趙恒智，余方志，李翔菲，李樂樂

（國家納米科學(xué)中心,中國科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190）

脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）作為主要的遺傳物質(zhì)在生命系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用.得益于DNA分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)特性以及一系列功能性DNA如核酸適體（Aptamer，可與目標(biāo)物發(fā)生特異性結(jié)合）、脫氧核酶（DNAzyme，具有類酶催化功能）的發(fā)現(xiàn)，DNA被廣泛應(yīng)用于生物傳感、生物成像、藥物遞送和疾病治療等領(lǐng)域［1～8］.DNA在上述領(lǐng)域的應(yīng)用中具有諸多方面的優(yōu)勢(shì).首先，DNA可以通過固相合成實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的化學(xué)合成，其具有易于合成及易于化學(xué)修飾的優(yōu)點(diǎn)［9，10］.此外，DNA還具有可編程性強(qiáng)以及生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，極大地推動(dòng)了DNA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用.另一方面，由于小尺寸效應(yīng)，納米材料具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)及磁學(xué)特性，在生物成像等領(lǐng)域中表現(xiàn)出優(yōu)良的應(yīng)用潛力［11～13］.通過將這些納米材料與DNA進(jìn)行結(jié)合，不僅可以整合DNA及納米顆粒各自的優(yōu)勢(shì)，還可以催生出單一成分所沒有的協(xié)同特性，實(shí)現(xiàn)新型生物成像應(yīng)用［14～16］.

由于具有獨(dú)特的光學(xué)、磁學(xué)等性質(zhì)，鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換納米顆粒（Upconversion nanoparticles，UCNPs）受到了廣泛關(guān)注［17～21］.與傳統(tǒng)的發(fā)光材料如量子點(diǎn)、碳點(diǎn)等不同，UCNPs通過非線性光學(xué)過程展現(xiàn)出反斯托克斯的發(fā)光特性.在該過程中，UCNPs在低能量光子如近紅外（Near-infrared，NIR）光輻射下可連續(xù)吸收2個(gè)或多個(gè)光子，產(chǎn)生較短波長的紫外（Ultraviolet，UV）光或可見光［21］.UCNPs具有如下優(yōu)勢(shì)：首先，UCNPs的激發(fā)光處于NIR窗口，不僅可以大幅降低來自生物系統(tǒng)的自發(fā)熒光背景干擾，還能有效避免光引起的組織損傷；其次，NIR光具有更高的組織穿透深度，可實(shí)現(xiàn)活體水平的生物成像；第三，UCNPs發(fā)光穩(wěn)定性好，可以有效地抵抗光漂白；因此被廣泛應(yīng)用于生物成像［5，19］.此外，通過在UCNPs中摻入不同的鑭系離子，可在同一激發(fā)波長照射下實(shí)現(xiàn)多色發(fā)光成像分析.近年來，基于DNA與UCNPs相結(jié)合的生物成像技術(shù)備受關(guān)注.這種交叉融合能夠?qū)NA的分子識(shí)別功能與UCNPs的光學(xué)性能相結(jié)合，從而開發(fā)出新型生物成像策略，為疾病的診斷及病理學(xué)研究提供新工具.

本文聚焦基于DNA與UCNPs結(jié)合的生物成像策略，并根據(jù)工作原理將其歸納為3種成像方法（圖1）.第一種方法，將具有腫瘤標(biāo)志物識(shí)別能力的核酸適體與UCNPs結(jié)合，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向成像.第二種方法，UCNPs作為能量供體與DNA結(jié)合，構(gòu)建基于發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（Luminescence resonance energy transfer，LRET）機(jī)制的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的檢測(cè)與成像分析.第三種方法，通過構(gòu)建光響應(yīng)的DNA傳感器，并引入U(xiǎn)CNPs作為控制單元，實(shí)現(xiàn)NIR光操控的、時(shí)空選擇性分子傳感與成像.本文將分別對(duì)這3種成像策略的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，并對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展前景進(jìn)行了展望.

