王 熙 ,秦志強

(中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所世界衛(wèi)生組織熱帶病合作中心科技部國家級熱帶病國際聯(lián)合研究中心國家衛(wèi)生健康委寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室國家熱帶病研究中心,中國上海 200025)

先天免疫是機體防御各種病原微生物入侵的第一道防線,宿主通過模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)與病原體表面的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)相互識別和作用,觸發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng),并通過釋放促炎細胞因子、趨化因子和Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)等響應(yīng)病原體的感染[1～2]。病原微生物的核酸(DNA或RNA)可以激活人體內(nèi)多種天然免疫識別受體[3]。近年來系列研究表明,細胞質(zhì)中DNA觸發(fā)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)[4～5]。環(huán)鳥苷酸腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)作為一種胞質(zhì)DNA傳感器[6],其介導(dǎo)的cGASSTING感受通路可誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生,從而抵御病原微生物感染,這表明cGAS在抗感染免疫中具有重要作用。cGAS通路的發(fā)現(xiàn)將眾多重大疾病與天然免疫聯(lián)系在一起,開啟了研究人類疾病機制的新大門,引起了國際學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。

1 cGAS-STING通路的免疫機制

cGAS是一種模式識別受體,也是一種位于細胞質(zhì)中的DNA傳感器,可以識別胞質(zhì)DNA以啟動先天免疫反應(yīng)[7]。人類cGAS由1個N端結(jié)構(gòu)域(氨基酸1～160)和1個C端結(jié)構(gòu)域(氨基酸161～522)構(gòu)成[8～9],其中C端NTase和Mab21結(jié)構(gòu)域高度保守,而N端氨基酸的一級序列在進化上非高度保守,研究表明刪除N端160個殘基并不影響cGAS對細胞因子的誘導(dǎo),相反,NTase和Mab21域?qū)GAS活性卻極為重要[5]。cGAS與DNA結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象變化,催化GTP和ATP合成環(huán)鳥苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)[6]。DNA與cGAS的結(jié)合受到某些因素影響,比如:DNA長度越長,激活能力就越強[5]。Song等[8]將賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶5(lysine acetyltransferase 5,KAT5)鑒定為cGASSTING通路的正向調(diào)節(jié)因子,它可以促進cGAS的DNA結(jié)合能力和自身活化。cGAMP在cGASSTING通路中充當(dāng)內(nèi)源性第二信使,作為干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)的激活劑結(jié)合并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)STING[6,10]。STING由5個跨膜區(qū)域組成,主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[11]。STING對環(huán)狀二核苷酸的識別具有特異性,這種特異性主要依賴于STING的分子結(jié)構(gòu),研究表明STING是一種具有V形結(jié)構(gòu)的二聚體,兩個STING分子共同結(jié)合一個c-di-GMP分子,STING與c-di-GMP的結(jié)合位點位于其V形二聚體界面的底部,兩者通過氫鍵連接,因此環(huán)狀二核苷酸也被稱為是STING的最佳配體[12～13]。STING通過其C端結(jié)構(gòu)域募集TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)和干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3),TBK1和IRF3的相互接近促進IRF3磷酸化,使其二聚化并易位到細胞核,以激活I(lǐng)FN-β(interferon-beta)基因的轉(zhuǎn)錄,最終導(dǎo)致Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[13]。Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)也受STING表達水平的影響,STING的過表達可以有效地誘導(dǎo)IRF3的二聚化增加以及IFN啟動子的高表達[11],它在響應(yīng)各種DNA病原體的感染中起著至關(guān)重要的作用[14]?？偟膩碚f,cGAS-STING通路的激活觸發(fā)了包括Ⅰ型干擾素在內(nèi)的先天免疫反應(yīng),從而誘導(dǎo)有效的抗病原體感染免疫。

