亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像分析

        2023-01-25 05:34:10趙雪琪宋大千趙永席
        關(guān)鍵詞:條碼探針核酸

        趙雪琪,趙 越,薛 靜,白 敏,陳 鋒,孫 穎,宋大千,趙永席

        (1.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院,吉林省光譜分析儀器工程技術(shù)研究中心,長(zhǎng)春 130012;2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,生命分析化學(xué)與儀器研究所,生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710049)

        細(xì)胞成像技術(shù)的革新不斷推動(dòng)生命科學(xué)的發(fā)展,通過成像實(shí)時(shí)清晰地觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)及胞外微環(huán)境的細(xì)微變化,對(duì)于細(xì)胞分析十分重要.單細(xì)胞成像分析可提供不同細(xì)胞個(gè)體中分子的含量與分布信息,不僅在分析胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)、分子間反應(yīng)、細(xì)胞間差異以及相互作用等方面應(yīng)用廣泛,還可以通過多組學(xué)聯(lián)合分析,解析不同類型腫瘤細(xì)胞的耐藥性差異,從而實(shí)現(xiàn)臨床個(gè)體化精準(zhǔn)治療[1].在單細(xì)胞成像中,細(xì)胞中的物質(zhì)變化需要通過探針作為媒介來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的輸出.其中,單細(xì)胞熒光成像由于具有熒光信號(hào)靈敏度高、特異性好及易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為生命分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2].

        目前,單細(xì)胞熒光成像的目標(biāo)物已覆蓋核酸表觀修飾[3]、細(xì)胞酶活性[4]、蛋白質(zhì)間相互作用[5]及胞內(nèi)外小分子動(dòng)態(tài)變化[6]等很多方面.其中,發(fā)展較為成熟的檢測(cè)方法有熒光重組蛋白[7]、有機(jī)小分子熒光探針[8,9]及熒光核酸探針[10]等.熒光重組蛋白是由熒光蛋白與目標(biāo)蛋白基因融合后再表達(dá),具有很好的特異性,但蛋白體積較大且易發(fā)生熒光漂白.與之相比,有機(jī)小分子熒光探針的體積更小且熒光強(qiáng)度更高.然而,有機(jī)染料的膜通透性較差且容易發(fā)生非特異性吸附[11].

        核酸熒光探針[12]具有可程序化設(shè)計(jì)、易修飾活性功能基團(tuán)和可擴(kuò)增放大檢測(cè)信號(hào)等特點(diǎn),在檢測(cè)痕量目標(biāo)物方面具有很大的應(yīng)用潛力.由于熒光分子波譜重疊,常見方法大多受到檢測(cè)通道種類的限制,檢出限和靈敏度很難達(dá)到理想狀態(tài)[13,14].然而,細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物種類多、豐度低,同源組分結(jié)構(gòu)相似,分子鄰近距離短.因此,如何實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)多組分標(biāo)志物的精準(zhǔn)識(shí)別與高靈敏定量分析,已經(jīng)成為生命分析領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)之一,核酸編碼技術(shù)由此進(jìn)入大眾視野.

        核酸編碼技術(shù)最早于20世紀(jì)90年代被提出[15],在后期的不斷完善和發(fā)展中,已被拓展應(yīng)用于文庫篩選[16,17]、測(cè)序[18]及成像[19,20]等方面.脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)條碼具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、數(shù)目多及易于制備等特點(diǎn)[21],已成為核酸編碼中應(yīng)用最廣泛的工具之一.針對(duì)不同目標(biāo)物的特征,可通過不同的分子反應(yīng)使其攜帶DNA條碼,再通過這些條碼上不同的熒光信號(hào)來區(qū)分目標(biāo)物[22,23].由于單一條碼分子的熒光強(qiáng)度難以直接檢出,可聯(lián)合核酸擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大[24].近年來,等溫?cái)U(kuò)增以其溫和的反應(yīng)條件、快速有效的擴(kuò)增和簡(jiǎn)單的操作被廣泛用于生物成像分析中[25].在等溫?cái)U(kuò)增中,常用的反應(yīng)有滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(Rolling circle amplification,RCA)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction,HCR)、引物交換反應(yīng)(Primer exchange reaction,PER)和催化發(fā)夾組裝反應(yīng)(Catalyzed hairpin assembly,CHA)等.其中,RCA是環(huán)狀探針和部分序列互補(bǔ)配對(duì)的引物探針雜交后,在聚合酶的作用下延伸引物并生成重復(fù)序列的過程.通常與單分子熒光原位雜交技術(shù)(Single-molecule fluorescentin situhybridization,smFISH)聯(lián)合使用,雜交與重復(fù)序列互補(bǔ)的熒光探針來產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)點(diǎn).PER是由單鏈引物和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA在聚合酶的作用下反復(fù)進(jìn)行鏈置換反應(yīng),從而將引物末端延長(zhǎng)出重復(fù)序列的過程,可通過連續(xù)雜交信號(hào)探針放大檢測(cè)信號(hào).HCR是一對(duì)部分互補(bǔ)的發(fā)夾序列在被單鏈核酸雜交觸發(fā)后,通過鏈置換反應(yīng)不斷交替打開更多發(fā)夾并生成長(zhǎng)鏈DNA的過程.CHA與HCR類似,但兩對(duì)發(fā)夾互補(bǔ)后形成的雙鏈結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,從而使觸發(fā)反應(yīng)的單鏈核酸恢復(fù)游離狀態(tài),繼續(xù)引發(fā)下一組發(fā)夾發(fā)生反應(yīng),生成大量的短鏈DNA.與RCA和PER相比,HCR和CHA不需要酶介導(dǎo),但序列的設(shè)計(jì)較為復(fù)雜[25~27].因此,聯(lián)合核酸編碼與擴(kuò)增技術(shù),通過特異性識(shí)別轉(zhuǎn)化分子特征為獨(dú)特DNA條碼的擴(kuò)增,可實(shí)現(xiàn)特異、靈敏的單細(xì)胞多組分檢測(cè),對(duì)于當(dāng)前生物和臨床醫(yī)學(xué)研究都有重大意義.

        Fig.1 Progress in nucleic acids-encoded amplification for single-cell imaging

        本文介紹了單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像分析的最新進(jìn)展,結(jié)合本課題組近期的研究成果,根據(jù)不同的編碼原理從原位和活細(xì)胞角度對(duì)細(xì)胞內(nèi)的核酸編碼擴(kuò)增成像方法進(jìn)行介紹(圖1),并對(duì)該技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行展望與分析.

        1 原位核酸編碼擴(kuò)增成像

        核酸編碼擴(kuò)增是將核酸編碼與等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物識(shí)別轉(zhuǎn)化檢測(cè)的一種方法.其中最重要的一步就是通過化學(xué)反應(yīng)給多種目標(biāo)物標(biāo)記上不同的DNA條碼.目前常用于原位細(xì)胞成像的核酸編碼方式主要基于雜交反應(yīng)、化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)、抗原-抗體免疫反應(yīng)與組合反應(yīng)等,可與等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)后續(xù)的信號(hào)放大.