Fig.1 Schematic illustration of biosensing and imaging strategies based on the integration of DNA and UCNPs

1 DNA-UCNPs用于腫瘤靶向成像

光學(xué)成像技術(shù)是一種分辨率高、具有原位實(shí)時(shí)能力的成像手段，其在生理病理學(xué)研究以及疾病診斷等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，是醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中不可或缺的研究工具.與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料及量子點(diǎn)等熒光材料不同，UCNPs可在NIR光的激發(fā)下產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光，從而能夠在生物成像應(yīng)用中大幅降低生物樣品所產(chǎn)生的自體熒光干擾并實(shí)現(xiàn)深層組織成像.利用UCNPs對(duì)腫瘤部位進(jìn)行特異性地標(biāo)記，可視化地分辨病變組織與正常組織，有望用于腫瘤診斷及手術(shù)導(dǎo)航.然而，UCNPs本身不具有腫瘤特異性識(shí)別功能，需將其與具有靶向功能的配體相結(jié)合以實(shí)現(xiàn)相關(guān)應(yīng)用.

核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選出的具有特定序列的寡核苷酸，能夠與特定目標(biāo)物結(jié)合，具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力和特異性［22～24］.由于與抗體的功能相似，適體常被稱為“化學(xué)抗體”.迄今，通過SELEX技術(shù)已經(jīng)篩選出大量的核酸適體，可以特異性識(shí)別小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞及組織［25～29］.因此，將具有腫瘤靶向功能的核酸適體修飾在UCNPs表面，有望實(shí)現(xiàn)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的腫瘤成像.例如，通過配體交換法將AS1411適體（可與癌細(xì)胞表面過表達(dá)的核仁素結(jié)合）修飾在UCNPs表面，實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞MCF-7的靶向成像［圖2（A）］［30］.該納米探針孵育后的MCF-7細(xì)胞在NIR光激發(fā)下顯示出強(qiáng)烈的上轉(zhuǎn)換發(fā)光，而同樣條件下，核仁素陰性細(xì)胞NIH-3T3并未展現(xiàn)出明顯的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)，表明其腫瘤靶向成像功能.Tan課題組［31］通過在UCNPs表面修飾與細(xì)胞膜受體蛋白酪氨酸激酶7（Protein tyrosine kinase 7，PTK7）特異性結(jié)合的sgc8適體，并引入光敏劑分子，實(shí)現(xiàn)了PTK7過表達(dá)癌細(xì)胞CEM的靶向成像及光動(dòng)力治療［圖2（B）］.隨后，該課題組［32］將帶有AS1411適體的DNA四面體框架核酸修飾于UCNPs表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌細(xì)胞的靶向成像.

Fig.2 DNA-UCNPs for aptamer-mediated targeted tumor imaging

比率成像的策略能夠降低環(huán)境及儀器效率等造成的干擾，從而可獲得更為可靠的成像信息.UCNPs具有可調(diào)的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性.通過精準(zhǔn)的設(shè)計(jì)合成及調(diào)控，能夠制備出多色上轉(zhuǎn)換發(fā)光的UCNPs，用于構(gòu)建腫瘤比率成像分析方法.Zhang課題組［33］制備了雙色發(fā)光的UCNPs，并對(duì)其進(jìn)行核酸適體修飾以及藥物裝載，用于腫瘤成像及治療.如圖2（C）所示，修飾于UCNPs表面的sgc8適體鏈與攜帶猝滅劑BHQ-1的單鏈DNA部分雜交，使UCNPs的綠色發(fā)光被猝滅劑BHQ-1猝滅，從而只顯現(xiàn)出紅色發(fā)光.UCNPs表面核酸適體與癌細(xì)胞表面受體PTK7結(jié)合會(huì)引起核酸適體構(gòu)象變化，從而釋放攜帶猝滅劑BHQ-1的單鏈DNA并使光敏劑分子PPA靠近UCNPs.該靶向過程會(huì)引起UCNPs綠色發(fā)光的恢復(fù)以及UCNPs與PPA之間能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的紅色發(fā)光降低.因此，可根據(jù)綠光強(qiáng)度與紅光強(qiáng)度的比率實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)成像.此外，核酸適體構(gòu)象的改變還能夠同時(shí)觸發(fā)化療藥物的釋放以及光動(dòng)力治療的開啟，從而實(shí)現(xiàn)集腫瘤成像、化療藥物釋放及光動(dòng)力治療的一體化.

