張 鈐，劉雅薇，王 帆，劉 凱，，張洪杰，

（1.清華大學化學系,稀土新材料教育部工程研究中心,北京 100084；2.中國科學院長春應(yīng)用化學研究所,稀土資源利用國家重點實驗室,長春 130022）

熒光成像是一類重要的生物成像技術(shù).與X射線計算機斷層掃描（CT）、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、單光子發(fā)射計算機斷層掃描（SPECT）和磁共振（MR）等成像技術(shù)相比，熒光成像具有反饋速度快、靈敏度高、無電離輻射、高時空分辨率等優(yōu)勢［1～4］.活體熒光成像作為一種非侵入式手段，在了解生物體結(jié)構(gòu)、監(jiān)測生命活動以及疾病診療等方面具有巨大的應(yīng)用潛力.然而，通常使用的熒光試劑的激發(fā)和發(fā)射波長均位于可見光區(qū)域，在生物組織中會發(fā)生強烈的吸收和散射，對活體組織的穿透能力有限，穿透深度一般小于3 mm，難以用于活體成像.根據(jù)瑞利散射公式，波長較大的光受到的散射較?。淮送?，波長大于1000 nm后，生物組織的自發(fā)熒光也顯著降低［5］.以上兩點使得近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000～1700 nm）生物窗口在活體熒光成像中具有更大的應(yīng)用潛力.由于水在1450 nm有強烈的吸收，因此以此為界NIR-Ⅱ又被分為NIR-Ⅱa（1000～1400 nm）和NIR-Ⅱb（1500～1700 nm）.戴宏杰課題組［6］于2009年用單壁碳納米管（SWNTs）首次實現(xiàn)了NIR-Ⅱ的活體熒光成像，開拓了NIR-Ⅱ區(qū)吸收/發(fā)射熒光成像試劑在活體成像領(lǐng)域的應(yīng)用.

此后，近紅外激發(fā)和發(fā)射的熒光成像試劑成為研究熱點，如半導體量子點（QDs）［7］、有機小分子染料［8］、半導體聚合物納米顆粒（SPNPs）［9，10］、聚集誘導發(fā)光（AIE）分子和稀土納米顆粒（RENPs）等材料.其中，RENPs具有豐富的能級，可以進行近紅外激發(fā)的上轉(zhuǎn)換（UC）和下轉(zhuǎn)換（DC）發(fā)光，且具有大斯托克斯位移、高化學穩(wěn)定性、長熒光壽命和尖銳的發(fā)射光譜，因而成為了一類重要的熒光成像探針.RENPs一般由惰性稀土納米晶基質(zhì)摻雜少量的發(fā)光稀土離子組成，其中，摻雜的稀土離子一般不止一種，而是由兩種或更多的離子構(gòu)成敏化劑-激活劑體系.稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）主要的發(fā)射光是Er3+發(fā)射的560 nm綠光、660 nm紅光以及Tm3+發(fā)射的470 nm藍光、700 nm紅光和800 nm近紅外光.然而，較強的散射使得這些熒光探針的成像信噪比、靈敏度、分辨率和穿透深度并不理想［11～13］.隨著生物醫(yī)學研究的深入，為了獲得生物體結(jié)構(gòu)（如血管、神經(jīng)、器官等）更豐富、更精確的信息，加強對生命活動的理解和監(jiān)控以及對疾病的診療效果，提高分辨率成為了活體熒光成像的重要發(fā)展方向.與傳統(tǒng)活體熒光成像相比，高分辨熒光成像不僅能對腫瘤之類體積較大的組織或病灶進行成像，還能對腦血管、骨骼、轉(zhuǎn)移腫瘤等體積或?qū)挾容^小、傳統(tǒng)方法難于分辨的組織或病灶進行高精度的成像，從而大大拓寬熒光成像在診療中的應(yīng)用范圍，提高診療效率.與其它NIR-Ⅱ熒光成像試劑相比，RENPs擁有大斯托克斯位移、低毒性、高化學穩(wěn)定性的優(yōu)勢，適用于生物體內(nèi)的長時程成像，因此極具作為NIR-Ⅱ活體高分辨熒光成像試劑的潛力.近年來，研究者們通過多種手段增強RENPs的DC NIR-Ⅱ發(fā)射，有效提高了活體成像分辨率.目前，以RENPs為熒光探針的超分辨成像分辨率已經(jīng)可以達到20～40 nm［14～16］，而在活體成像方面，受限于儀器設(shè)備和組織厚度，RENPs目前可達到微米級的成像分辨率，能夠在小鼠顱內(nèi)、腹腔、四肢等位置實現(xiàn)對血管、淋巴、骨骼、腫瘤等組織的清晰成像.在實現(xiàn)高分辨成像的基礎(chǔ)上，研究者們采用多種表面修飾策略增強RENPs的生物相容性、實現(xiàn)功能化，并以此為基礎(chǔ)開發(fā)了一系列具有診斷、傳感、治療等功能的新型成像試劑.本文將綜合評述近年來RENPs在高分辨活體成像領(lǐng)域的研究進展及其在醫(yī)學診療中的應(yīng)用，并對其未來發(fā)展方向進行了展望.