        Fig.2 Schematic of MERFISH[37]

        1.1 基于雜交反應(yīng)的編碼原理

        基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則的雜交反應(yīng)是堿基相關(guān)反應(yīng)中最常見的一種,也是核酸探針進(jìn)行檢測(cè)、成像和編碼的基礎(chǔ).在核酸探針上修飾同位素[28]、生物素[29]或熒光基團(tuán)[30]等可以對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行成像和分析.對(duì)于已知序列,可以設(shè)計(jì)互補(bǔ)的核酸探針直接進(jìn)行雜交反應(yīng)編碼[31,32];對(duì)于未知序列,則需要先連接上帶有已知序列的通用接頭再進(jìn)行編碼.smFISH是雜交編碼成像的常用方法,通過熒光基團(tuán)修飾的短核酸探針與目標(biāo)物上不同的序列區(qū)域雜交,使目標(biāo)物修飾上多個(gè)熒光分子,從而放大信號(hào),實(shí)現(xiàn)單分子熒光成像[33,34].由于熒光基團(tuán)種類的限制,smFISH很難成像多種目標(biāo)物[35,36].

        Zhuang等[37]提出的多重糾錯(cuò)熒光原位雜交(Multiplexed error-robust FISH,MERFISH)技術(shù)利用FISH組合標(biāo)記和能夠糾錯(cuò)的編碼方法進(jìn)行單細(xì)胞中核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)的成像,解決了smFISH在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)成像的RNA種類數(shù)量受限的問題,實(shí)現(xiàn)了空間分辨的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析.針對(duì)特定目標(biāo)RNA序列可設(shè)計(jì)連續(xù)雜交不同區(qū)域的多個(gè)編碼探針,放大檢測(cè)信號(hào).編碼探針由一段雜交序列和兩段讀出序列組成,每輪雜交時(shí)加入一種與某段讀出序列互補(bǔ)的熒光探針,有熒光信號(hào)的記為“1”,沒有熒光信號(hào)的記為“0”(圖2).經(jīng)過N輪雜交后,形成一段含有N個(gè)字節(jié)的二進(jìn)制碼,再通過漢明距離降低編碼錯(cuò)誤率,最終可以通過14輪雜交實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞中1001種RNA的成像[圖3(A)].由于FISH探針存在脫靶問題,在增加編碼輪數(shù)、成像更短的RNA以及成像組織樣本時(shí),會(huì)產(chǎn)生脫靶背景[38].研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)非特異性結(jié)合脫靶熒光探針的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì),所以選擇將樣本嵌入聚丙烯酰胺中以減小脫靶背景.樣本內(nèi)的RNA錨定在聚丙烯酰胺基質(zhì)上,隨后去除蛋白質(zhì),再進(jìn)行MERFISH.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法在藍(lán)綠光譜范圍內(nèi)使得MERFISH成像從2個(gè)通道擴(kuò)展到4個(gè)通道,并且性能沒有降低.因此減少了雜交編碼的輪數(shù),縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了MERFISH的通量[38].基于MERFISH原理,該課題組發(fā)展了一系列應(yīng)用.在掃描基因變異文庫中[39],為每個(gè)含有待測(cè)遺傳變異的質(zhì)粒隨機(jī)地分配一個(gè)條形碼,使得每個(gè)細(xì)胞只檢測(cè)一種高豐度的被編碼的RNA,多輪熒光成像后進(jìn)行信號(hào)的匯總,這樣更亮的信號(hào)就有更低的錯(cuò)誤率.通過這種方法識(shí)別了更亮更穩(wěn)定的熒光蛋白YFAST中的60000個(gè)變異位點(diǎn).此外,Zhuang等[40]還利用MERFISH建立一個(gè)分子級(jí)和空間分辨的小鼠初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層細(xì)胞圖譜[圖3(B)].在MERFISH基礎(chǔ)上,他們結(jié)合分枝DNA(branched DNA,bDNA)擴(kuò)增進(jìn)行信號(hào)放大[41].在MERFISH第一步雜交完成后,加入一端與讀出條碼互補(bǔ)、另一端帶有多段重復(fù)序列的初級(jí)信號(hào)放大條碼進(jìn)行第一次放大.二級(jí)信號(hào)放大條碼的結(jié)構(gòu)與初級(jí)信號(hào)放大條碼一樣,一端與初級(jí)信號(hào)放大條碼互補(bǔ)雜交,另一端與多個(gè)熒光探針雜交,使MERFISH的信號(hào)進(jìn)行兩輪放大,提高效率.

        Fig.3 Data of application of MERFISH

        Cai等[42]提出了連續(xù)單分子熒光原位雜交(Sequential FISH,seqFISH)的方法,對(duì)固定細(xì)胞中的信使RNA(Message RNA,mRNA)進(jìn)行連續(xù)探針雜交,每輪探針帶有不同顏色的熒光團(tuán),在一輪雜交結(jié)束后,通過DNA酶降解探針,再進(jìn)行下一輪雜交[圖4(A)].因?yàn)榧?xì)胞是固定的,所以對(duì)應(yīng)每個(gè)mRNA的熒光點(diǎn)在每輪成像中都保持在原位,由此產(chǎn)生一種獨(dú)特的熒光序列條碼,實(shí)現(xiàn)mRNA的成像.由于smFISH在組織成像中較難實(shí)現(xiàn),當(dāng)前發(fā)展的基于seqFISH的方法都是細(xì)胞成像.為了實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組織的成像,他們從信號(hào)放大和高效的誤差修正兩方面對(duì)seqFISH進(jìn)行改進(jìn),對(duì)海馬的結(jié)構(gòu)組織進(jìn)行單細(xì)胞分辨率的解析[43].該方法采用單分子雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Single-molecule HCR,smHCR)進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增,多個(gè)編碼探針雜交到mRNA上后,探針上突出的單鏈部分通過互補(bǔ)雜交打開帶有熒光-猝滅基團(tuán)的發(fā)夾1,發(fā)夾1再用同樣的方式打開發(fā)夾2,不斷循環(huán)生成帶有很多熒光基團(tuán)的DNA長(zhǎng)鏈聚合物.該smHCR產(chǎn)物可以被DNA酶消化,并且mRNA在腦組織切片中可以重新雜交,從而實(shí)現(xiàn)HCR-seqFISH[圖4(B)].