2基于DNA-UCNP的LRET傳感器

UCNPs具有獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性，其激發(fā)波長處于NIR窗口，因此可將其作為能量供體用于構(gòu)建基于LRET的化學(xué)與生物傳感器，從而解決傳統(tǒng)熒光團(tuán)激發(fā)波長較短帶來的限制.此外，還可以利用UCNPs可調(diào)的多色發(fā)光特性發(fā)展比率型分子傳感與成像策略.

MicroRNA（miRNA）是一種非編碼RNA，在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用.研究表明，miRNA的表達(dá)水平與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［34～36］.因此，miRNA可作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物用于癌癥的診斷及治療.Zhu課題組［37］通過將雙受體分子標(biāo)記的cDNA（miRNA互補(bǔ)序列）在靜電作用下吸附于UCNPs表面，構(gòu)建了用于活細(xì)胞內(nèi)miRNA成像的納米傳感器［圖3（A）］.在初始狀態(tài)下，受體分子與能量供體UCNPs之間距離接近，可通過LRET猝滅UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光.當(dāng)目標(biāo)miRNA存在時(shí)，其能與cDNA雜交并形成穩(wěn)定的DNA/RNA異源雙鏈結(jié)構(gòu).由于雙鏈結(jié)構(gòu)具有較大的剛性，使其與UCNPs之間的親和力下降并從UCNPs表面釋放，從而中斷受體分子與供體UCNPs之間的LRET作用，進(jìn)而恢復(fù)UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光用于miRNA檢測(cè).該傳感器進(jìn)一步被用于活細(xì)胞內(nèi)miRNA的原位成像分析.Na課題組［38］將靶標(biāo)miRNA的互補(bǔ)DNA序列分成兩段，并將其中一段修飾于能量供體UCNPs表面，另一段進(jìn)行受體熒光團(tuán)TAMRA標(biāo)記，構(gòu)建了一種基于LRET的miRNA傳感策略.該方法利用靶標(biāo)miRNA的“橋聯(lián)”作用將受體熒光團(tuán)標(biāo)記的互補(bǔ)DNA捕獲至UCNPs表面，從而通過LRET作用影響UCNPs發(fā)光，實(shí)現(xiàn)miRNA的傳感檢測(cè).DNA自組裝能夠賦予DNA納米結(jié)構(gòu)規(guī)則的幾何構(gòu)型以及良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.受此啟發(fā)，Kuang課題組［39］合成了以DNA為框架，金納米顆粒和UCNPs為頂點(diǎn)的納米金字塔探針，用于細(xì)胞內(nèi)miRNA的檢測(cè)與成像.良好的幾何構(gòu)型使得UCNPs與金納米顆粒之間發(fā)生LRET過程，從而猝滅UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光.目標(biāo)miRNA的存在可觸發(fā)DNA框架的瓦解，導(dǎo)致UCNPs與金納米顆粒之間的LRET中斷，從而恢復(fù)UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光以實(shí)現(xiàn)miRNA檢測(cè).此外，該納米金字塔探針還可通過圓二色光譜信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA的定量檢測(cè).最近，Ding等［40］利用雙色發(fā)光的UCNPs作為能量供體并提供內(nèi)參信號(hào)，結(jié)合miRNA觸發(fā)的發(fā)夾DNA自組裝反應(yīng)，構(gòu)建了自參比信號(hào)放大的納米傳感器.目標(biāo)miRNA引發(fā)的發(fā)夾DNA自組裝反應(yīng)能夠?qū)⑹荏w熒光團(tuán)拉近至供體UCNPs表面，從而通過LRET效應(yīng)引起信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中miRNA的高靈敏比率成像［圖3（B）］.miR122作為一種新興的肝損傷生物標(biāo)志物，在藥物性肝損傷檢測(cè)中展現(xiàn)出巨大潛力.Li課題組［41］以UCNPs為供體，金納米籠為能量受體及藥物載體，并基于miR122介導(dǎo)的DNA鏈置換反應(yīng)，構(gòu)建了藥物性肝損傷成像及按需給藥的一體化納米診療平臺(tái).