1 RENPs的NIR-Ⅱ熒光增強及活體高分辨熒光成像

2013年，Moghe課題組［17］首次用RENPs實現(xiàn)了NIR-Ⅱ活體熒光成像，并以NaYF4∶Yb，Er@NaYF4為例證明了其發(fā)射的1525 nm近紅外光在血液、腫瘤以及活體小鼠中比550 nm綠光的穿透力和分辨率高，其穿透深度可達毫米級，分辨率可達微米級.2014年，張凡課題組［18］通過多層核殼結(jié)構(gòu)調(diào)控優(yōu)化NaYF4∶Yb，Er納米顆粒（NPs）的發(fā)光性能，并通過Nd3+摻雜實現(xiàn)了穿透力更強、光熱損傷更低的808 nm激光激發(fā)的1060，1525 nm雙模NIR-Ⅱ下轉(zhuǎn)換發(fā)光.活體成像結(jié)果表明，雖然水對1525 nm光的吸收強于1060 nm光，但更低的散射仍然使1525 nm光的成像穿透深度和檢測限優(yōu)于1060 nm.這說明在活體熒光成像中，散射對成像質(zhì)量的影響遠大于吸收.這兩項工作驗證了RENPs用于近紅外二區(qū)活體生物成像的可行性，推動了RENPs在醫(yī)學領(lǐng)域的發(fā)展及應(yīng)用.下面將介紹不同敏化體系下的RENPs NIR-Ⅱ熒光增強策略及其在高分辨活體熒光成像中的應(yīng)用.

1.1 Yb3+敏化的RENPs

Yb3+在980 nm有強吸收（2F7/2→2F5/2），且其能級可以很好地與常用的發(fā)光離子Er3+，Tm3+，Ho3+等相匹配，所以被廣泛用于敏化RENPs［19］.Yb3+敏化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光系統(tǒng)早在1972年就已經(jīng)被報道［20］，如今仍在RENPs中被廣泛使用.

通過離子摻雜、核殼結(jié)構(gòu)和基質(zhì)晶格的設(shè)計來增強RENPs的NIR-Ⅱ發(fā)光，進而達到更高的分辨率和更好的成像效果是RENPs高分辨活體熒光成像的研究熱點［21］.2017年，戴宏杰課題組［22］發(fā)現(xiàn)Ce3+摻雜可以有效提高NaYbF4∶Er@NaYF4NPs的DC/UC發(fā)光強度比例［圖1（A）］.Ce3+與Er3+之間的交叉弛豫（CR）增大了Er3+的4I13/2能級布居數(shù)，削弱了與Yb3+發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移達到的4I11/2能級布居數(shù)，從而增強了4I13/2→4I15/2的1525 nm DC發(fā)射，抑制了4I11/2吸收Yb3+激發(fā)態(tài)能量而產(chǎn)生的UC發(fā)射.在NaYbF4∶2%Er中摻雜2%的Ce3+可使其1525 nm發(fā)射強度提高9倍.通過聚（馬來酸酐-alt-1-十八烯）（PMH）和氨基聚乙二醇（mPEG-NH2）修飾增強RENPs的親水性，使其在水溶液中的量子產(chǎn)率（QY）提高至2.73%.用改性后的RENPs進行活體小鼠腦血管成像，可對大腦下靜脈（ICV）和淺靜脈（SV）分別獲得5.3和3.1的信噪比，高于InAs半導體量子點［23］，分辨率可達0.3 mm左右.此研究首次實現(xiàn)了以RENPs為成像試劑進行活體高分辨熒光腦成像.在此基礎(chǔ)上，他們還報道了摻雜Zn2+的立方相（α相）NaYbF4∶Ce，Er@NaYF4NPs，與此前報道的相同組分的六方相（β相）RENPs相比，1525 nm處的熒光發(fā)射增強了11倍［24］.通常，α相NaREF4具有較高的聲子能，會通過多聲子弛豫造成激發(fā)態(tài)能量損失，因此α-NaREF4的UC發(fā)光強度遠不如β相［25］.然而在α-NaYbF4∶Ce，Er中，α相晶格的高聲子能和較強的Ln3+-F-相互作用使得4I11/2通過多聲子弛豫轉(zhuǎn)變?yōu)?I13/2的強度大大增強.此外，他們還通過Zn2+摻雜引入對稱性破缺，進一步增強了稀土離子4f-4f宇稱禁阻躍遷，使水溶液QY提高到約5%，并延長了熒光壽命.其高分辨活體腦成像信號可以實現(xiàn)對心跳和呼吸的檢測.

郝建華和曾松軍課題組［26］制備了聚丙烯酸（PAA）修飾的NaYF4∶Gd，Yb，Er納米棒.這種納米棒在水相中的1525 nm的QY為0.994%，高于單壁碳納米館（SWNTs），活體小鼠腦部血管成像分辨率可達44μm，該結(jié)果已經(jīng)接近該測試條件下的分辨率極限.此外，他們通過實時追蹤熒光信號在體內(nèi)的分布證實了腫瘤能夠通過高通透性和滯留（EPR）效應(yīng)對納米棒進行有效攝取，并實現(xiàn)了對直徑僅4 mm腫瘤的熒光探測.他們還通過Ce3+摻雜提高了NaLnF4∶Gd，Yb，Er（Ln=Y，Yb，Lu）納米棒的DC發(fā)射，并確定了NaLuF4為最優(yōu)的納米晶基質(zhì)，QY達到3.6%［27］，高于此前NaYbF4∶2%Ce，2%Er@NaYF4的2.73%［22］.這種熒光納米棒對腫瘤血管成像分辨率可達41μm，并利用EPR效應(yīng)實現(xiàn)了對直徑3 mm的轉(zhuǎn)移腫瘤的成像診斷［圖1（B）］.此外，還制備了NaLuF4∶Gd，Yb，Er，Ce@NaYF4@PAANPs并用于活體骨/骨髓成像和骨折的診斷［圖1（C）］，成像信噪比和分辨率明顯優(yōu)于NIR-Ⅱa發(fā)射的Nd3+摻雜RENPs［28］.高明遠課題組［29］使用了敏化劑-激活劑空間分離的策略，突破了傳統(tǒng)RENPs激活劑離子濃度＜20%的局限，制備了NaErF4@NaYbF4@NaYF4NPs，敏化劑殼層和惰性殼層大幅增強了NIR-Ⅱ發(fā)光，在1525 nm處獲得了18.7%的QY.經(jīng)聚乙二醇（PEG）改性并共價修飾葉酸（FA）后，這種RENPs可以對腫瘤進行選擇性成像.在活體腹膜腫瘤成像中，分辨率約0.5 mm.金大勇和袁小聰課題組［30］用CaF2惰性殼層保護NaYbF4∶Ce，Er核的猝滅位點，獲得了高達48.6%的固體QY，這是目前為止報道的Er3+發(fā)射的NIR-Ⅱb RENPs的最高值.

