牟倡駿，許 潔，張潔敏，王 磊，王禹峰，江君杰

（山東威高血液凈化制品股份有限公司，山東 威海 264200）

2020年國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)和國(guó)際腎臟基金聯(lián)合會(huì)公布的一項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示，全球約有十分之一的成年人患有慢性腎臟病，預(yù)計(jì)到2040年該病將成為全世界第五大死亡原因［1］。慢性腎衰竭是其發(fā)展到后期的一種臨床綜合征，主要有腎小球?yàn)V過率下降、水電解質(zhì)和酸堿平衡失調(diào)以及代謝產(chǎn)物潴留等臨床表現(xiàn)［2］。這些代謝產(chǎn)物通常稱為尿毒癥毒素，根據(jù)生化特征及清除方式，可分為三大類：小分子物質(zhì)（＜ 500 Da）、中分子物質(zhì)（＞ 500 Da）和蛋白結(jié)合類毒素（PBUTs）［3］。硫酸吲哚酚（IS）、硫酸對(duì)甲酚（PCS）和馬尿酸（HA）是PBUTs的主要代表物質(zhì)，它們與心血管疾病和腎功能損傷具有高度相關(guān)性，容易誘發(fā)多種并發(fā)癥［4-7］。提高透析器對(duì)PBUTs的清除效果，已成為血液凈化領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)［4］。目前因缺乏簡(jiǎn)單有效的PBUTs檢測(cè)方法，透析器的清除性能僅通過部分中小分子毒素進(jìn)行評(píng)價(jià)，并未將PBUTs作為指標(biāo)性物質(zhì)［8-9］。因此，建立一種評(píng)價(jià)透析器對(duì)PBUTs清除效果的方法，對(duì)于開發(fā)具有高效清除性能的產(chǎn)品，提高透析患者的生存質(zhì)量具有重要意義。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜具有樣品用量少、檢測(cè)靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)［10-11］，已逐漸成為生物樣品分析的主要技術(shù)手段［12-13］，被廣泛應(yīng)用于透析患者血液中PBUTs的定量檢測(cè)［14-20］。Prokopienko等［18］建立了一種同時(shí)測(cè)定患者血清中4種腸源性尿毒癥毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。Wang等［20］建立了一種同時(shí)測(cè)定腹膜透析患者血清中8種PBUTs的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜方法，醫(yī)生通過患者體內(nèi)PBUTs的濃度評(píng)估其發(fā)生并發(fā)癥的可能性，但該方法準(zhǔn)確度均較低，HA的準(zhǔn)確度只有60%左右。上述文獻(xiàn)報(bào)道只是將高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于患者體內(nèi)PBUTs的濃度檢測(cè)，在體外評(píng)價(jià)透析器對(duì)PBUTs清除效果方面的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

本研究以與透析患者體內(nèi)PBUTs濃度相當(dāng)?shù)呐Ｑ灏椎鞍姿芤鹤鳛槟M液代替血液，不僅降低了實(shí)驗(yàn)成本，而且有效解決了臨床血液樣品來(lái)源困難以及因患者個(gè)體差異導(dǎo)致樣品不平行的問題，采用一步沉淀蛋白的前處理方法和高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)，建立了一種同時(shí)評(píng)價(jià)透析器對(duì)IS、P-CS和HA 3種PBUTs清除效果的分析方法。該方法應(yīng)用于透析前后模擬液中PBUTs濃度的檢測(cè)，3種待測(cè)物質(zhì)均可在10 min內(nèi)出峰，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢(shì)，為透析器研發(fā)階段的測(cè)試以及臨床處方的選擇提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Vanquish色譜儀、Thermo TSQ Quantis三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；DV215CD電子分析天平（美國(guó)OHAUS公司）；Centrisart G-16C冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q10純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；KQ-500DB超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；VORTEX1渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；超濾離心管（10 kDa，德國(guó)Sartorius公司）。

硫酸吲哚酚鹽（97%，美國(guó)Sigma公司）；馬尿酸（98%，美國(guó)Sigma公司）；硫酸對(duì)甲酚鹽（≥ 98%，日本TCI公司）；3-吲哚基硫酸鹽-D4鉀鹽（IS-D4，＞ 95%，百靈威科技有限公司）；乙酸銨、甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；牛血清白蛋白（廣州蕊特生物科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q10超純水機(jī)制備的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密稱取IS、P-CS、HA標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1 mg∕mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用水配制成2．5、5．0、10、25、50、75、100 μg∕mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取IS-D4標(biāo)準(zhǔn)品2．5 mg，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg∕mL的儲(chǔ)備液。取上述儲(chǔ)備液適量，用水配制成10 μg∕mL的內(nèi)標(biāo)工作液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模擬液的制備