Fig.3 LRET-based DNA-UCNP sensors

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）是生物體中普遍存在的生物活性分子，在能量傳遞、酶催化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用.Chen課題組［42］將ATP適體的互補(bǔ)序列DNA修飾于UCNPs表面并與Cy3熒光團(tuán)標(biāo)記的ATP適體鏈雜交，構(gòu)建了ATP傳感器.在初始狀態(tài)下，能量供體UCNPs與受體熒光團(tuán)Cy3間的LRET使得UCNPs的發(fā)光被猝滅.ATP能夠與適體鏈發(fā)生特異性結(jié)合，從而使Cy3標(biāo)記的適體DNA從UCNPs表面釋放并中斷LRET作用，恢復(fù)UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光.該傳感器進(jìn)一步被用于活細(xì)胞內(nèi)ATP的原位成像分析.通過選擇不同的功能性DNA，該方法可應(yīng)用于其它小分子的檢測(cè)與成像.Lee課題組［43］以UCNP為供體，氧化石墨烯為受體，通過多巴胺適體將兩者進(jìn)行集成，構(gòu)建了多巴胺生物傳感器，用于檢測(cè)干細(xì)胞來源多巴胺能神經(jīng)元中釋放的多巴胺分子.近期，Zhang課題組［44］將Pb2+選擇性DNAzyme探針修飾于UCNPs表面，基于LRET原理，構(gòu)建了特異性成像Pb2+的納米傳感器.

通過摻雜不同元素，UCNPs在NIR光激發(fā)下具有可調(diào)的多色發(fā)光，為生理病理過程中多靶標(biāo)檢測(cè)提供了新工具.Liu課題組［45］開發(fā)了一種DNA-UCNPs納米傳感器，用于溶酶體中K+及pH的多靶標(biāo)成像分析［圖3（C）］.該納米傳感器主要由UCNP能量供體、金納米顆粒受體及具有K+或pH響應(yīng)能力的DNA分子連接而成.K+會(huì)觸發(fā)富鳥嘌呤序列DNA分子形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，使得UCNP和金納米顆粒相互靠近，通過LRET作用猝滅UCNP的綠色發(fā)光.同時(shí)，酸性pH條件下胞嘧啶的質(zhì)子化驅(qū)動(dòng)C+·G-C三鏈體DNA的形成，使發(fā)射藍(lán)光的UCNP和金納米顆?？拷?，導(dǎo)致藍(lán)光猝滅.因此，通過引入不同上轉(zhuǎn)換發(fā)光的UCNPs供體，可在NIR光激發(fā)下實(shí)現(xiàn)pH和K+的同時(shí)成像分析.該體系為溶酶體生物化學(xué)研究提供了新方法.研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體中H+的流入會(huì)伴隨著K+的流出.Kuang課題組［46］將2種含有不同miRNA識(shí)別序列、不同熒光修飾的DNA分子連接于UCNPs表面，并進(jìn)一步與納米金棒進(jìn)行組裝，構(gòu)建了可同時(shí)成像2種不同靶標(biāo)miRNA的納米組裝體探針.能量供體UCNPs與受體納米金棒之間的LRET使得上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號(hào)被猝滅.在目標(biāo)miRNA的存在下，miRNA通過與DNA分子中識(shí)別序列的雜交將UCNP從納米金棒表面釋放，進(jìn)而開啟供體UCNP與受體熒光團(tuán)之間的LRET作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)2種miRNA的檢測(cè)及成像.該課題組［47］進(jìn)一步構(gòu)建了拉曼-上轉(zhuǎn)換發(fā)光雙模式成像納米探針，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)miRNA及端粒酶活性的定量分析.