除了傳統(tǒng)的NaREF4，還有其它基質(zhì)顯示了不同尋常的發(fā)光特性和應(yīng)用潛力.劉紅榮課題組［31］利用KSc2F7∶Yb，Er NPs在活體小鼠上實現(xiàn)了分辨率達58μm的腦血管成像和50μm的腹部血管成像.與NaYF4基質(zhì)相比，KSc2F7中的Sc3+具有較小的半徑，縮小了晶格中離子間的距離，由于CR強度與離子間距離平方成反比［14］，縮小的離子間距增強了Er3+-Er3+間的4F7/2+4I11/2→4F9/2CR，從而使Yb3+-Er3+體系的主要發(fā)射波長由NaYF4基質(zhì)中的541 nm綠光變?yōu)?50 nm紅光.除UC發(fā)光外，PAA修飾的KSc2F7∶Yb，Er NPs在水中的1525 nm DC發(fā)光強度是NaYF4∶Yb，Er@PAA的1.7倍.此外，這種RENPs的尺寸和形貌可以容易地通過調(diào)節(jié)F-的加入量來調(diào)控，隨著F-用量的減少，RENPs的形貌由不均勻的長棒狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆虻亩贪魻?，也顯示了其作為一種新型成像和診療試劑的潛力.

Fig.1 High-resolution in vivo fluorescence imaging by using Yb3+-sensitized RENPs

1.2 Nd3+敏化的RENPs

Nd3+在808 nm處具有強吸收（4I9/2→4F5/2），Nd3+在4F5/2能級的能量可經(jīng)由Yb3+傳遞給Er3+，Tm3+，Ho3+等發(fā)光離子，并且Nd3+自身也具有1064 nm（4F3/2→4I11/2）和1345 nm（4F3/2→4I13/2）的NIR-Ⅱ發(fā)射.與980 nm相比，808 nm激發(fā)體系的核心優(yōu)勢在于生物組織在此波段的吸收小，因而可以提高成像穿透深度，減少光熱損傷［32］，這一點對于活體高分辨熒光成像十分關(guān)鍵.

Nd3+自身的1064和1345 nm發(fā)射可以用于NIR-Ⅱa活體成像.張凡課題組［33］采用DNA和靶向肽修飾的NaGdF4∶Nd@NaGdF4NPs對轉(zhuǎn)移性卵巢癌實施NIR-Ⅱ成像指導切除手術(shù)，成像質(zhì)量優(yōu)于臨床批準的吲哚菁綠（ICG），腫瘤本底比值可達10以上，能對小至1 mm的腫瘤進行精確切除［圖2（A）］.程震課題組［34］用聚乙二醇化脂質(zhì)體（DSPE-mPEG）修飾的NaYF4∶Nd@NaYF4NPs對活體小鼠骨骼和血管進行了高分辨熒光成像，其成像分辨率最高可達0.38 mm，并實現(xiàn)了NIR-Ⅱa成像指導的前哨淋巴結(jié)活檢和血栓診斷［圖2（B）］.研究發(fā)現(xiàn)，雖然1345 nm發(fā)射的QY僅為1064 nm發(fā)射的一半，但其成像效果優(yōu)于后者.受這一工作啟發(fā)，進一步采用二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、膽固醇（Chol）和DSPE-mPEG形成脂質(zhì)體，對RENPs進行表面修飾及包覆以加速其在體內(nèi)的排泄［35］.修飾后的RENPs在小鼠后肢血管成像中分辨率達0.40 mm，靜脈注射后72 h內(nèi)，大于90%修飾后的RENPs被排出，血液半衰期為17.96 min，適用于動脈栓塞、局部缺血及灌注、腫瘤血管等成像應(yīng)用，并能夠指導前哨淋巴結(jié)活檢及骨肉瘤栓塞手術(shù).田捷課題組［36］采用脂質(zhì)體（Lips）包覆NaYF4∶Yb，Er@NaYbF4@NaYF4∶Nd NPs用于對棕色脂肪組織和血管的成像，腸系膜和腸壁血管成像分辨率可達0.17 mm.研究發(fā)現(xiàn)，這種RENPs可以自發(fā)地在棕色脂肪組織積累，棕色脂肪組織能夠產(chǎn)熱，與人體能量代謝過程密切相關(guān)，這種熒光成像試劑為研究肥胖等能量代謝紊亂引起的疾病提供了一種安全有效的方法.

Fig.2 High-resolution in vivo fluorescence imaging by using Nd3+-sensitized RENPs

為了同時比較Nd3+敏化的Nd3+-Yb3+-Er3+體系中Yb3+的980 nm發(fā)射、Nd3+的1064 nm和1345 nm發(fā)射以及Er3+的1525 nm發(fā)射的成像效果，李富友課題組［37］制備了NaYbF4∶Ce，Er@NaYF4∶Yb@NaYF4∶Nd NPs，并通過PAA/PEG-NH2改性增強納米材料的生物相容性.成像結(jié)果顯示，1490～1580 nm區(qū)間的成像分辨率明顯優(yōu)于檢測波長大于930 nm范圍的成像分辨率，信噪比則約為后者的2倍.在注射RENPs 10 h后，通過1490～1580 nm區(qū)間仍可對血管清晰分辨，分辨率為0.25 mm.這一結(jié)果表明，Yb3+的980 nm發(fā)射、Nd3+的1064 nm和1345 nm發(fā)射成像效果不如Er3+的1525 nm發(fā)射，進一步證明了長發(fā)射波長的低散射對提高成像質(zhì)量至關(guān)重要.曾松軍課題組［38］制備了NaYF4∶Gd，Yb，Nd，Er，Ce@NaYF4∶Nd@PAA NPs，其腫瘤血管成像分辨率可達42μm，并可用于指導腫瘤切除手術(shù).