        Deisseroth等[44]提出了一種能在完整組織中進(jìn)行RNA原位測(cè)序的方法,命名為空間分辨轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增示值圖譜分析(Spatially-resolved transcript amplicon readout mapping,STARmap).他們將含有不同DNA條碼的掛鎖探針雜交到mRNA上,在RCA過程中加入一部分氨基修飾的堿基,最終得到含有多個(gè)相同條碼和氨基修飾的RCA產(chǎn)物.丙烯酸N-羥基琥珀酰亞胺酯與氨基反應(yīng),得到丙烯酰胺基修飾的RCA產(chǎn)物,隨后與丙烯酰胺單體共聚形成水凝膠-DNA擴(kuò)增子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).該結(jié)構(gòu)由共價(jià)鍵連接,可以在后續(xù)去除蛋白和多輪探針清洗中保持穩(wěn)定.DNA條碼由5個(gè)隨機(jī)堿基組成,形成1024個(gè)不同的條碼.只有當(dāng)讀出探針和熒光探針與DNA條碼完全雜交時(shí),才能穩(wěn)定連接并產(chǎn)生熒光信號(hào).每輪識(shí)別一個(gè)堿基,讀出探針的堿基數(shù)逐個(gè)遞增,熒光探針的堿基數(shù)逐個(gè)遞減[圖4(C)].在一輪識(shí)別結(jié)束后,加入甲酰胺去除核酸探針,消除測(cè)序過程中錯(cuò)誤的累積.最后通過與相應(yīng)的基因進(jìn)行序列比對(duì),STARmap實(shí)現(xiàn)了小鼠大腦切片上單細(xì)胞分辨率的160~1020個(gè)基因的檢測(cè).

        Fig.4 Schematic of hybridization encoded amplification methods

        Fig.5 Schematic and data of SeqEA[46]

        Yin等[45]提出了一種基于FISH的信號(hào)放大方法,命名為基于交換反應(yīng)的熒光原位雜交信號(hào)放大法(Signal amplification by exchange reaction-FISH,SABER-FISH).DNA條碼由信號(hào)識(shí)別條碼和信號(hào)放大條碼兩部分組成,信號(hào)識(shí)別條碼和目標(biāo)物互補(bǔ)雜交,信號(hào)放大條碼預(yù)先在體外通過PER合成含有重復(fù)序列的長(zhǎng)鏈.當(dāng)DNA條碼和目標(biāo)物雜交后,每輪加入一種與信號(hào)放大條碼互補(bǔ)的熒光探針進(jìn)行快速雜交成像,然后用低離子強(qiáng)度緩沖液迅速洗脫探針,再進(jìn)行下一輪雜交,以實(shí)現(xiàn)多輪編碼擴(kuò)增成像.

        Li等[46]提出了一種熒光編碼擴(kuò)增方法——核酸序列編碼擴(kuò)增(Sequence-encoded amplicon,SeqEA),利用目標(biāo)RNA介導(dǎo)環(huán)形識(shí)別探針環(huán)化并觸發(fā)RCA信號(hào)放大,通過熱力學(xué)調(diào)控RCA產(chǎn)物與熒光探針的雜交效率實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的改變,即可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行熒光編碼.與傳統(tǒng)RCA熒光成像不同的是,SeqEA中RCA的掛鎖探針分為兩段條碼,分別對(duì)應(yīng)帶有紅色和綠色熒光基團(tuán)的兩種熒光探針.改變掛鎖探針上與熒光探針對(duì)應(yīng)段的堿基序列,就會(huì)產(chǎn)生不能與熒光探針完全配對(duì)雜交的RCA產(chǎn)物,從而降低熒光探針的雜交效率,使熒光強(qiáng)度降低(圖5).通過這種方法設(shè)計(jì)了36個(gè)雙色熒光條碼,當(dāng)使用更多顏色的熒光基團(tuán)時(shí),SeqEA的編碼能力可以成倍提高.

        基于FISH發(fā)展的多輪雜交編碼成像實(shí)現(xiàn)了大量目標(biāo)物的檢測(cè),并在后續(xù)發(fā)展中不斷完善,對(duì)于構(gòu)建文庫和生物體的全局分析起到了非常重大的作用.但是雜交編碼原理僅能識(shí)別序列差異,無法分辨堿基修飾基團(tuán)、核酸空間鄰近關(guān)系等非序列特征信息.

        Fig.6 Schematic and data of Clicker-FISH[53]

        1.2 基于化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)的編碼原理

        化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)編碼通常是將化學(xué)反應(yīng)活性基團(tuán)標(biāo)記到核酸探針上,通過化學(xué)基團(tuán)與目標(biāo)物之間的特定化學(xué)反應(yīng)使目標(biāo)物標(biāo)記上不同的DNA條碼.DNA編碼的小分子文庫篩選中提供了很多修飾方法和化學(xué)反應(yīng)[16,47,48],其中,點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)因其生物相容性好、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像中[49~52].

        在本課題組的研究工作[53]中,點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)編碼滾環(huán)擴(kuò)增的熒光原位雜交成像(Click-encoded rolling FISH,Clicker-FISH)已被用于單細(xì)胞RNA多聚腺苷酸化及結(jié)構(gòu)的可視化成像.胞內(nèi)RNA會(huì)在其加工過程中產(chǎn)生多聚腺苷酸(Polyadenylic acid,polyA)尾巴,部分RNA還會(huì)折疊成部分單鏈、部分雙鏈的莖環(huán)結(jié)構(gòu).成像可獲取PolyA、單鏈RNA(Single-stranded RNA,ssRNA)和雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA,此方法中即莖環(huán)結(jié)構(gòu))等加工與結(jié)構(gòu)信息,揭示其亞細(xì)胞時(shí)空分布,對(duì)于解析細(xì)胞狀態(tài)具有重要意義.結(jié)合活細(xì)胞代謝標(biāo)記和固定細(xì)胞化學(xué)修飾標(biāo)記方法,使3種目標(biāo)物分別標(biāo)記上不同的化學(xué)基團(tuán),其標(biāo)記方法分別對(duì)應(yīng)以下3種反應(yīng)機(jī)理:(1)2-炔基腺苷(2-Ethynyl-adenosine,2-EA)在活細(xì)胞代謝中被聚合到polyA尾巴上;(2)細(xì)胞固定后,疊氮修飾的RNA?;噭ˋzide-modified 2-methylnicotinic acid imidazolide,NAI-N3)特異性與單鏈暴露的2-OH基團(tuán)發(fā)生?;磻?yīng);(3)在365 nm紫外光照射條件下,通過環(huán)辛烯功能化的補(bǔ)骨脂素衍生物(Trans-cyclooctene psoralen,TCO-Pso)標(biāo)記RNA雙鏈區(qū)域,與雙鏈RNA上的嘧啶對(duì)交錯(cuò)反應(yīng)[圖6(A)].隨后,銅催化的疊氮與炔烴、無銅的疊氮與二苯并環(huán)辛炔(Dibenzocyclooctyne,DBCO)和烯烴與四嗪(Tetrazine,Tz)3種點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)分別將3種不同的DNA條碼標(biāo)記到目標(biāo)物上.對(duì)3種DNA條碼進(jìn)行RCA后,雜交熒光探針進(jìn)行成像[圖6(B)].基于此原理,該方法在增加DNA條碼的情況下也可以實(shí)現(xiàn)RNA及相關(guān)蛋白的可視化成像,與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組成像方法進(jìn)行整合后,在研究轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)及序列成像方面也有很大的應(yīng)用潛力.