3 基于DNA-UCNPs的時(shí)空選擇性分子傳感與成像

傳統(tǒng)傳感器的設(shè)計(jì)采用“始終開啟”的策略，即只要有靶標(biāo)分子輸入便會(huì)產(chǎn)生成像信號(hào).該類傳感系統(tǒng)在復(fù)雜生命體系（如細(xì)胞內(nèi)和活體）中的應(yīng)用面臨一個(gè)關(guān)鍵難題，即其在被遞送至目標(biāo)區(qū)域的過程中可對(duì)靶標(biāo)分子提前響應(yīng)，導(dǎo)致成像的精準(zhǔn)度受限［48］.因此，如何實(shí)現(xiàn)“時(shí)-空”可控的分子傳感與成像成為該領(lǐng)域的一個(gè)前沿科學(xué)問題.

針對(duì)這一問題，本課題組［49］通過引入U(xiǎn)CNPs作為控制模塊，率先提出了上轉(zhuǎn)換發(fā)光激活型傳感方法，以實(shí)現(xiàn)時(shí)空選擇性分子傳感與成像.如圖4（A）所示，設(shè)計(jì)了含有UV光敏感基團(tuán)（PC）的互補(bǔ)鏈與ATP適體雜交，封閉其ATP識(shí)別功能.同時(shí)，互補(bǔ)鏈3′端標(biāo)記的猝滅基團(tuán)可以有效猝滅適體鏈5′端標(biāo)記的熒光基團(tuán)Cy3.進(jìn)一步將構(gòu)建的DNA傳感器與UCNPs結(jié)合，構(gòu)建了近紅外光調(diào)控的傳感器件.在NIR光照射下，UCNPs將其轉(zhuǎn)換為UV光以切割互補(bǔ)鏈中的PC基團(tuán)，導(dǎo)致互補(bǔ)鏈與適體鏈的雜交親和力降低，進(jìn)而恢復(fù)核酸適體對(duì)ATP的識(shí)別能力.核酸適體鏈通過結(jié)合ATP發(fā)生構(gòu)象變化，與互補(bǔ)鏈分離，從而恢復(fù)Cy3熒光信號(hào).利用該方法，通過NIR光控制實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞中ATP分子的時(shí)空選擇性成像分析.這一概念性方法自提出以來已經(jīng)在生物傳感與成像領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［48］.例如，本課題組通過合理設(shè)計(jì)光激活型DNA傳感體系，將該方法拓展至miRNA和pH的精準(zhǔn)成像分析［50，51］.Lu課題組［52］通過引入“光籠”基團(tuán)對(duì)DNAzyme的切割底物進(jìn)行保護(hù)，設(shè)計(jì)了一種UV光激活的金屬離子成像探針，并將UCNPs作為控制模塊與其結(jié)合，開發(fā)了一種NIR光激活的金屬離子傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)和斑馬魚胚胎中鋅離子的成像分析.為增強(qiáng)DNA探針的生物穩(wěn)定性，Pang課題組［53］將基于DNA四面體結(jié)構(gòu)的miRNA納米傳感器與UCNPs進(jìn)行集成，開發(fā)了可示蹤細(xì)胞內(nèi)miRNA的NIR光激活型DNA納米機(jī)器.DNA馬達(dá)是一種動(dòng)態(tài)的DNA納米機(jī)器，其可通過鏈置換反應(yīng)或DNAzyme切割反應(yīng)增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大傳感信號(hào)［54］.近期，Li課題組［55］利用UCNPs構(gòu)建DNA馬達(dá)，經(jīng)NIR光啟動(dòng)目標(biāo)mRNA介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)及連續(xù)的DNAzyme切割反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物生存素mRNA的高靈敏成像分析.此外，以同時(shí)成像多種miRNA分子為目標(biāo)，Luo課題組［56］將UV光響應(yīng)的DNA納米探針與UCNPs相結(jié)合，構(gòu)建了能夠成像細(xì)胞內(nèi)多種miRNA的NIR光調(diào)控型納米傳感器.最近，該課題組［57］通過在UCNPs表面修飾UV光敏感的劈裂型DNAzyme探針，實(shí)現(xiàn)了NIR光控制的目標(biāo)RNA高靈敏成像分析.在該設(shè)計(jì)中，NIR光的照射能夠恢復(fù)劈裂型DNAzyme探針的靶標(biāo)RNA識(shí)別能力，并通過與靶標(biāo)RNA的雜交激活DNAzyme的切割能力，從而產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)用于靶標(biāo)RNA成像.基于DNA的分子邏輯電路由于能夠在生物系統(tǒng)中執(zhí)行復(fù)雜的信息處理而受到研究者們的廣泛關(guān)注.本課題組［58］將DNA邏輯電路的概念與上轉(zhuǎn)換納米技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了NIR光激活的多靶標(biāo)分子關(guān)聯(lián)性成像分析方法，展示了利用上轉(zhuǎn)換納米技術(shù)對(duì)DNA邏輯運(yùn)算進(jìn)行時(shí)空操控的潛力.