1.3 其它稀土離子敏化的RENPs

除了前文提到的Yb3+，Nd3+外，Er3+在650，808，980和1530 nm均有激發(fā)帶，可以用來激發(fā)其它離子［39～41］，也可以發(fā)生自敏化發(fā)光［42，43］.陳冠英和韓曉軍課題組［44］制備了808 nm激發(fā)的NaErF4∶Yb@NaLuF4@PAA自敏化NPs，研究了Yb3+摻雜量對不同波段發(fā)射強度的影響，并在活體小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了腦血管的熒光成像［圖3（A）］.劉曉敏課題組［43］制備了NaErF4∶Tm@NaLuF4并用于NIR-Ⅱ成像.0.5%摻雜的Tm3+在Er3+間充當能量傳遞的中介，增加了能級密度，有利于提高Er3+在4I13/2的布居數(shù)和1525 nm的發(fā)光.經(jīng)PEG改性后，這種RENPs可用于全身、腦血管以及多種臟器的成像，不開顱腦血管成像分辨率可達18.6μm.

Fig.3 High-resolution in vivo imaging applications of Er3+sensitized RENPs

張凡課題組［41］利用Er3+的1530 nm吸收敏化Ho3+以實現(xiàn)1180 nm的NIR-ⅡUC發(fā)光，這種NaErF4∶Ho@NaYF4NPs同時還能具有980和650 nm的Er3+自敏化發(fā)光.其中，980和1180 nm的發(fā)射均可在活體中獲得較高的分辨率.在另一項研究中，他們利用Tm3+在808和1208 nm吸收分別敏化Er3+，Yb3+及Ho3+，制備了NaYF4∶Tm，Yb@NaYF4，NaYF4∶Tm，Ho@NaYF4和NaErF4@NaYF4∶Tm@NaYF43種RENPs，并用它們作為熒光墨水制備了可植入二維碼［45］.通過NIR-Ⅱ成像，聚二甲基硅氧烷（PDMS）為基底的二維碼在活體小鼠體內(nèi)清晰可見，在利用時間門控熒光成像技術(shù)消除背景后，成像質(zhì)量進一步提高，從而實現(xiàn)了活體信息存儲［圖3（B）］.

1.4 非稀土敏化劑敏化的RENPs

稀土發(fā)光材料的主要缺點之一是4f-4f宇稱禁阻躍遷導致的吸收弱［46］，且大多數(shù)局限于980或808 nm激發(fā)，限制了其應(yīng)用的靈活性.為了增大熒光探針的吸收、提高發(fā)光強度，并將激發(fā)波長擴展至980和808 nm之外，研究者采用許多外源敏化劑來敏化RENPs.

在有機染料敏化方面，Prasad課題組［47］率先開發(fā)了ICG敏化的NaYF4∶Yb，Er@NaYbF4@NaYF4∶Nd NPs，能在3 mm組織深度下實現(xiàn)3～4 mm分辨率的活體NIR-Ⅱ成像.李貞課題組開發(fā)了一系列有機染料/無機量子點-稀土復合成像試劑，有效提高了RENPs的發(fā)光強度.通過近紅外吸收的有機染料IR-808敏化NaNdF4@NaLuF4后，其在1360 nm的NIR-Ⅱ發(fā)光增強了10倍以上，在利用聚焦超聲技術(shù)使其穿過血腦屏障（BBB）后，可在原位成膠質(zhì)細胞瘤中聚集，從而實現(xiàn)成像診斷［48］.此外，還開發(fā)了近紅外有機染料敏化的NaYF4∶Yb，Er@NaYF4∶Nd NPs熒光成像試劑［49］，有機染料Alk-pi可以大大提高RENPs在808 nm的吸收，并將Er3+的1525 nm發(fā)射提高40倍.這種熒光探針在腦血管成像中的分辨率可達48μm，并可用于腫瘤血管成像以及動脈缺血、動脈粥樣硬化等血液循環(huán)系統(tǒng)疾病的成像診斷［圖4（A）］.在無機敏化方面，通過使用980 nm吸收遠超Yb3+的Ag2Se QDs敏化NaYbF4∶Gd，Ce，Er@NaYF4∶Yb NPs，將其在1525 nm的發(fā)射提高了超過100倍［50］.這種熒光試劑可用于腦血管成像，其成像分辨率可達52μm，并且能在大腦中動脈栓塞（MCAO）等模型中進行動態(tài)成像以及血液灌注和流動速率的定量監(jiān)測［圖4（B）］.

Fig.4 High-resolution in vivo imaging by using organic dyes and QDs sensitized RENPs

1.5 X射線激發(fā)的長余輝RENPs

X射線激發(fā)的稀土長余輝（PL）發(fā)光材料因為無需原位激發(fā)，可以有效避免生物體自發(fā)熒光干擾，提高成像信噪比［51］，X射線的超強穿透能力則使得其在深層活體成像領(lǐng)域潛力巨大［52］.劉小鋼課題組［53］利用NaLuF4作為基底實現(xiàn)了X射線激發(fā)的超過30 d的PL發(fā)光.張凡課題組［54］以NaYF4為基底，制備了NaYF4∶Gd，Ln（Ln=Er，Tm，Ho，Nd）@NaYF4長余輝納米顆粒（PLNPs），在X射線輻照后均可發(fā)出NIR-Ⅱ熒光.PLNPs在X射線輻照后將能量存儲于缺陷之中，在-20℃下發(fā)光較弱，可以長期保存，而在室溫下發(fā)光較強，可以用于活體成像.他們用低溫保存的NaYF4∶Er@NaYF4PLNPs注入活體小鼠，實現(xiàn)了對血管、腫瘤、輸尿管的高對比度、高分辨率的PL成像，在腫瘤成像中，PLNPs的PL在經(jīng)過5 min衰減后組織/背景信號強度比仍為41，而808 nm激發(fā)的熒光（FL）僅為11.在輸尿管成像中，10 s后PL的分辨率為181μm，808 nm激發(fā)的FL則為267μm.