        此外,本課題組還通過偶聯(lián)編碼進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)表觀修飾的識(shí)別與成像.Zhao等[54]提出了一種利用生物正交的化學(xué)標(biāo)記成像單細(xì)胞內(nèi)兩種氧化胸腺嘧啶的方法.他們對(duì)5-羥甲基尿嘧啶[5-(Hydroxymethyl)uracil,5hmU]和5-甲?;蜞奏ぃ?-Formyluracil,5fU)偶聯(lián)編碼標(biāo)記后擴(kuò)增,結(jié)合熒光成像和測(cè)序,實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組中兩種氧化胸腺嘧啶的量化和精確繪制.在5-羥甲基尿嘧啶磷酸激酶(5hmU DNA kinase,5-HMUDK)作用下,γ磷酸炔基化的三磷酸腺苷類似物(Adenosine triphosphate-γ-alkyne,ATP-γalkyne)通過化學(xué)酶標(biāo)法特異性識(shí)別5hmU并標(biāo)記上炔基,疊氮修飾的DNA條碼通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接上炔基修飾的5hmU.隨后,硼氫化鈉將5fU還原成5hmU,用同樣的方法給5fU標(biāo)記上另一種DNA條碼,對(duì)兩個(gè)條碼進(jìn)行RCA和FISH成像,實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)兩種修飾堿基的可視化定量.

        除了點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),馬來酰亞胺與巰基的偶聯(lián)反應(yīng)應(yīng)用也很廣泛.本課題組將微液滴凝膠與偶聯(lián)核酸編碼整合,提出了一種差異化成像單細(xì)胞內(nèi)兩種5-羥甲基嘧啶的方法,命名為單細(xì)胞微流凝膠液滴5hmU和5hmC差異可視化(Single-cell 5hmU and 5hmC differentiated visualization in microfluidic hydrogel droplets,sc5hmU/5hmC-microgel)[23].在液滴捕獲單細(xì)胞后,利用凝膠結(jié)構(gòu)固定胞內(nèi)的大分子核酸.γ磷酸巰基化的三磷酸腺苷類似物(Adenosine-5-O-thiotriphosphate,ATP-γ-S)在5-HMUDK作用下將5hmU特異性標(biāo)記上巰基,隨后T4噬菌體β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(T4 phageβ-glucosyltransferase,β-GT)將5-羥甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine,5hmC)特異性標(biāo)記上疊氮葡萄糖.再通過化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)使馬來酰亞胺和DBCO修飾的DNA條碼分別標(biāo)記到5hmU和5hmC位點(diǎn),經(jīng)RCA后成像兩種堿基的位置(圖7).該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)于相似組分的編碼成像,并結(jié)合微流液滴進(jìn)行單細(xì)胞分析,擴(kuò)大了微流芯片和核酸編碼擴(kuò)增成像的應(yīng)用.

        Fig.7 Schematic and data of sc5hmU/5hmC-microgel[23]

        與利用雜交反應(yīng)進(jìn)行條碼標(biāo)記的方式相比,化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)可以對(duì)未知序列以及不能直接雜交核酸探針的目標(biāo)物(如修飾堿基、蛋白和雙鏈核酸等)進(jìn)行DNA條碼的標(biāo)記,擴(kuò)大了核酸編碼的應(yīng)用范圍.但是目前反應(yīng)條件溫和、高效、生物相容性好的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)種類有限,如何拓展更多的反應(yīng)也是需要關(guān)注的方面之一.

        1.3 基于抗原-抗體免疫反應(yīng)的編碼原理

        抗原-抗體免疫反應(yīng)在生物分析檢測(cè)中已經(jīng)發(fā)展成熟,在此基礎(chǔ)上的三明治信號(hào)放大方法也有很多種,如抗體-抗原-抗體、抗體-抗體-核酸等.由于抗體本身具有識(shí)別功能且種類很多,因此將抗體與DNA條碼通過通用的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合在一起形成抗體-核酸編碼探針可以擴(kuò)大目標(biāo)物的識(shí)別范圍[55].

        Yin等[56]利用同時(shí)帶有N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)酯基和馬來酰亞胺基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)將抗體和DNA條碼連接到一起形成抗體-核酸探針.NHS酯基和馬來酰亞胺基團(tuán)分別與賴氨酸上殘留的氨基和巰基修飾的DNA條碼發(fā)生反應(yīng)[圖8(A)].抗體-核酸探針可以直接識(shí)別目標(biāo)物,也可以作為二級(jí)抗體進(jìn)行信號(hào)放大.作者還將Tz修飾的DNA條碼和反式環(huán)辛烯(Trans-cyclooctene,TCO)修飾的納米抗體通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)結(jié)合到一起.納米抗體尺寸可以達(dá)到~1.5 nm×2.5 nm,在很大程度上提高了熒光信號(hào)空間位置的準(zhǔn)確性.此外,他們還提出了一種快速洗脫成像的方法[57],也應(yīng)用在SABER-FISH中.修飾不同DNA條碼的抗體-核酸探針識(shí)別目標(biāo)物后,每輪加入一種熒光探針雜交,再用低離子強(qiáng)度緩沖液迅速洗脫探針,進(jìn)行下一輪雜交,原則上可以循環(huán)無限次.由于每輪反應(yīng)時(shí)間很短,探針雜交不夠穩(wěn)定,因此容易被洗掉,但也會(huì)帶來熒光信號(hào)弱且不穩(wěn)定的問題.

        Fig.8 Schematic of antigen-antibody encoding methods

        Nolan等[58]提出了一種高度多路成像的方法索引共檢測(cè)(Co-detection by indexing,CODEX),通過比較正常小鼠與患免疫疾病小鼠的脾臟,觀察脾細(xì)胞的相互作用動(dòng)力學(xué).將5′突出的雙鏈DNA條碼修飾到抗體上,每組抗體上5′突出的長(zhǎng)度逐個(gè)遞增,稱為索引(Index)堿基,每輪增加的Index堿基都和上一輪不同.每組包含兩個(gè)抗體,同組抗體上的兩個(gè)DNA條碼只有5′端的第一個(gè)堿基不同,作為信號(hào)堿基,并且這兩個(gè)堿基不會(huì)出現(xiàn)在Index堿基里.每輪成像加入3種堿基,分別與帶有熒光團(tuán)的兩種信號(hào)堿基和一種Index堿基互補(bǔ),成像后用三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride,TCEP]洗掉熒光基團(tuán),再進(jìn)行下一輪成像[圖8(B)].雖然理論上兩種Index堿基可循環(huán)使用,能檢測(cè)無限個(gè)目標(biāo)物,但由于堿基數(shù)量限制,每輪只能成像兩種目標(biāo)物,難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè).

