蛋白在乳腺癌中的表達(dá)CPTAC 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫樣本例數(shù)較少，選擇正常組織18 例，原發(fā)乳腺癌125 例，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，ECT2 蛋白表達(dá)在兩者之間比較有顯著性差異（P＜0.001），見圖4A；125 例腫瘤組織中l(wèi)uminal 型64 例，HER-2 陽性型10 例，TNBC 型16 例，ECT2在這三種類型中的表達(dá)顯著高于正常組織，尤其在TNBC 中表達(dá)差異更顯著（P＜0.001），見圖4B；組織學(xué)分型比較結(jié)果顯示，僅浸潤性導(dǎo)管癌與正常組織比較有顯著性差異（P＜0.001），見圖4C，其他類型與正常組織比較無顯著性差異（P＞0.05）；乳腺癌分期比較結(jié)果顯示，樣本中未發(fā)現(xiàn)Ⅳ期患者，ECT2 在Ⅱ期和Ⅲ期中的表達(dá)顯著高于正常組織（P＜0.001），見圖4D，而Ⅰ期與正常組織比較無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 ECT2 蛋白在正常組織及乳腺癌中的表達(dá)

2.5 UALCAN 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中ECT2 在乳腺癌中的表達(dá)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ECT2 在114 例正常乳腺組織和1 097 例原發(fā)乳腺癌中比較，有顯著性差異（P＜0.001），見圖5A；1 097例中l(wèi)uminal 型566 例，HER-2 陽性型37 例，TNBC型116 例，這三種類型與正常組織ECT2 表達(dá)比較均有顯著性差異（P＜0.001），見圖5B；組織學(xué)亞型比較結(jié)果顯示，除例數(shù)較少的化生性癌和特殊類型癌外，其余亞型與正常組織比較均有顯著性差異（P＜0.001），見圖5C；由于ECT2 在TNBC 中表達(dá)較高，對(duì)TNBC 各亞型[基底樣亞型BL1 和BL2、免疫調(diào)節(jié)亞型（IM）、管腔雄激素受體亞型（LAR）、間充質(zhì)干細(xì)胞樣亞型（MSL）、間充質(zhì)亞型（M）以及不確定的亞型（UNS）]與正常組織中ECT2 表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示均有顯著性差異（P＜0.05），見圖5D。從臨床病理參數(shù)結(jié)果分析，ECT2 表達(dá)與年齡分布、絕經(jīng)期前后、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期均有關(guān)（P＜0.001），見圖5E～H。

圖5 ECT2 在正常組織及乳腺癌中的表達(dá)

2.6 ECT2 基因表達(dá)與乳腺癌生存期關(guān)系分析通過GEPIA2 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中ECT2 表達(dá)與乳腺癌生存期的關(guān)系，共1 070 例乳腺癌，將ECT2 表達(dá)分為高表達(dá)和低表達(dá)，并將數(shù)據(jù)整合，高、低表達(dá)的患者設(shè)為相同例數(shù)，均為535 例，由此得出OS 和DFS 曲線圖，結(jié)果顯示ECT2 表達(dá)與乳腺癌患者OS及DFS 均無相關(guān)性（P＞0.05），見圖6A、B。

圖6 ECT2 高表達(dá)及低表達(dá)乳腺癌患者生存曲線

經(jīng)過以上分析發(fā)現(xiàn)，生存曲線均有多個(gè)交叉，因此又采用Kaplan-Meier Plotter 網(wǎng)站再次進(jìn)行l(wèi)ogrank 檢驗(yàn)的生存分析，見圖7A、B。經(jīng)過log-rank檢驗(yàn)的生存曲線顯示，ECT2 基因表達(dá)與乳腺癌OS（ECT2 高表達(dá)939 例，低表達(dá)940 例）及DFS（ECT2高表達(dá)1382 例，低表達(dá)1383 例）均有關(guān)，ECT2 高表達(dá)患者生存期顯著縮短。

圖7 Log-rank 檢驗(yàn)ECT2 高表達(dá)及低表達(dá)乳腺癌患者生存曲線

3 討論

癌癥基因組圖譜（TCGA）是由美國國家癌癥研究所和國家人類基因組研究所共同合作的研究項(xiàng)目。TCGA 采用基因組測序技術(shù)，將人類全部癌癥的基因組變異圖譜繪制出來，用以全面評(píng)估系統(tǒng)探索人類癌癥所涉及的整個(gè)基因組變化譜的可行性。該項(xiàng)目對(duì)2 萬多種原發(fā)癌癥進(jìn)行了分子表征分析，并對(duì)常見的33 種癌癥類型匹配了正常對(duì)照。TCGA 數(shù)據(jù)庫樣本量大，數(shù)據(jù)質(zhì)量高，誤差小，組學(xué)豐富，每個(gè)腫瘤樣本均有全面的遺傳數(shù)據(jù)記錄，包括DNA 序列，轉(zhuǎn)錄信息（RNA-seq、基因芯片、小RNA-seq），表觀遺傳修飾（甲基化）及相關(guān)信息，是研究人類腫瘤的重要工具[1～3]。