2 RENPs在活體多功能高分辨成像中的應(yīng)用

2.1 多路成像

多路成像是指在同一樣本中采用不同光譜特性的熒光試劑同時分別成像的技術(shù)，有助于對復雜生命體系和生命活動的觀測.然而由于熒光染料和熒光蛋白等常用熒光試劑的發(fā)射波長穿透力有限、生物自發(fā)熒光及組織散射對信號的干擾較強，高分辨率的哺乳動物活體多路成像仍然是一個挑戰(zhàn)［55］.而RENPs的熒光激發(fā)和發(fā)射波長多樣、熒光壽命較長且可調(diào)，為這一問題提供了解決方案.

2.1.1 基于熒光激發(fā)/發(fā)射的多路成像 傳統(tǒng)的多路成像一般采用兩種不同發(fā)射波長的探針進行成像.對于RENPs，多路成像可以通過不同激發(fā)波長、不同發(fā)射波長以及激發(fā)和發(fā)射波長均不同的RENPs實現(xiàn).為了比較多種808 nm激發(fā)熒光體系并開發(fā)單一激發(fā)的多路成像系統(tǒng)，金大勇課題組［56］制備了一系列核殼結(jié)構(gòu)RENPs，包括NaYF4∶Nd@NaYF4（1064，1342 nm發(fā)射），NaErF4@NaYF4（1525 nm發(fā)射）和NaYbF4∶Er，Ce@NaYbF4@NaYF4∶Yb，Nd（1525 nm發(fā)射），并用PMH和mPEG-NH2修飾以增強水溶性和生物相容性.在808 nm激發(fā)下，通過濾光片分別收集小于1400 nm和大于1000 nm的信號，從而實現(xiàn)了多路成像，成像分辨率分別為0.48和0.42 mm.其中小于1400 nm的信號主要集中在肝和腹腔中的血管，大于1400 nm的信號則遍及全身的多級血管.程震課題組［57］驗證了PEG修飾的NaYF4∶Nd@NaYF4和NaYF4∶Yb，Er@NaYF4分別在808和980 nm下激發(fā)的雙色活體高分辨熒光成像能力，并發(fā)現(xiàn)NaYF4∶Nd@NaYF4的時間分辨率較高，NaYF4∶Yb，Er@NaYF4空間分辨率較高（156μm/358μm），二者在成像中有很好的互補性.

張凡課題組［54］利用Nd3+和Er3+摻雜的兩種PLNPs實現(xiàn)了長余輝雙色成像.在X射線激發(fā)下，兩種PLNPs分別通過口服和尾靜脈注射給藥，分別發(fā)射1064和1525 nm的長余輝熒光，分別對消化道和肝脾等臟器進行成像.他們還利用NaYF4∶Yb，Er@NaYF4NPs與Er3+-細菌葉綠素配合物EB766組成了激發(fā)正交的雙路成像系統(tǒng)［58］.這兩種熒光探針能分別在980和760 nm激發(fā)下發(fā)出1525 nm熒光.通過不同給藥方式，他們用這種系統(tǒng)對小鼠后肢淋巴/血管進行了雙路成像.在另一項工作中，利用3種不同激發(fā)、不同發(fā)射的RENPs：α-NaErF4@NaYF4（655 nm激發(fā)、1525 nm發(fā)射）、α-NaYF4∶Nd@NaYF4（730 nm激發(fā)、1060 nm發(fā)射）、α-NaYbF4∶Ho@NaYF4（915 nm激發(fā)、1180 nm發(fā)射）構(gòu)建了正交三色發(fā)光體系［55］，通過表面修飾不同基團、不同給藥時間和方式，實現(xiàn)了3種激發(fā)下對內(nèi)臟、胃和血管3種組織的多路成像［圖5（A）］.此外，分別制備了在980 nm激發(fā)下具有1525 nm熒光發(fā)射的α-NaYF4@NaYbF4∶Er，Ce@NaYF4和具有1155 nm熒光發(fā)射的β-NaYF4@NaYbF4∶Ho@NaYF4［59］，分別用不含F(xiàn)A和含F(xiàn)A（用于對腫瘤靶向）的DSPE-PEG修飾，實現(xiàn)了對全身血管和腫瘤的雙色動態(tài)成像.