        為了進(jìn)一步放大熒光信號(hào),Luo等[59]將抗原-抗體免疫反應(yīng)與HCR結(jié)合在一起,稱為免疫響應(yīng)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Immunosignal HCR,isHCR)方法.該方法將免疫熒光信號(hào)放大2~3個(gè)數(shù)量級(jí).一級(jí)抗體識(shí)別抗原后,生物素標(biāo)記的二級(jí)抗體與一級(jí)抗體結(jié)合,鏈霉親和素修飾的DNA探針與生物素反應(yīng)后標(biāo)記在目標(biāo)物上,HCR放大信號(hào)后進(jìn)行熒光成像.雖然和熒光基團(tuán)直接標(biāo)記相比,isHCR實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)增強(qiáng),但是受限于二級(jí)抗體的數(shù)量,能檢測(cè)的目標(biāo)物有限.如果在HCR的過程中結(jié)合二次編碼擴(kuò)增,就能擴(kuò)大檢測(cè)范圍.

        Liu等[60]提出了熒光寡核苷酸聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)法(Fluorescence-based oligo-linked immunospot,F(xiàn)OLISPOT),通過酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)法(Enzyme-linked immunospot,ELISpot)和兩輪PER放大信號(hào)方法的結(jié)合,將檢測(cè)限降為ELISpot檢測(cè)限的2%,并實(shí)現(xiàn)了多輪檢測(cè).捕獲抗體、抗原和檢測(cè)抗體形成三明治結(jié)構(gòu),檢測(cè)抗體和DNA條碼通過馬來酰亞胺-聚乙二醇-琥珀酰亞胺酯交聯(lián)劑連接到一起.隨后,通過第一輪PER延長(zhǎng)與抗體上DNA條碼互補(bǔ)的鏈,該鏈又作為第二輪PER的底物,生成大量可與熒光探針互補(bǔ)雜交的單鏈,實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的放大.固定在孔板上的捕獲抗體提供了洗滌界面,使得反應(yīng)體系可以進(jìn)行多輪熒光成像,即修飾相同熒光分子的不同核酸探針可以在不同輪次內(nèi)成像.本方法每輪成像只用了兩種熒光分子,如果增加每輪中熒光分子的種類,可以在多輪洗滌中識(shí)別更多目標(biāo)物[圖9(A)].

        Fig.9 Data and schematic of FOLISPOT and CCFB

        Kashida等[61]提出了顏色變換熒光條碼(Color-changing fluorescent barcode,CCFB)方法,通過多肽與肌動(dòng)蛋白結(jié)合或抗原抗體結(jié)合使目標(biāo)蛋白帶上組合條碼,隨后進(jìn)行多輪鏈置換反應(yīng)對(duì)目標(biāo)多輪成像,形成不同順序和顏色的熒光編碼.與之前方法不同的是,熒光探針用D-蘇氨醇非環(huán)核酸(AcyclicD-threoninol nucleic acids,D-aTNA)代替DNA.D-aTNA自身能形成非常穩(wěn)定的雙鏈,但不能與DNA或RNA形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu).加入D-aTNA單鏈猝滅探針后,與熒光探針通過鏈置換形成的熒光猝滅雙鏈產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不會(huì)被其它DNA單鏈置換,因此不需要在每輪識(shí)別后洗滌,縮短了每輪檢測(cè)的時(shí)間.此外,與DNA熒光探針相比,D-aTNA熒光探針也有更高的猝滅效率和信噪比[62].不同組合的探針核酸序列是相同的,調(diào)整所帶熒光基團(tuán)的順序即可實(shí)現(xiàn)不同的編碼,因此鏈置換的反應(yīng)是通用的,避免了大量不同核酸鏈的引入[圖9(B)].巰基修飾的D-aTNA組合探針通過交聯(lián)劑連接到抗體或鬼筆環(huán)肽上,進(jìn)行抗原或纖維狀肌動(dòng)蛋白的識(shí)別.由于重復(fù)的熒光基團(tuán)也有順序差異,因此增加鏈置換的次數(shù)可以在有限熒光基團(tuán)種類的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)更多種目標(biāo)物的檢測(cè).

        基于抗體識(shí)別的核酸編碼擴(kuò)增,可檢測(cè)的目標(biāo)物種類更豐富、特異性更強(qiáng).但是抗體尺寸較大且二抗種類有限,在識(shí)別過程中容易造成位置信息不準(zhǔn)確.而納米抗體雖然尺寸縮小很多,但是制備過程較復(fù)雜.

        1.4 基于組合反應(yīng)的編碼原理

        為了獲取多種目標(biāo)物間的位置關(guān)系、相互作用情況等多層次分子信息,本課題組開發(fā)了基于多種分子逐級(jí)反應(yīng)的組合編碼原理.在偶聯(lián)反應(yīng)編碼的基礎(chǔ)上,Zhao等[63]利用1,3-茚二酮(1,3-Indandione,AI)疊氮衍生物將5-甲?;奏ぃ?-Formylcytosine,5fC)特異性標(biāo)記上疊氮基團(tuán),并與DBCO修飾的DNA條碼發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),同時(shí)采用sc5hmU/5hmC-microgel方法標(biāo)記5hmC,由此可為兩種目標(biāo)物分別標(biāo)記上部分序列互補(bǔ)的單鏈DNA條碼.進(jìn)一步開發(fā)鄰近連接反應(yīng)編碼原理,通過鄰近分子激活新的DNA條碼,可在獲得不同分子信息的同時(shí)獲得鄰近分子的關(guān)聯(lián)信息.掛鎖探針和兩種DNA條碼分別有一段互補(bǔ)序列,只有當(dāng)兩種條碼足夠近,即5hmC和5fC位點(diǎn)相鄰時(shí),掛鎖探針才能與兩個(gè)條碼發(fā)生鄰近連接反應(yīng)[64,65]被激活,在RCA后進(jìn)行熒光成像.在識(shí)別過程中,鄰近連接的掛鎖探針標(biāo)記后,再用另外兩種掛鎖探針對(duì)剩余的5hmC和5fC位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記,避免了先占用鄰近連接的位點(diǎn).