HPA 是利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究人類不同組織和器官中的蛋白表達(dá)情況，在RNA和蛋白水平應(yīng)用免疫檢測技術(shù)（包括免疫印跡、免疫熒光和免疫組化-組織芯片）詳細(xì)檢測了每一種蛋白在48 種人類正常組織、20 種腫瘤組織和64 個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)情況，數(shù)據(jù)還在不斷更新中。目前已經(jīng)提供約2.6 萬種人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞數(shù)據(jù)。HPA 中的圖像注釋可以捕捉不同細(xì)胞系、組織或組織狀態(tài)下亞細(xì)胞位置的變化，應(yīng)用HPA 數(shù)據(jù)庫可以非常方便地查詢和研究蛋白編碼基因在正常組織/器官和腫瘤組織中的表達(dá)情況，也可以查詢基因在不同腫瘤樣品中的蛋白表達(dá)情況[4]，為研究基因蛋白在腫瘤中的表達(dá)提供了重要依據(jù)。

CPTAC 整合了基因組和蛋白組的數(shù)據(jù)，為從蛋白質(zhì)層面進(jìn)行探索和研究提供了豐富資源。它通過應(yīng)用大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)數(shù)據(jù)促進(jìn)對(duì)癌癥分子機(jī)制的了解，包括識(shí)別蛋白質(zhì)亞型、基因拷貝數(shù)的改變與蛋白質(zhì)豐度的關(guān)聯(lián)、蛋白翻譯后修飾及與其相關(guān)的信號(hào)通路等。CPTAC 主要以自行收集公開發(fā)表的蛋白質(zhì)組學(xué)測序數(shù)據(jù)和與其對(duì)應(yīng)的基因組學(xué)測序數(shù)據(jù)為主，還包括部分源自TCGA項(xiàng)目的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，其基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量技術(shù)可同時(shí)比較2～8 種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量或絕對(duì)含量。CPTAC 結(jié)合腫瘤與配對(duì)正常組織基因蛋白組學(xué)的整合分析，能夠進(jìn)一步闡明驅(qū)動(dòng)疾病表型的基因突變，清晰闡釋腫瘤病理生理學(xué)變化，為探索疾病個(gè)性化、精準(zhǔn)化的臨床治療策略提供依據(jù)[5，6]。

盡管多數(shù)乳腺癌患者尤其是TNBC 患者采取了多種治療策略，但仍有部分患者預(yù)后較差。越來越多的證據(jù)表明ECT2 在功能上是一種致癌因子，通過參與細(xì)胞周期的調(diào)控來促進(jìn)多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，包括乳腺癌[7～9]。本研究通過多數(shù)據(jù)庫多組學(xué)數(shù)據(jù)分析，篩選出ECT2 基因，從拷貝數(shù)變異、基因蛋白表達(dá)及生存分析等方面探索ECT2 在乳腺癌中的作用，為乳腺癌靶向治療及預(yù)后分子標(biāo)志物的研究提供思路，為深入研究ECT2 的作用機(jī)制及功能提供依據(jù)。cBioPortal 具有探索、可視化和分析多維度癌癥基因組數(shù)據(jù)的功能，整合了癌細(xì)胞系百科全書（Cancer cell line encyclopedia，CCLE）和TCGA的數(shù)據(jù)集，本研究選取TCGA 乳腺癌數(shù)據(jù)庫分析了乳腺癌差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示ECT2 基因拷貝數(shù)及mRNA 表達(dá)均存在顯著性差異，并且在浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)最高，主要以擴(kuò)增和獲得為主。隨后應(yīng)用UALCAN 網(wǎng)站選擇乳腺癌，找到前250 個(gè)基因中ECT2 的表達(dá)位置，并且與TNBC、其他乳腺癌類型及HER-2 陽性型進(jìn)行比較，結(jié)果顯示ECT2 在TNBC 中的表達(dá)顯著高于正常組織、其他乳腺癌類型以及HER-2 陽性型。以上兩種不同的分析方法均證明ECT2 為乳腺癌的差異表達(dá)基因，并且更傾向于在TNBC 中表達(dá)。對(duì)ECT2 在乳腺和其他組織中表達(dá)情況進(jìn)行比較，從HPA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果可知，ECT2 在大多數(shù)正常組織細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，在多種惡性腫瘤中同樣有不同程度的表達(dá)，如肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、頭頸部癌、卵巢癌、宮頸癌等，除在癌組織中廣泛表達(dá)外，在膠質(zhì)瘤及惡性黑色素瘤中也有不同程度的表達(dá)，在乳腺癌中其表達(dá)量居中，但未能顯示詳細(xì)的乳腺癌類型。研究顯示，ECT2 廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞中，包括小鼠胚胎組織、特發(fā)性肺纖維化的人肺上皮細(xì)胞、膽管癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及膠質(zhì)瘤等[10～14]。由此可見，ECT2 可能是胚胎發(fā)育過程中即存在的細(xì)胞因子，正常組織及腫瘤組織中均能檢測到ECT2表達(dá)，而其表達(dá)的高低可能決定了腫瘤的形成。提示這種內(nèi)源性ECT2 在腫瘤形成過程中具有非常關(guān)鍵的促進(jìn)作用。