2.1.2 基于熒光壽命的多路成像 通過時分復用技術(shù)，利用不同熒光壽命的探針進行多路成像可以有效避免生物組織對不同波長光的不同吸收和散射系數(shù)帶來的信號誤差，實現(xiàn)高保真多路成像.而RENPs的熒光壽命可以通過稀土離子摻雜量進行有效調(diào)控，在同一發(fā)射波長內(nèi)可實現(xiàn)3個數(shù)量級的壽命調(diào)控［60］.戴宏杰課題組［22］借助RENPs的長熒光壽命，通過在表面修飾程序性細胞死亡配體-1（PD-L1）抗體，在活體小鼠中與NIR-Ⅱ發(fā)射的PbS QDs共同實現(xiàn)了對腫瘤免疫治療的雙路成像.PbS QDs的熒光壽命僅為數(shù)十微秒，而這種RENPs則有數(shù)毫秒，因此，他們在一個通道中用808 nm單獨激發(fā)QDs獲得其熒光信號，在另一通道中用980 nm同時激發(fā)QDs和RENPs，但在檢測器設(shè)置1 ms的延遲以完全消除QDs的熒光信號，僅保留RENPs的信號，解決了兩種同波段熒光試劑進行雙路熒光成像這一挑戰(zhàn).張凡課題組［45］通過調(diào)節(jié)Tm3+摻雜量調(diào)控RENPs的發(fā)光強度和熒光壽命，形成了多色、多種熒光壽命的NIR-Ⅱ發(fā)射體系.他們將不同熒光壽命的NaErF4@NaYF4∶Tm@NaYF4NPs制成的二維碼重疊植入小鼠體內(nèi)，若不設(shè)置延遲時間，只能得到重疊失真的圖像.而通過算法分析不同時間門控下的圖像可以獲得兩種RENPs存儲的信息，從而實現(xiàn)了活體信息解碼［圖5（B）］.

Fig.5 High-resolution in vivo multiplexed imaging with RENPs

2.2 多模態(tài)成像

由于單個成像方法各有優(yōu)點和局限性，且提供的生理信息不同，因此在活體成像領(lǐng)域，多模態(tài)成像是獲得全面、準確信息的重要手段［61］.稀土離子除發(fā)光之外，也具有順磁性和X射線吸收等特性［62，63］，經(jīng)常被用作多模態(tài)成像納米平臺［64，65］.在高分辨活體成像中，也有一些以RENPs為基礎(chǔ)的多模態(tài)成像應(yīng)用.程震和屈軍樂課題組［66］制備了NaYF4∶Yb，Nd，Tm@NaYF4@NaYF4∶Nd NPs與偶氮苯修飾的聚丙烯酸（PAA-Azo）復合形成的NIR-Ⅱ/光聲（PA）雙模高分辨成像試劑.808 nm激發(fā)下，Tm3+的365 nm紫外發(fā)射和475 nm藍光發(fā)射可使偶氮苯發(fā)生可逆的光異構(gòu)化，從而產(chǎn)生光聲效應(yīng).而Nd3+的1345 nm發(fā)射則用于NIR-Ⅱ成像［圖6（A）］.對小鼠后肢的PA和NIR-Ⅱ成像分辨率分別為558和497μm.張凡課題組［54］利用Gd3+的順磁性并采用18F標記NaYF4∶Er@NaGdF4PL NPs，首次實現(xiàn)了PL/MR/PET三模態(tài)成像，除高分辨PL成像外，其PET成像質(zhì)量與已有報道相近，MR成像則優(yōu)于臨床使用的釓噴替酸葡甲胺（Gd-DTPA）造影劑.劉小鋼和盛宗海課題組［67］開發(fā)了生物正交基團氮雜環(huán)辛炔（DBCO）修飾的NaYF4∶Yb，Er，Ce@NaYF4∶Nd@NaGdF4NPs，用于對腫瘤靶向的NIR-Ⅱ/MR雙模成像.他們用疊氮基標記的非天然糖與膠質(zhì)瘤細胞共孵育使其在膜表面表達含疊氮基的唾液酸，DBCO會與疊氮基特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)對腫瘤的精準靶向.這種RENPs對小鼠后肢的NIR-Ⅱ成像分辨率可達512 μm，生物正交標記后，RENPs的NIR-Ⅱ信號在小鼠皮下腫瘤中增強了20倍，MR信號增強了2倍，并且可以持續(xù)存在48 h以上，適用于對腫瘤的實時活體成像監(jiān)測［圖6（B）］.

Fig.6 High-resolution in vivo multimodal imaging with RENPs

3 RENPs在疾病診斷、生物傳感與診療一體化中的應(yīng)用

過去20年，RENPs的表面修飾策略得到了廣泛而深入的研究［68，69］，各種表面功能化的RENPs可以針對性地對某些疾病部位成像、對生物信號分子進行傳感或在成像的同時發(fā)揮治療作用.

3.1 功能化RENPs在疾病診斷中的應(yīng)用

利用表面功能分子與生物信號分子或生物器官的相互作用，RENPs可以在特定部位靶向聚集成像，通過代謝速度、熒光強度等差異實現(xiàn)對疾病的診斷.張凡課題組［70］制備了谷胱甘肽（GSH）修飾的NaGdF4∶Nd@NaGdF4NPs并用于炎癥部位的特異性成像.炎癥部位會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）［71］，而GSH分子間在ROS存在時會形成二硫鍵而發(fā)生交聯(lián)，因此，RENPs會在炎癥處會發(fā)生特異性聚集，從而實現(xiàn)診斷和增強成像，其信噪比是無交聯(lián)RENPs的近3倍［圖7（A）］.此外，由于NaGdF4基質(zhì)較小的尺寸（電子顯微鏡下4.38 nm，水合粒徑5.3 nm），這類RENPs可以容易地被排出，14 d后體內(nèi)殘留不足15%.金大勇和袁小聰課題組［30］通過在RENPs表面修飾與腸粘膜具有良好黏附性的阿拉伯膠（GA），實現(xiàn)了胃腸道（GI tract）的高分辨成像，分辨率約1～2 mm，明顯優(yōu)于NIR-Ⅱa發(fā)射的Nd3+摻雜RENPs（2～4 mm）和NIR-I發(fā)射的ICG（3～6 mm），并用光片照明技術(shù)重構(gòu)了胃腸道的三維（3D）影像.他們進一步利用潰瘍性腸炎的腸粘膜滲透性增加使RENPs滯留時間增長的特點，通過羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）修飾RENPs實現(xiàn)了對潰瘍性腸炎（IBD）的有效診斷和治療過程的實時監(jiān)測［圖7（B）］.