        針對(duì)更加復(fù)雜的生物分子的空間鄰近關(guān)系,本課題組發(fā)展了細(xì)胞大分子錨定的DNA步移索引成像方法(Cellular macromolecules-tethered DNA walking indexing,Cell-TALKING)[22]方法,通過組合偶聯(lián)反應(yīng)編碼、抗原-抗體免疫反應(yīng)編碼和鄰近連接反應(yīng)編碼成像組蛋白與其周圍5hmC,5hmU和5fU的位置關(guān)系.在這4種目標(biāo)物的標(biāo)記方法中,組蛋白的條碼通過抗原-抗體免疫反應(yīng)標(biāo)記,5hmC的標(biāo)記方法與sc5hmU/5hmC-microgel方法[23]相同,5hmU和5fU的標(biāo)記方法與生物正交的化學(xué)標(biāo)記成像單細(xì)胞內(nèi)兩種氧化胸腺嘧啶的方法[54]相同.位于組蛋白上的中心條碼和周圍表觀修飾的3種DNA條碼有一段通用的雜交互補(bǔ)序列,稱之為“鄰近條碼”.當(dāng)組蛋白與第一個(gè)目標(biāo)物鄰近時(shí),中心條碼和第一個(gè)DNA條碼發(fā)生雜交,并在聚合酶作用下延伸,互補(bǔ)形成一段帶有切刻酶位點(diǎn)的序列.加入切刻酶后,互補(bǔ)鏈在作用位點(diǎn)處發(fā)生斷裂,雜交長(zhǎng)度變短,雙鏈解旋,中心條碼恢復(fù)一端游離狀態(tài),同時(shí)第一個(gè)DNA條碼被標(biāo)記上中心條碼的互補(bǔ)序列.通過不斷重復(fù)這個(gè)過程,組蛋白周圍所有鄰近的3種表觀修飾位點(diǎn)都會(huì)被標(biāo)記上中心條碼,再通過RCA后成像其位置.CELL-TALKING的位置關(guān)系在已知修飾位點(diǎn)距離的DNA折紙上也進(jìn)行了驗(yàn)證(圖10).

        Fig.10 Schematic and data of Cell-TALKING[22]

        Raj等[49]聯(lián)合雜交反應(yīng)和化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng),提出了一種放大FISH信號(hào)的檢測(cè)方法,即點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)放大熒光原位雜交法(Click-amplifying FISH,clampFISH).他們將一級(jí)掛鎖探針的兩個(gè)末端分別修飾炔基和疊氮基團(tuán),掛鎖探針與目標(biāo)物mRNA雜交后,在銅催化下發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接成環(huán),降低了環(huán)直接雜交目標(biāo)物時(shí)的非特異性吸附.與連接酶將堿基連接成環(huán)相比,點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接提高了連接效率.沖洗后,帶有熒光基團(tuán)的二級(jí)掛鎖探針通過同樣的方法雜交到一級(jí)掛鎖探針上.不斷循環(huán)這個(gè)過程,每一級(jí)熒光探針都與上一級(jí)探針發(fā)生雜交-點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),直到熒光信號(hào)達(dá)到理想強(qiáng)度.

        組合反應(yīng)編碼方法通常是先用一種編碼方式使目標(biāo)物標(biāo)記上DNA條碼,再通過二次編碼使之前的DNA條碼再被標(biāo)記一個(gè)新的條碼.多次編碼對(duì)于逐步深入研究目標(biāo)物之間的關(guān)系發(fā)揮了重大作用.

        2 活細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像

        由于細(xì)胞膜具有選擇透過性,無法重復(fù)進(jìn)行雜交清洗,因此在固定細(xì)胞中常用的smFISH和RCA等方法不能直接應(yīng)用在活細(xì)胞中.目前常用的活細(xì)胞內(nèi)成像的方法主要有3類:第一類是通過細(xì)胞膜的胞吞胞吐作用,將帶有核酸探針的納米材料運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi),在胞內(nèi)激活后進(jìn)行后續(xù)的反應(yīng)[66~68];第二類是用和細(xì)胞膜類似的物質(zhì)(如脂質(zhì)體)包裹探針,通過膜融合將探針運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)[69~71];第三類是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)檢測(cè)所需的核酸或蛋白進(jìn)行成像[72~74].

        納米粒子在大量運(yùn)輸核酸探針進(jìn)入細(xì)胞方面有著顯著優(yōu)勢(shì),金納米粒子和硅納米粒子都是常用的納米材料[75~77].Zhang等[78]制備了一種負(fù)載DNA的金納米粒子3D水凝膠結(jié)構(gòu)(Au nanoparticle DNA hydrogel,AuDH),包含3種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核酶(DNAzyme)、與之部分序列互補(bǔ)的DNA熒光探針和激活的金屬離子.當(dāng)AuDH進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,目標(biāo)物微核糖核酸(microRNA,miRNA)通過鏈置換反應(yīng)與DNA熒光探針雜交,打開AuDH,發(fā)夾DNAzyme和金屬離子被釋放出來.DNA熒光探針再次通過鏈置換反應(yīng)打開DNAzyme的發(fā)夾結(jié)構(gòu),目標(biāo)物miRNA被釋放,繼續(xù)打開下一個(gè)AuDH,實(shí)現(xiàn)第一次循環(huán)放大.與DNA熒光探針雜交的DNAzyme在金屬離子的激活下,切斷底物中的核糖核苷酸位點(diǎn),使熒光探針的熒光團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅端,發(fā)出熒光信號(hào).同時(shí),DNAzyme與底物解旋后恢復(fù)游離狀態(tài),再識(shí)別下一個(gè)底物,實(shí)現(xiàn)第二次循環(huán)放大.AuDH負(fù)載了3套不同的miRNA檢測(cè)系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)3種miRNA的同時(shí)成像[圖11(A)].除了金納米粒子外,Yao等[79]合成了負(fù)載染料的介孔二氧化硅納米猝滅劑(Black hole quencher-doped mesoporoussilica nanoparticles,qMSNs).他們用目標(biāo)miRNA互補(bǔ)鏈封裝染料,將與甘油醛3-磷酸脫氫酶(Gyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)mRNA互補(bǔ)的發(fā)夾熒光探針修飾在納米粒子表面.miRNA與互補(bǔ)鏈結(jié)合后,染料被釋放,發(fā)出熒光信號(hào);同時(shí),GAPDH的mRNA將發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán),恢復(fù)熒光.該方法雖然結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單,但沒有循環(huán)放大信號(hào)的功能,在多檢測(cè)和信號(hào)擴(kuò)增上還有待進(jìn)一步改善.Zhao等[66]設(shè)計(jì)了一種金納米粒子負(fù)載的DNA信號(hào)放大系統(tǒng),可以同時(shí)成像細(xì)胞內(nèi)的miRNA和端粒酶.納米粒子上帶有兩種包含氧橋鳥嘌呤(Oxoguanine,oG)損傷位點(diǎn)和熒光基團(tuán)的DNA發(fā)夾以及兩種未激活的DNA“開關(guān)”.納米粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,miRNA與其對(duì)應(yīng)開關(guān)的封鎖鏈發(fā)生鏈置換反應(yīng),激活單鏈DNA開關(guān).開關(guān)再通過鏈置換反應(yīng)打開發(fā)夾,形成帶有oG位點(diǎn)的DNA雙鏈.同時(shí),端粒酶在識(shí)別其對(duì)應(yīng)開關(guān)后將末端延長(zhǎng)從而激活,延長(zhǎng)后的DNA單鏈開關(guān)同樣通過鏈置換反應(yīng)打開發(fā)夾并形成含有損傷位點(diǎn)的雙鏈結(jié)構(gòu).細(xì)胞內(nèi)的8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(Human 8-oxoguanine glycosylase 1,hOGG1)識(shí)別并切除oG,形成脫嘌呤嘧啶(Apurinic-Apyrimidinic,AP)位點(diǎn),在體內(nèi)堿基切除修復(fù)系統(tǒng)(Base-excision repair,BER)的作用下,雙鏈解旋,釋放出熒光信號(hào)和已激活的單鏈開關(guān),進(jìn)行下一輪的識(shí)別和放大.