2 cGAS-STING通路在抗感染免疫中的作用

2.1 抗病毒感染

病毒是一類僅由遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)外殼組成的非細胞微生物,由于其特殊的生理結(jié)構(gòu),機體通過模式識別受體檢測細胞質(zhì)中的病毒核酸(DNA或RNA)是誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要機制[1]。因此,在機體受到DNA病毒入侵時,病毒DNA就作為主要的PAMP與cGAS相互識別和作用,從而激活cGAS-STING通路,并導(dǎo)致Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生和隨后的一系列抗病毒反應(yīng)[15]。迄今為止,國際上對于DNA病毒感染與cGAS-STING通路的報道已有許多,cGAS-STING途徑在病毒感染后的早期免疫反應(yīng)中起著主導(dǎo)作用。現(xiàn)有研究表明,cGAS可以識別皰疹病毒(herpes virus)、痘病毒(poxvirus)、腺病毒(adenovirus)以及人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)等常見的DNA病毒,且上述DNA病毒均可以通過cGAS-STING途徑被Ⅰ型干擾素抑制[16]。

作為人群中最流行的DNA病毒之一,皰疹病毒已被證實其DNA的識別依賴于胞質(zhì)DNA傳感器cGAS。然而,相關(guān)研究報道,單純皰疹病毒1(herpes simplex virus type 1,HSV-1)擁有多種免疫逃避策略[17]。Su等[18]首次證明,HSV-1膜蛋白UL41(病毒體宿主關(guān)閉蛋白)通過降解cGAS和異位表達,減少cGAS的積累,并抑制cGAS和STING介導(dǎo)的IFN-β啟動子激活,從而逃避cGAS-STING通路的監(jiān)測,消除宿主對病毒的識別。HSV-2則通過激活該通路誘導(dǎo)附睪上皮細胞的先天抗病毒反應(yīng)[19]。另外,人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)DNA對IRF3-IFN-Ⅰ軸的激活同樣依賴于 3種關(guān)鍵分子,即 cGAS、STING和TBK1[20],類似的還有鼠痘病毒(ectromelia virus,ECTV)[21]。Ma等[15]報道卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)感染時會激活cGAS-STING通路,并且首次發(fā)現(xiàn)人類DNA病毒編碼的多種蛋白質(zhì)能夠抑制該通路的激活,例如:病毒干擾素調(diào)節(jié)因子1(viral inter-feron regulatory factor 1,vIRF1)通過破壞STING與TBK1之間的相互作用,從而阻斷DNA傳感通路。在樹突細胞中,裸露的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA具有強烈的免疫刺激潛力,通過cGAS感知和STING介導(dǎo)引發(fā)先天免疫反應(yīng)[22]?；赾GAS-STING通路原理,有研究者認為,在治療HBV感染方面,利用小分子靶向作用STING可能是一種新的思路和方法[23]。

此外,為進一步研究cGAS在誘導(dǎo)先天抗病毒反應(yīng)中的作用,眾多研究團隊利用cGAS缺陷型(cGas-/-)或STING缺陷型(Sting-/-)小鼠與野生型(WT)小鼠進行對照實驗,證實了cGAS在DNA識別依賴性信號通路中的重要作用。例如,Sun等[5]研究發(fā)現(xiàn),cGAS的缺乏在很大程度上消除了HSV-1感染時所產(chǎn)生的cGAMP活性,并且抑制了IRF3二聚化,表明在HSV-1感染過程中,cGAS對于cGAMP的產(chǎn)生和IRF3的激活是必不可少的。另有研究表明,對于cGAS缺陷小鼠的細胞(包括成纖維細胞、巨噬細胞和樹突細胞),在DNA轉(zhuǎn)染或DNA病毒感染時,其未能產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和其他細胞因子,甚至還促進了病毒的復(fù)制,宿主細胞中表現(xiàn)出較高水平的病毒載量[24]。Cheng等[21]的實驗結(jié)果顯示,cGas-/-或Sting-/-小鼠感染ECTV后表現(xiàn)出較高的病毒載量,并且該類型小鼠對ECTV的易感性明顯增強。另外,體外感染實驗結(jié)果顯示,在cGAS和STING缺失的情況下,小鼠小膠質(zhì)細胞感染HSV-1后,Ⅰ型干擾素表達水平明顯受損[25]。顯然,cGAS或STING表達的中斷導(dǎo)致了Ⅰ型干擾素生成減少,宿主抗病毒反應(yīng)減弱,從而相應(yīng)地就促進了病毒在宿主內(nèi)的復(fù)制。有意思的是,在感染腺病毒時,雖然早期的抗病毒免疫反應(yīng)受損,IFN-β和相應(yīng)抗病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降低,但cGAS-STING通路的缺失并不會影響宿主內(nèi)病毒的清除,表明cGAS-STING通路的缺失并不影響腺病毒清除[26]。