經(jīng)過TCGA 和HPA 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證ECT2 在乳腺癌中的表達(dá)，本研究又對(duì)ECT2 表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析。首先從CPTAC 數(shù)據(jù)庫中分析ECT2 在乳腺癌中的表達(dá)，可知ECT2 在正常組織和乳腺癌中的表達(dá)有顯著性差異，而且與分子分型有關(guān)，ECT2 在TNBC 中的表達(dá)與正常組織比較差異更大，其次為Luminal 型和HER-2 型，也可能與例數(shù)較少有關(guān)；組織學(xué)分型中僅浸潤性導(dǎo)管癌與正常組織比較有差異，其余由于例數(shù)不足未發(fā)現(xiàn)差異性；腫瘤分期顯示Ⅱ、Ⅲ期ECT2 表達(dá)均高于正常組織。這些結(jié)果均提示ECT2 表達(dá)對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的作用。由于CPTAC 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)較少，存在一定的局限性，因此又對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了研究，選擇乳腺癌進(jìn)行比較分析，除得到以上結(jié)果外，還顯示ECT2 表達(dá)與腫瘤分期、年齡分布、絕經(jīng)期前后、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測ECT2不但參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，還可能與乳腺癌尤其是TNBC 的預(yù)后以及靶向治療有關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，除乳腺癌外，ECT2 在其他癌癥中也有表達(dá)，而且ECT2 高表達(dá)患者均顯示較差的預(yù)后，可能是癌癥患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，甚至可能成為腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)[15～18]，包括膠質(zhì)瘤[19]。因此對(duì)ECT2 在乳腺癌中表達(dá)與生存期的關(guān)系進(jìn)行了分析，單純GEPIA2 分析結(jié)果顯示ECT2 表達(dá)與乳腺癌預(yù)后無相關(guān)性，但其中生存曲線交叉明顯，表明存在較多混雜因素，又應(yīng)用Kaplan-Meier Plotter 網(wǎng)站進(jìn)行去除混雜因素的log-rank 檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示ECT2高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比，OS 及DFS 均較短，表明ECT2 高表達(dá)患者預(yù)后較差。實(shí)際上僅使用基因組數(shù)據(jù)預(yù)測腫瘤預(yù)后不夠全面，還需結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，提高對(duì)癌癥病因和進(jìn)展的認(rèn)識(shí)，從而改善對(duì)腫瘤預(yù)后的評(píng)估。本研究從各數(shù)據(jù)庫中獲知ECT2 蛋白表達(dá)研究甚少，目前尚未顯示ECT2 蛋白表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，因此在蛋白組學(xué)方面還需要更多的研究探索。

本研究應(yīng)用多個(gè)數(shù)據(jù)庫、多個(gè)分析工具進(jìn)行多組學(xué)高通量分析，發(fā)現(xiàn)ECT2 在乳腺癌中呈差異表達(dá)，在浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)較高，在TNBC 中相對(duì)高表達(dá)，并且與腫瘤分期、年齡分布、絕經(jīng)期前后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)有關(guān)，是乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的促進(jìn)因素，而且ECT2 高表達(dá)的患者預(yù)后較差，為乳腺癌的靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供了參考依據(jù)。通過本研究結(jié)果可從分子水平了解ECT2 在乳腺癌中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供理論支持。