        由于納米金類的納米材料制備繁瑣,且生物毒性存在爭(zhēng)議,因此利用DNA組裝的納米結(jié)構(gòu)在活細(xì)胞編碼中也發(fā)揮著重要作用.Xiang等[80]設(shè)計(jì)了一種多色編碼的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)Tetrahedron nanostructure(TetrNano),用于多路檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA.通過對(duì)4條單鏈進(jìn)行熱退火和連接,得到含有兩個(gè)熒光猝滅發(fā)夾的四面體DNA納米結(jié)構(gòu).MiRNA-21和miRNA-155分別打開兩個(gè)發(fā)夾,使其恢復(fù)熒光,實(shí)現(xiàn)兩種目標(biāo)物的同時(shí)成像[圖11(B),(C)].為了進(jìn)一步放大信號(hào)以檢測(cè)更低濃度的目標(biāo)物,Yang等[81]組裝了一種類似章魚觸手的納米結(jié)構(gòu).兩組CHA探針、AS1411適配體和生物素標(biāo)記的DNA鏈組成了DNA三棱鏡納米結(jié)構(gòu)(DNA triangular prism,DTP).3個(gè)DTP通過鏈霉親和素組成Streptavidin DTP(SA-DTP).AS1411適配體可以幫助SA-DTP更順利地進(jìn)入細(xì)胞.當(dāng)miRNA-21在第一個(gè)DTP上觸發(fā)對(duì)應(yīng)的CHA后,由于空間約束效應(yīng),重新釋放的目標(biāo)會(huì)快速傳遞到相鄰的DTP上,觸發(fā)其CHA,從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大,miRNA-155同理[圖12(A)].雖然DNA納米結(jié)構(gòu)的序列結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)較復(fù)雜,但在生物相容性和可控性方面有著顯著優(yōu)勢(shì).

        類膜結(jié)構(gòu)的運(yùn)輸可以提高運(yùn)輸效率,同時(shí)避免復(fù)雜的組裝過程.Zhao等[69]發(fā)現(xiàn),通過脂質(zhì)體將DNA回路所需的探針運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)后,細(xì)胞內(nèi)的端粒酶會(huì)激活啟動(dòng)探針,開啟回路.隨后,兩種RNA分別觸發(fā)各自的鏈置換循環(huán)反應(yīng),放大信號(hào)[圖12(B)].二進(jìn)制編碼原理同MERFISH.該方法利用細(xì)胞內(nèi)熵驅(qū)動(dòng)的多重DNA回路和信號(hào)編碼,分析了細(xì)胞內(nèi)端粒酶和兩種RNA的關(guān)系.與常用的酶驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增體系相比,無酶信號(hào)放大由于反應(yīng)條件簡(jiǎn)單,避免了酶促反應(yīng)中pH值和離子濃度的限制,在活細(xì)胞內(nèi)效率更高.Dong等[82]通過腫瘤細(xì)胞膜囊泡包裹修飾在納米粒子上的熒光探針和雙鏈特異性核酸酶(Double-specific nucleases,DSN),對(duì)細(xì)胞內(nèi)的3種miRNA進(jìn)行成像.當(dāng)miRNA與熒光探針結(jié)合形成雙鏈后,會(huì)被DSN迅速識(shí)別并將DNA鏈水解,發(fā)出熒光信號(hào).miRNA被釋放后繼續(xù)雜交下一條熒光探針,以此實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大.

        Fig.11 Schematic and data of nanoparticles and DNA nanostructures encoded amplification methods in live cells

        Pederson等[83]提出了CRISPRainbow方法,可以在活細(xì)胞內(nèi)利用可編程的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)及其內(nèi)切酶失活相關(guān)蛋白9(Dead CRISPR Associated Protein,dCas9)系統(tǒng)進(jìn)行DNA標(biāo)記成像.與之前改造規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白9(CRISPR Associated Protein9,Cas9)蛋白的方法不同,CRISPRainbow中結(jié)合熒光蛋白的對(duì)象為向?qū)NA(Single guide RNA,sgRNA).選用藍(lán)色、綠色和紅色的熒光蛋白,將帶有與目標(biāo)序列互補(bǔ)的sgRNA與含有6種組合熒光蛋白(3種單色和3種組合色)結(jié)合位點(diǎn)的適配體連接,構(gòu)建的質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后,通過CRISPR-dCas9靶向結(jié)合目標(biāo)物,進(jìn)行熒光成像[圖12(C)].在此基礎(chǔ)上,該團(tuán)隊(duì)又提出了CRISPR-Sirius方法,將8組重復(fù)的MS2RNA適配體插入到sgRNA四環(huán)上,結(jié)合更多的熒光蛋白,進(jìn)一步放大了熒光信號(hào),可以檢測(cè)更低拷貝數(shù)的目標(biāo)物[84].