除DNA病毒外,cGAS也被認為系某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的先天免疫傳感器。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA一方面可以通過線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)依賴的RNA識別途徑被感知,另一方面也可經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄被cGAS-cGAMP-STING途徑檢測到,例如HIV RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的DNA[27～30]。其他RNA病毒,例如尼帕病毒和麻疹病毒,與DNA病毒類似,宿主細胞在被其感染后的一段時間內(nèi)也可檢測到STING的活化,并且實驗發(fā)現(xiàn),在cGAS-STING通路受損的細胞中,IFN-α和IFN-β的mRNA顯著減少,宿主抗病毒反應(yīng)減弱[31]。最新針對嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)的相關(guān)研究同樣發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2感染后cGAS-STING通路被激活,而病毒蛋白質(zhì)SARS-CoV-2 ORF9b[32]和SARS-CoV-2 ORF3a[33]對cGAS-STING通路起著抑制作用。

2.2 抗寄生蟲感染

cGAS-STING通路介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)對于控制寄生蟲感染也有著良好的效應(yīng)[34]。宿主受到寄生蟲感染時,Ⅰ型干擾素是一類重要的效應(yīng)產(chǎn)物,研究表明Ⅰ型干擾素同樣可以被誘導(dǎo)以響應(yīng)寄生蟲感染[35]。寄生蟲DNA可以進入宿主細胞的細胞質(zhì)中,來自寄生蟲的基因組DNA同樣會觸發(fā)cGAS-STING通路。近年來,國內(nèi)外關(guān)于cGASSTING通路在寄生蟲感染免疫的研究也越來越多,引起了較大關(guān)注。

瘧原蟲是引起人類瘧疾的病原體,其常見的類型有4種,包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲。Gallego-Marin等[36]通過實驗證實,cGAS對惡性瘧原蟲基因組DNA(Pf gDNA)有重要的識別作用,cGAS-STING通路在惡性瘧原蟲感染中參與誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。惡性瘧原蟲首先分泌一種含有非編碼RNA和基因組DNA的細胞外囊泡(extracellular vesicle,EV),EVDNA被釋放到宿主細胞質(zhì)中,然后激活依賴STING的細胞質(zhì)DNA傳感途徑[37]。在惡性瘧原蟲感染的紅細胞中,IFN-β mRNA水平和轉(zhuǎn)染Pf gDNA誘導(dǎo)的IFN-β水平都顯著升高,而未感染惡性瘧原蟲的紅細胞沒有誘導(dǎo)IFN-β mRNA的表達,表明瘧原蟲DNA在感染過程中作為一種有效的PAMP啟動宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)[36]。另有研究顯示,瘧原蟲感染的STING信號突變小鼠與cGas-/-小鼠類似,隨著感染的進行,體內(nèi)表現(xiàn)出比野生型(WT)小鼠更高的寄生蟲負荷和更高的寄生蟲血癥[34]。針對弓形蟲的研究也有類似的現(xiàn)象,Wang等[38]利用小鼠模型發(fā)現(xiàn),抗弓形蟲免疫反應(yīng)的激活需要cGAS,缺乏cGAS和STING的小鼠呈現(xiàn)出更嚴(yán)重的表型且更容易被感染。在弓形蟲感染期間,來自剛地弓形蟲的致密顆粒蛋白GRA15分泌并定位于宿主細胞胞質(zhì)中,促進STING的寡聚化和活化,有助于增強cGAS-STING信號和先天免疫反應(yīng)。因此,cGAS和STING在抵抗寄生蟲感染中起著重要的免疫作用。