生物分子在細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空分布受到嚴(yán)密而精細(xì)的調(diào)控以保證各種生化反應(yīng)的高效有序進(jìn)行，從而維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)［59，60］.因此，在亞細(xì)胞水平對(duì)生物分子的分布及濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有利于深入研究探索各種生理和病理過程，為生命科學(xué)的研究和重大疾病的診療提供更多依據(jù).為了實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞水平靶標(biāo)分子的精確檢測(cè)，本課題組［61］設(shè)計(jì)了UV光響應(yīng)的DNA探針，通過將其與UCNPs及線粒體靶向配體相結(jié)合，構(gòu)建了DNA納米傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞線粒體中2種癌癥相關(guān)miRNA的精準(zhǔn)成像［圖4（B）］.在該體系中，DNA傳感系統(tǒng)由基于toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)設(shè)計(jì)而成.只有在PC基團(tuán)被光解以后，靶標(biāo)miRNA（miR-10b和miR-21）才能夠通過兩步連續(xù)的鏈置換反應(yīng)將猝滅基團(tuán)標(biāo)記的互補(bǔ)鏈替換，從而恢復(fù)Cy5的熒光信號(hào).因此，可以在DNA納米傳感器定位至線粒體后，通過NIR光照射遠(yuǎn)程開啟其傳感功能，特異性地對(duì)線粒體內(nèi)miR-10b和miR-21進(jìn)行關(guān)聯(lián)性成像分析.鑒于該方法在miRNA空間限制性成像中的成功應(yīng)用，本課題組［62］進(jìn)一步開發(fā)了NIR光激活的細(xì)胞器靶向型納米傳感器，分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)線粒體和細(xì)胞核內(nèi)脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1）活性的精準(zhǔn)成像分析.利用該酶活納米傳感器發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激刺激會(huì)引起APE1在亞細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)遷移.在此基礎(chǔ)上，本課題組［63］將APE1響應(yīng)的DNA探針、光敏劑分子及線粒體靶向配體與UCNP相結(jié)合，構(gòu)建了一種多功能的DNA納米器件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)光動(dòng)力治療過程中線粒體內(nèi)APE1酶活的實(shí)時(shí)成像分析.