        活細(xì)胞中條形碼的表達(dá)水平受多種因素影響,可能干擾后續(xù)檢測(cè)的準(zhǔn)確度,因此,Elowitz等[85]開發(fā)了一種不依賴于條形碼表達(dá)的高精度原位檢測(cè)技術(shù)Zombie.將T7/SP6/T3噬菌體啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DNA條碼整合到基因組中,這些條碼在細(xì)胞中由于缺乏相關(guān)酶而不會(huì)表達(dá).細(xì)胞內(nèi)的堿基編輯器或其它DNA修飾酶可以選擇性地改變條形碼序列,以增加條形碼的多樣性.細(xì)胞固定后,引入噬菌體的RNA聚合酶,使帶有DNA條碼的目標(biāo)序列開始原位轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增,RNA轉(zhuǎn)錄本由此開始積累并擴(kuò)散,再通過FISH進(jìn)行成像分析.此外,Zombie還可以有效區(qū)分20個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的DNA條形碼上單個(gè)堿基的差異.在編碼成像中既保留了細(xì)胞的空間位置信息,也提高了條碼分析精確度.類似的方法也可以追蹤體細(xì)胞突變的譜系信息.Cai等[86]提出了基于基因工程誘導(dǎo)突變與光學(xué)原位讀取的細(xì)胞歷史記錄(Memory by engineered mutagenesis with opticalin situreadout,MEMOIR)方法,將CRISPR/Cas9和seq-FISH結(jié)合,編碼后通過原位成像分析譜系遺傳信息.條碼由10段重復(fù)序列組成,在CRISPR/Cas9特異性切割下產(chǎn)生隨機(jī)的條碼缺失.每段條碼還帶有一段不被Cas系統(tǒng)識(shí)別的顏色條碼,通過seqFISH共定位成像.Cas系統(tǒng)與seqFISH結(jié)合也可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中染色質(zhì)動(dòng)態(tài)的可視化[87].熒光蛋白標(biāo)記的dCas9在活細(xì)胞中靶向到目標(biāo)位點(diǎn),隨后將細(xì)胞固定,通過seqFISH多輪成像.這類在活細(xì)胞中編碼、固定細(xì)胞后成像的方法有效解決了活細(xì)胞中不能多輪洗滌探針的問題.

        活細(xì)胞中核酸編碼擴(kuò)增受到細(xì)胞膜選擇透過性、生物相容性、無界面等諸多限制,在多輪編碼成像多種目標(biāo)物方面還有很大的阻礙.目標(biāo)物的編碼方式和擴(kuò)增方式都與固定細(xì)胞中的有所不同.如何在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)成百上千甚至更多種目標(biāo)物的編碼成像,依然是需要繼續(xù)研究的問題.

        Fig.12 Structure of DNA nanostructures and circuits and schematic of CRISPRainbow

        3 總結(jié)與展望

        本文綜合評(píng)述了單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像分析的方法以及在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展.通過核酸編碼擴(kuò)增的方式對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行了分類和總結(jié),部分方法列于表1.核酸編碼與信號(hào)擴(kuò)增結(jié)合,不僅可用于基于雜交識(shí)別的核酸序列檢測(cè)(如mRNA和miRNA),還拓展應(yīng)用于核酸非序列特征(堿基修飾、空間鄰近)以及蛋白等多層次、多水平目標(biāo)物分析,極大擴(kuò)展了單細(xì)胞熒光成像的目標(biāo)物范圍與應(yīng)用場(chǎng)景.

        核酸編碼擴(kuò)增利用化學(xué)反應(yīng)特異性識(shí)別標(biāo)記特定目標(biāo)物,將相似結(jié)構(gòu)分子間的微小化學(xué)結(jié)構(gòu)差異轉(zhuǎn)化為預(yù)先設(shè)計(jì)的DNA條碼的擴(kuò)增反應(yīng).進(jìn)一步聯(lián)合多輪擴(kuò)增編碼,即可同時(shí)特異、靈敏地檢出上萬種目標(biāo)物,為細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)聯(lián)合分析提供了有力的工具,在全基因組的數(shù)據(jù)分析和生物組織譜圖繪制中發(fā)揮重大的作用.

        目前,單細(xì)胞核酸編碼擴(kuò)增成像還面臨一些挑戰(zhàn).首先,缺少高通量、自動(dòng)化的單細(xì)胞成像方法.目前組學(xué)級(jí)別的目標(biāo)物編碼成像大多依賴多輪雜交、清洗,步驟繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng),檢測(cè)通量受限,迫切需要發(fā)展快捷、簡(jiǎn)便、能滿足規(guī)模化單細(xì)胞并行檢測(cè)的成像方法與平臺(tái).其次,目標(biāo)物標(biāo)記條碼的方式單一.除序列雜交與抗原-抗體免疫識(shí)別外,對(duì)于其它分子特征仍局限于點(diǎn)擊化學(xué)等少數(shù)幾種反應(yīng),發(fā)展反應(yīng)效率高、反應(yīng)條件溫和的多類型生物正交反應(yīng),將為單細(xì)胞成像分析提供更多的分子工具.最后,由于細(xì)胞膜的選擇透過性,外界物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的方式與效率有限,信號(hào)方式單一,放大效率不足,多目標(biāo)物檢測(cè)難度極大.如何在活細(xì)胞中進(jìn)行多輪編碼,以獲取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)隨時(shí)間、空間的動(dòng)態(tài)變化信息,是值得關(guān)注的重點(diǎn)問題.

        Table 1 Properties of in situ nucleic acids-encoded amplification methods

        猜你喜歡
        條碼探針核酸
        中國條碼技術(shù)與應(yīng)用協(xié)會(huì)
        條碼微站
        測(cè)核酸
        中華詩詞(2022年9期)2022-07-29 08:33:50
        全員核酸
        中國慈善家(2022年3期)2022-06-14 22:21:55
        第一次做核酸檢測(cè)
        快樂語文(2021年34期)2022-01-18 06:04:14
        核酸檢測(cè)
        中國(俄文)(2020年8期)2020-11-23 03:37:13
        多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
        BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
        透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
        基于固定條碼與電子標(biāo)簽比對(duì)設(shè)備的設(shè)計(jì)
        与漂亮的女邻居少妇好爽| 亚洲AV色无码乱码在线观看| 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜| 激情五月婷婷六月俺也去| 极品一区二区在线视频| 一边做一边喷17p亚洲乱妇50p| 精品无码专区久久久水蜜桃| 欧美久久中文字幕| 亚洲一区二区av天堂| 日韩在线精品视频免费| 中文字幕成人精品久久不卡91| 久久久国产精品| 看全色黄大色大片免费久久| 精品视频在线观看免费无码| 亚洲av一二三四又爽又色又色| 人成综合视频在线播放| 人妻中文无码久热丝袜| 亚洲精品黄网在线观看| 日本成年少妇人妻中文字幕 | 亚洲av无码专区国产乱码4se| 国产在视频线精品视频| 人人做人人妻人人精| 中文人妻无码一区二区三区| 一级黄片草逼免费视频| 中文无码av一区二区三区| 成 人 免费 黄 色 视频| 国产一区二区三区精品久久呦| 日韩精品有码在线视频| 国产精品福利高清在线| 欧美乱人伦人妻中文字幕| 国产suv精品一区二区| 亚洲AV秘 无码一区二区三区 | 人妻聚色窝窝人体www一区| 精品国产亚洲一区二区在线3d| 亚洲成生人免费av毛片| 丰满人妻熟妇乱又仑精品| 夜夜嗨av一区二区三区| 日韩欧美精品有码在线观看| 亚洲黄色av一区二区三区| 丁字裤少妇露黑毛| 国产亚洲av人片在线观看|