稱取適量的牛血清白蛋白，用水配制成質(zhì)量濃度為50 g∕L的蛋白水溶液；稱取適量的IS、P-CS、HA標(biāo)準(zhǔn)品加入上述溶液，使其質(zhì)量濃度分別為30、40、50 μg∕mL，37 ℃水浴，磁力攪拌4 h，即得模擬液。同法平行制備12份。

1.4 樣品前處理

參照透析器的臨床使用說明，按照?qǐng)D1連接透析器、體外循環(huán)血路和透析設(shè)備。通過滾壓泵將模擬液引入整個(gè)系統(tǒng)，設(shè)定模擬液流量（QB）為200 mL∕min，透析液流量（QD）為500 mL∕min，脫水量（QF）為10 mL∕min，循環(huán)10 min后，分別在透析器血液入口和出口處取樣作為待測(cè)樣品。

圖1 模擬血液透析示意圖Fig．1 Schematic diagram of simulated hemodialysis

游離蛋白結(jié)合類毒素樣品配制：取200 μL樣品置于超濾離心管（2 mL，10 kDa）中，4 ℃下14 000 r∕min離心10 min；棄去套管，取濾液10 μL，置于2 mL EP管中，加10 μL內(nèi)標(biāo)工作液和980 μL超純水，渦旋1 min，取10 μL混合溶液上機(jī)。

總蛋白結(jié)合類毒素樣品配制：取50 μL樣品加入50 μL水和50 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋1 min，加入350 μL乙腈，渦旋2 min，4 ℃下14 000 r∕min離心10 min；取100 μL上清液，置于2 mL EP管中，加入900 μL水，渦旋1 min，取10 μL混合溶液上機(jī)。

1.5 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD VANQUISH C18（100 mm × 2．1 mm，1．9 μm）；流動(dòng)相：A為5 mmol∕L乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫：0 ～ 2 min，20% B；2 ～ 8 min，20% ～ 80% B；8 ～ 10 min，80% B；10 ～10．1 min，80% ～ 20% B；10．1 ～ 15 min，20% B。柱溫：30 ℃；流速：0．2 mL∕min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.6 質(zhì)譜條件

Thermo TSQ Quantis三重四極桿質(zhì)譜儀；電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓：3 000 V，鞘氣流速：4．58 L∕min，輔氣流速：10．08 L∕min，毛細(xì)管溫度：325 ℃，負(fù)離子掃描模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；各物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 3種PBUTs的保留時(shí)間（RT）與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times（RT） and mass spectrometric parameters of 3 PBUTs

2 結(jié)果與討論

2.1 模擬液制備條件的優(yōu)化

本研究選擇含有適量PBUTs的牛血清白蛋白溶液模擬患者血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參照文獻(xiàn)［15］，透析患者體內(nèi)HA的含量最高，其次是P-CS和IS，且質(zhì)量濃度均在30 ～ 50 μg∕mL范圍內(nèi)，因此本實(shí)驗(yàn)配制的模擬液中IS、P-CS和HA的質(zhì)量濃度分別設(shè)定為30、40、50 μg∕mL。文獻(xiàn)報(bào)道成人血液中白蛋白的質(zhì)量濃度在35 ～ 50 g∕L范圍內(nèi)［21］，為最大程度接近人體血液中PBUTs的蛋白結(jié)合率水平，因此考察了牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（40、50 g∕L）和反應(yīng)時(shí)間（2、4、8 h）對(duì)IS、P-CS、HA蛋白結(jié)合率的影響。由圖2可知，當(dāng)牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為50 g∕L時(shí)，加入IS、P-CS、HA，37 ℃下反應(yīng)4 h，其蛋白結(jié)合率最接近透析患者血液中的水平（IS、P-CS、HA的蛋白結(jié)合率分別為90%、95%、45%）［15，22］?；谏鲜隹疾欤瑢?shí)驗(yàn)最終選擇此條件制備模擬液。

圖2 牛血清白蛋白質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)IS、P-CS、HA蛋白結(jié)合率的影響Fig．2 Effects of concentrations of bovine serum albumin and reaction times on the protein binding rate of IS，P-CS and HA