Fig.7 High-resolution in vivo fluorescence image-guided diagnosis by using RENPs

3.2 功能化RENPs在高分辨生物傳感中的應(yīng)用

功能化RENPs表面修飾分子與生物體內(nèi)特定物質(zhì)的相互作用可影響其熒光，從而實現(xiàn)高分辨生物傳感.張凡課題組［41］將NaErF4∶Ho@NaYF4NPs、Fe2+和一種對芬頓反應(yīng)十分敏感、在800～1100 nm有強吸收的有機染料IR1061一同封裝，制備了H2O2傳感探針.H2O2是一種炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的ROS，其與Fe2+同時存在時會發(fā)生芬頓反應(yīng)，使IR1061被破壞，從而無法吸收RENPs發(fā)射的980 nm光，使得整個體系的980 nm熒光增強.因此在1530 nm激發(fā)下，通過980和1180 nm兩個通道的發(fā)射強度比值即可實現(xiàn)H2O2濃度的傳感.他們利用這種探針制成的微針陣列補片在小鼠皮下炎癥模型中驗證了其活體生物傳感性能［圖8（A）］.在另一項工作中，在NaY0.5Er0.5F4@NaYF4NPs表面修飾了商用花菁染料Cy7.5，制備了次氯酸比例響應(yīng)熒光探針［72］.次氯酸也是一種炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生的ROS，當次氯酸存在時，Cy7.5在800 nm左右的吸收急劇增加，從而抑制了808 nm激發(fā)下RENPs的熒光，而980 nm激發(fā)則不受影響.因此，在980和808 nm同時激發(fā)下，通過兩種波長激發(fā)下的NIR-Ⅱ信號強度比值的變化即可實現(xiàn)對炎癥的成像診斷.以淋巴炎為模型，這種探針在活體小鼠后肢中進行的炎癥熒光成像分辨率可達273μm，可以有效診斷炎癥［圖8（B）］.利用類似的原理，他們使用對ClO-有特異性響應(yīng)的有機染料聚集體FD-J猝滅NaYF4∶Er@NaGdF4@NaYF4∶5%Nd@NaGdF4NPs的1330 nm發(fā)光，而不影響1550 nm發(fā)光，同樣實現(xiàn)了對ClO-的比率熒光傳感，分辨率可達249μm［73］.GSH是癌癥的重要信號分子，在腫瘤中濃度顯著高于正常細胞［74］.宋繼彬課題組［75］采用具有GSH響應(yīng)的有機染料NPh（4-硝基酚-Cy7）修飾NaYF4∶Yb，Er@NaYF4∶Nd NPs，用于對GSH的比率傳感.NPh本身不發(fā)射熒光，但在GSH存在下能發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變生成Cy7-SG，在808 nm激發(fā)下與RENPs發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移（NRET），從而增強其發(fā)光.與此同時，980 nm激發(fā)下的熒光強度則不隨GSH濃度而發(fā)生改變.因此，利用兩種波長激發(fā)下1525 nm發(fā)射強度的比值對GSH濃度進行高精確度、高分辨率的傳感［圖8（C）］.

Fig.8 High-resolution biosensing applications of RENPs

3.3 功能化RENPs在診療一體化中的應(yīng)用

診療一體化是指將診斷與治療功能集成于同一平臺上，對癌癥或其它疾病進行同時診斷和治療，從而達到精確、有效的治療效果［76］.RENPs的光激發(fā)本性以及多種表面修飾和復合策略賦予了其在診療一體化領(lǐng)域巨大的應(yīng)用潛力.

光熱治療（PTT）因其光引發(fā)特性被廣泛用于與RENPs協(xié)同診療［77～79］.郝建華、曾松軍和劉紅榮團隊［80］在PAA-NaYF4∶Gd，Yb，Er納米棒表面修飾了Cu2-xS QDs，并用于NIR-Ⅱ高分辨熒光成像指導的PTT.在980 nm激發(fā)下，這種納米棒基本保留了原有的高分辨熒光成像性能，腦血管成像分辨率可達44.2μm；同時，在808 nm激發(fā)下納米復合物具有超過30%的光熱效率，優(yōu)于傳統(tǒng)光熱劑金納米棒的21%，能有效減小腫瘤體積（圖9）.在另一項工作中，利用聚多巴胺（PDA）為光熱劑修飾NaLuF4∶Gd，Yb，Er納米棒，光熱效率超過40%，成像分辨率可達45.2μm，同樣達到了良好的成像和治療效果［81］.

Fig.9 Theranostics applications of RENPs[80]

除了外加光熱試劑，高比例摻雜Nd3+的RENPs自身也具有一定的光熱性能，且不同發(fā)射波長強度比值對溫度具有響應(yīng)性［82，83］，為診療一體化提供了基礎(chǔ).然而，Nd3+自身在808 nm激發(fā)下的光熱性能并不理想，NaNdF4NPs的光熱效率僅為8.7%，但在與普魯士藍（PB）復合后，兩者之間的CR可大大提高復合物的光熱效率，光熱效率高達60.8%［84］，是一種良好的PTT試劑.為了將這一治療功能與RENPs的成像功能相結(jié)合，陳冠英課題組［85］利用PB的光譜特性開發(fā)了NaErF4@NaYF4@NaNdF4@PB@PEG NPs.980 nm激發(fā)下，PB吸收較低，RENPs能發(fā)射Er3+自敏化的1525 nm熒光，實現(xiàn)活體高分辨成像；而808 nm激發(fā)下PB吸收較高，以產(chǎn)熱為主，光熱效率超過50%，能夠?qū)δ[瘤進行有效治療.