相反,另有一些研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)cGAS-STING信號通路缺失或未被激活的小鼠反而對某些寄生蟲病原體感染更具免疫抵抗力。Souza等[39]報道,曼氏血吸蟲DNA可以被cGAS識別并激活STING,曼氏血吸蟲DNA轉(zhuǎn)染野生型小鼠胚胎成纖維細胞后產(chǎn)生高水平的IFN-β mRNA,但是該通路的缺失卻使小鼠更能夠抵抗曼氏血吸蟲的感染。另外,用致命性約氏瘧原蟲YM蟲種感染小鼠后,cGas-/-缺陷小鼠體內(nèi)反而表現(xiàn)出更高水平的IFN-α和IFN-β,且感染癥狀減輕,該研究最終發(fā)現(xiàn)cGAS和STING缺陷小鼠對YM感染具有更強的抵抗性[40]。需要指出的是,上述cGas-/-小鼠感染惡性瘧原蟲后其癥狀反而加重,因此cGAS-STING通路在抗瘧原蟲感染中的作用可能是復(fù)雜多樣的。

2.3 抗細菌感染

cGAS-STING信號通路的激活誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,通常情況下,Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生被認為是針對病毒入侵的免疫應(yīng)答反應(yīng),但實際上,大多數(shù)細菌感染也會導(dǎo)致Ⅰ型干擾素產(chǎn)生[41～44]。細菌對Ⅰ型干擾素的誘導(dǎo)有多種途徑,其中較為常見的是Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)依賴途徑[42],而當(dāng)缺少TLR9的細胞感染單核細胞增生李斯特菌時,其仍然能夠產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[4],這正是由于細胞質(zhì)中cGAS的存在。研究表明,THP-1細胞(人急性單核細胞白血病細胞)感染單核細胞增生李斯特菌后,依賴cGAS和STING來誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生,證明cGAS可以檢測胞質(zhì)中的細菌DNA以激活cGAS-STING通路產(chǎn)生免疫反應(yīng)[45]。因此,cGAS除了能檢測到病毒DNA和寄生蟲DNA外,也可以檢測細胞中的細菌DNA,包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[16]。Li等[24]通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR分析進一步證實,cGAS對于細菌DNA誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生是必不可少的。此后,Zhang等[46]也首次證明,胞質(zhì)的沙眼衣原體DNA是感染過程中誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的觸發(fā)器,而cGAS作為DNA傳感器,在感知該DNA方面發(fā)揮了不可或缺的作用。此外,cGAS也可作為結(jié)核分枝桿菌感染的先天免疫傳感器,研究顯示,在人類或小鼠巨噬細胞中,結(jié)核分枝桿菌DNA激活cGAS以產(chǎn)生cGAMP,而敲除cGAS會阻止相關(guān)因子的產(chǎn)生和自噬的誘導(dǎo),cGAS的缺乏導(dǎo)致感染結(jié)核分枝桿菌的致死率增加[45]。對于肺炎鏈球菌而言,宿主可通過cGASSTING通路識別胞質(zhì)中的細菌DNA以產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子,但小鼠實驗顯示,cGASSTING通路在對抗肺炎鏈球菌感染中不占主要地位[47]。自然情況下,人類STING還存在著某些突變體,例如STINGR231A和STINGR232H,它們通常對cGAMP的反應(yīng)能力較弱,但實驗發(fā)現(xiàn),R232H在介導(dǎo)肺炎鏈球菌感染的免疫應(yīng)答中仍然發(fā)揮作用,且人類或小鼠cGAS能促使STINGREF和STINGR231A被激活,這是由于STING突變體可以響應(yīng)DNA和cGAS,因此,在cGAS與STING突變體之間或許還存在著某些不為人知的物理作用[47～48]。