Fig.4 DNA-UCNPs for spatiotemporally selective molecular sensing and imaging

4 總結(jié)與展望

由于DNA的分子識(shí)別功能及UCNPs獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，二者的有機(jī)結(jié)合在生物傳感與成像方面顯示出良好的潛力和應(yīng)用價(jià)值，本文綜合評(píng)述了該領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展.將該DNA-UCNPs體系分為3類：（1）DNA-UCNPs用于腫瘤靶向成像.該策略通過將具有靶向功能的DNA分子（如核酸適體）修飾于UCNPs表面，利用UCNPs獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光對(duì)靶細(xì)胞和組織進(jìn)行成像.（2）基于LRET機(jī)制的DNA-UCNPs生物傳感器.該策略通過將UCNPs作為能量供體引入到DNA傳感器中，不僅可以將激發(fā)光置于NIR窗口，還可以通過UCNPs可調(diào)的多色發(fā)光特性，實(shí)現(xiàn)比率型分子檢測(cè)及多靶標(biāo)成像.（3）DNA-UCNPs用于時(shí)空選擇性分子成像.該策略將UCNPs作為控制模塊，利用NIR光遠(yuǎn)程開啟DNA傳感模塊的傳感功能，從而實(shí)現(xiàn)“時(shí)-空”可控的分子成像.此外，將該策略與細(xì)胞器靶向配體相結(jié)合，可進(jìn)一步在亞細(xì)胞水平對(duì)特定細(xì)胞器內(nèi)的靶標(biāo)分子進(jìn)行精準(zhǔn)成像分析.

盡管目前取得了一系列進(jìn)展，但在未來的研究中仍有一些問題亟需解決.（1）在DNA-UCNPs用于腫瘤靶向成像的應(yīng)用中，功能DNA分子通常以共價(jià)方式偶聯(lián)至UCNPs表面，步驟繁冗，效率較低.此外，帶負(fù)電的DNA和帶正電的UCNPs之間存在較強(qiáng)的靜電相互作用，DNA磷酸基團(tuán)與UCNPs上稀土間存在強(qiáng)配位作用，這些均可能導(dǎo)致偶聯(lián)后的功能DNA分子失去空間構(gòu)象，從而喪失靶標(biāo)識(shí)別的能力.因此，在未來的研究中，可通過引入能夠保持核酸適體識(shí)別能力的三維DNA結(jié)構(gòu)或削弱核酸適體與UCNPs之間相互作用的表面處理技術(shù)來應(yīng)對(duì)該問題.（2）在基于DNA-UCNPs的LRET傳感器中，UCNPs作為能量供體，基于LRET效應(yīng)，以上轉(zhuǎn)換發(fā)光或受體熒光來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的成像與定量分析.然而，以發(fā)光強(qiáng)度作為信號(hào)輸出會(huì)受到組織深度不均等因素的影響，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的定量分析.而發(fā)光壽命受上述因素的影響較小，因此可利用發(fā)光壽命作為信號(hào)輸出，實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)的分子傳感與成像.（3）在DNA-UCNPs用于時(shí)空選擇性分子傳感與成像的應(yīng)用中，DNA傳感模塊的激活效率與UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率緊密相關(guān).已有研究顯示，通過在UCNPs表面修飾適合的熒光團(tuán)可顯著提高光子的上轉(zhuǎn)換效率［64］，在未來的應(yīng)用研究中可以考慮利用相關(guān)方法提高DNA傳感模塊的激活效率.（4）由于UCNPs的激發(fā)光處于NIR窗口，其較高的組織穿透深度使得UCNPs在活體成像方面擁有著巨大的潛力［65，66］.最近，具有更深組織穿透深度的NIR-II區(qū)UCNPs也被用于活體傳感及成像［67］.此外，UCNPs可調(diào)的多色發(fā)光特性使其還能夠應(yīng)用于活體水平的多色成像［68］.目前，DNA-UCNPs在細(xì)胞成像方面已取得了較大進(jìn)展，然而其在活體成像中的應(yīng)用仍處于初步階段.因此，DNA-UCNPs在活體成像方面的應(yīng)用具有廣闊的探索空間.