呂銳嬋課題組［86］用單甲氧基聚乙二醇-乳酸-羥基乙酸共聚物（mPEG-PLGA）對NaGdF4∶Nd@NaLuF4NPs和阿霉素（DOX）進行封裝，制備了具有NIR-Ⅱ高分辨成像和pH響應(yīng)化療功能的納米診療試劑.這種直徑300 nm的納米試劑可以通過EPR效應(yīng)在腫瘤中富集，且降解后釋放的RENPs直徑僅6 nm，易于排泄，增加了其安全性.

4 總結(jié)與展望

近年來，在組織中低散射的NIR-Ⅱ區(qū)發(fā)射RENPs在高分辨活體成像中得到了廣泛應(yīng)用并取得了快速發(fā)展.通過對RENPs的晶相、摻雜比例和核殼結(jié)構(gòu)的設(shè)計來調(diào)控稀土離子間的能量傳遞過程，選擇性地增強NIR-Ⅱ發(fā)光，從而提高成像質(zhì)量.在傳統(tǒng)的Yb3+，Nd3+敏化之外，對Er3+，Tm3+以及各類有機、無機的敏化劑進行了探索、擴展了激發(fā)范圍，提高了發(fā)光強度，有效增強了成像效果，提高了應(yīng)用靈活性.借助稀土離子多樣的發(fā)光和其它特性，一系列多路成像和多模態(tài)成像試劑被開發(fā).此外，通過豐富的表面修飾策略，高分辨活體成像試劑被賦予各類靶向、傳感、診斷和治療功能，表現(xiàn)出生物醫(yī)學應(yīng)用的巨大潛力.雖然RENPs在高分辨活體熒光成像領(lǐng)域已經(jīng)取得了許多進展，但受限于較低的吸收強度、較差的生物相容性，還有很大的發(fā)展空間，其未來發(fā)展方向主要包括以下幾點：

（1）進一步豐富激發(fā)波長.與發(fā)射光相同，激發(fā)光波長的紅移同樣能增加穿透深度、提高亮度、增強信噪比和分辨率.然而，目前絕大多數(shù)的研究工作仍然以傳統(tǒng)的980或808 nm進行激發(fā)，僅有一個Tm3+敏化的體系能夠在NIR-Ⅱ區(qū)段被激發(fā)［45］.對Tm3+，Er3+，Dy3+，Sm3+等在NIR-Ⅱ有較強吸收的稀土離子摻雜的發(fā)光體系進一步探索，將為未來這一方面的研究突破提供可能性［46］.

（2）提高發(fā)光強度.這一問題的解決需要多方面的努力，包括吸收強度的提高和能量傳遞過程的調(diào)控.RENPs較低的吸收強度使得活體應(yīng)用時需要采用較高的能量密度來激發(fā)，帶來對生物體造成光熱損傷的風險.在稀土離子固有吸收較低的背景下，有機/無機雜合敏化體系的研究將對提高RENPs的吸收強度至關(guān)重要.目前已經(jīng)有許多研究聚焦于通過調(diào)控RENPs內(nèi)部的能量傳遞過程來調(diào)整其發(fā)射比例，以增強NIR-Ⅱ的發(fā)光強度，采用的策略包括離子摻雜（如Ce3+［22］）和基質(zhì)晶格的重新選擇（如α-NaREF4［24］和KSc2F7［31］）.Ce3+的摻雜建立了一條新的CR路徑，從而大大增強了NIR-Ⅱ發(fā)射.通過引入其它稀土離子或過渡金屬離子建立新的CR通路可能為這一領(lǐng)域再次帶來變革.另一方面，當前研究中廣泛采用的用于UC發(fā)射的β-NaYF4基質(zhì)對于主要強調(diào)DC發(fā)射的RENPs來說并不是最合適的，晶格的改變可以帶來離子間距的改變，調(diào)控CR的強度.探索更適合高分辨成像的納米晶基質(zhì)將成為該領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn).

（3）提高成像試劑的生物相容性和生物穩(wěn)定性.目前的研究主要集中于小鼠模型中，實現(xiàn)其在人體內(nèi)的安全應(yīng)用仍然任重道遠：一方面，為了提高生物相容性，親水化修飾將繼續(xù)成為研究的焦點；另一方面，為了提高在體內(nèi)的循環(huán)和代謝速率，需要盡量縮小RENPs的尺寸.但由于表面猝滅作用，RENPs的發(fā)光強度隨尺寸的減小而急劇下降.因此，亟需發(fā)展水溶性、可降解、可排泄、高分辨的新型成像試劑，用于克服現(xiàn)有RENPs的這種固有缺點.目前，也有一些具有良好生物相容性或能夠在生物體內(nèi)降解的新型RENPs被報道［87～89］，為未來高分辨熒光成像試劑的發(fā)展提供了新方向.

（4）集成更多診斷與治療功能.UCNPs已經(jīng)被廣泛用于診療一體化方面的研究.而NIR-Ⅱ發(fā)射的高分辨RENPs探針的診療應(yīng)用研究數(shù)量仍然有限：一方面，附加光激發(fā)的治療功能會降低診療試劑的熒光強度，不利于高分辨成像；另一方面，當前的診療一體化主要集中在癌癥診療［90］，而實體瘤并不需要很高的分辨率即可成像和診斷.未來高分辨活體熒光試劑的診療一體化應(yīng)用方向可能集中于癌癥的早期診斷以及更精細的生命結(jié)構(gòu)（如血管、神經(jīng)、泌尿系統(tǒng)以及腦部疾?。┑臋z測和治療中［91～93］.

綜上所述，雖然稀土發(fā)光材料已經(jīng)被大量研究，但在高分辨活體熒光成像領(lǐng)域尚處于起步和探索階段.相信隨著研究的進一步深入，稀土熒光成像試劑在生物相容性、成像分辨率和診療功能化等方面會得到更大的發(fā)展，并在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用.