盡管Ⅰ型干擾素可以干擾病毒復(fù)制并具有一定的抗菌作用,但有研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素對于細菌的作用有利有弊。例如,單核細胞增生李斯特菌通過cGAS-STING通路刺激Ⅰ型干擾素產(chǎn)生,但Ⅰ型干擾素可能會對宿主的抗菌反應(yīng)產(chǎn)生不利影響[43]。在牛分枝桿菌感染過程中,產(chǎn)生過多的Ⅰ型干擾素會削弱宿主對感染的抵抗力,因此,最新研究發(fā)現(xiàn)宿主往往通過產(chǎn)生caspase-1蛋白抑制cGAS-STING信號通路,從而降低體內(nèi)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生水平[49]。這些研究都表明,在某些種類的細菌感染中,Ⅰ型干擾素可能對宿主產(chǎn)生不利的作用;宿主通過cGAS-STING通路激活產(chǎn)生Ⅰ型干擾素對于自身而言究竟是增強抗菌能力還是削弱其抵抗力,尚有待進一步探索。

3 總結(jié)與展望

cGAS-STING通路作為一種有效的DNA識別途徑,是宿主防御外來病原體感染的重要機制,在宿主抵抗病原微生物感染的天然免疫過程中扮演著極其重要的角色。在病原體侵入宿主細胞后,絕大多數(shù)病原體的遺傳物質(zhì)DNA被釋放到宿主細胞質(zhì)中,作為抗原物質(zhì)被胞質(zhì)DNA傳感器cGAS識別并結(jié)合,進而激活cGAS-STING通路,啟動免疫應(yīng)答,釋放Ⅰ型干擾素。

目前,國內(nèi)外關(guān)于cGAS-STING通路在抗感染免疫方面的作用,均已經(jīng)有較多的見解和認識[16,34,50],但是仍然有許多問題待進一步探索和解決。比如,研究對象尚存在著一定局限性。雖然關(guān)于該領(lǐng)域的報道較多,但大部分研究僅僅聚焦于DNA病毒和細菌,而針對RNA病毒和寄生蟲感染免疫的研究卻比較少。盡管部分研究顯示,cGAS-STING通路參與抗RNA病毒感染,但RNA病毒與cGAS-STING通路之間的作用機制尚未完全闡明,cGAS對病毒RNA是否同樣存在識別作用以及胞質(zhì)RNA激活cGAS-STING通路的具體機制和效應(yīng)也是未來的一個重要研究方向。另外需要注意的是,cGAS-STING通路雖然起著免疫防御作用,但同時也可能誘發(fā)嚴(yán)重感染。雖然已知cGAS識別細胞質(zhì)中的病原體DNA后會通過cGAS-STING途徑誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,但Ⅰ型干擾素水平的上調(diào)在不同種類寄生蟲感染中表現(xiàn)出不同的作用,既有保護作用又存在不利的影響。比如,在某些感染情況下,Ⅰ型干擾素的高水平表達促進了嚴(yán)重炎癥反應(yīng),導(dǎo)致宿主存活率降低,這可能與宿主體內(nèi)Ⅰ型干擾素的表達時間或表達量存在一定關(guān)系。因此,cGAS-STING通路的長時間持續(xù)性激活是否亦會對宿主產(chǎn)生不利影響,尚需要更多的研究論證。

對于寄生蟲感染而言,抵抗再感染、增強宿主免疫保護作用是一直以來值得關(guān)注和解決的重要科學(xué)問題。某些寄生蟲感染后,cGAS-STING通路所誘導(dǎo)的高水平IFN-β促使了IL-10表達,IL-10防止免疫反應(yīng)加劇和炎癥反應(yīng)惡化,從而提高宿主抗再感染能力。而曼氏血吸蟲和約氏瘧原蟲則相反,宿主缺失cGAS-STING通路時其抗感染能力反而增強。因此,如何通過相關(guān)激活劑或抑制劑作用于cGAS-STING通路,以改善宿主保護防御效能,還有待更多的研究去發(fā)現(xiàn)和挖掘?？傊?深入剖析cGAS-STING通路與寄生蟲DNA之間的作用機制與效應(yīng),有助于發(fā)現(xiàn)抗寄生蟲感染的診療新靶點,從而為發(fā)展寄生蟲病防治新方法打下基礎(chǔ),也可豐富cGAS-STING通路在抗病原微生物感染免疫中的研究領(lǐng)域。