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

沉淀蛋白最常用的方法是鹽析法和有機(jī)試劑沉淀法［23］。鹽析法會(huì)將高濃度不揮發(fā)性的鹽引入樣品中，干擾質(zhì)譜檢測(cè)，因此選擇乙腈進(jìn)行蛋白沉淀處理。本研究進(jìn)一步比較了樣品稀釋和沉淀的先后順序?qū)z測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，先稀釋樣品再經(jīng)乙腈沉淀蛋白后直接上機(jī)檢測(cè)，干擾峰較多、峰形分叉；而先經(jīng)乙腈沉淀蛋白再用水稀釋后上機(jī)檢測(cè)，峰形尖銳、干擾少，且IS、P-CS、HA的回收率為97．1% ～ 112%，故選擇后者作為最終的樣品前處理方法。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了水-甲醇、水-乙腈、5 mmol∕L乙酸銨-甲醇和5 mmol∕L乙酸銨-乙腈4種流動(dòng)相體系的分離效果。結(jié)果表明，有機(jī)相為乙腈時(shí)，其洗脫能力過強(qiáng)，導(dǎo)致待測(cè)物的保留時(shí)間過于集中，色譜峰不能完全分離。由于3種待測(cè)PBUTs是帶有磺酸或羧酸官能團(tuán)的化合物，在流動(dòng)相中加入一定量的乙酸銨，可提高待測(cè)物的離子化效率，有利于峰形的改善。經(jīng)綜合比較，確定流動(dòng)相為5 mmol∕L乙酸銨溶液-甲醇，通過優(yōu)化梯度洗脫程序，減少了色譜峰拖尾現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了待測(cè)物的快速分離和高信號(hào)響應(yīng)。3種PBUTs和IS-D4的提取離子流色譜圖如圖3所示。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵方式以5 μL∕min流速將1 μg∕mL的IS、P-CS、HA和IS-D4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀。由于待測(cè)化合物含有磺酸基或羧基，因此選擇負(fù)離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜Q1全掃描，以確定其母離子；然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，每種化合物選擇2個(gè)特征碎片離子分別作為定性和定量離子。3種PBUTs的子離子掃描質(zhì)譜圖見圖4。在SRM監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)分析物的離子信號(hào)達(dá)到最佳。根據(jù)IS、P-CS、HA和IS-D4的特征碎片離子豐度確定最佳碰撞能量（CE），優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖4 3種PBUTs的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig．4 Product ion mass spectra of 3 PUBTs

2.5 蛋白結(jié)合率

蛋白結(jié)合率（B%）根據(jù)下式計(jì)算：

式中，Cs和Cf分別代表模擬液中溶質(zhì)的總質(zhì)量濃度和游離溶質(zhì)的質(zhì)量濃度（μg∕mL），均由優(yōu)化后的色譜質(zhì)譜條件測(cè)得。經(jīng)計(jì)算，根據(jù)“1．3”方法所制備的12份模擬液中，IS、P-CS和HA的蛋白結(jié)合率分別為90% ± 3%、93% ± 3%和40% ± 5%，與血液透析患者體內(nèi)的蛋白結(jié)合率基本一致［15，22］。因此，本實(shí)驗(yàn)配制的模擬液可以代替血液進(jìn)行模擬透析實(shí)驗(yàn)。

2.6 專屬性

將空白模擬液經(jīng)前處理后得到空白模擬液樣品，添加IS、P-CS、HA和IS-D4的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)試。結(jié)果顯示，所有目標(biāo)化合物的峰形尖銳對(duì)稱，分離良好；P-CS的保留時(shí)間處有干擾物質(zhì)，但該雜質(zhì)的響應(yīng)低于定量下限20%，不影響定量［24］，其余目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間附近無(wú)干擾峰，說明該方法具有良好的專屬性。

2.7 線性關(guān)系與定量下限

空白模擬液經(jīng)處理后得到空白基質(zhì)溶液，以此溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作液得到質(zhì)量濃度分別為25、50、100、250、500、750、1 000 ng∕mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，IS-D4的質(zhì)量濃度為100 ng∕mL，在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以各待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），以對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，ng∕mL）進(jìn)行線性回歸（加權(quán)系數(shù)1∕x2）。如表2所示，3種PBUTs在25 ～ 1 000 ng∕mL范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）大于0．99。根據(jù)信噪比（S∕N）大于10，確定IS、P-CS、HA的定量下限均為25 ng∕mL。

表2 3種PBUTs的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges，linear equations and correlation coefficients of 3 PBUTs

2.8 準(zhǔn)確度與精密度

為驗(yàn)證前處理方法對(duì)3種PBUTs定量檢測(cè)的可靠性，選擇空白基質(zhì)溶液進(jìn)行低（75 ng∕mL）、中（250 ng∕mL）、高（750 ng∕mL）3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（n= 3）。其中，中濃度樣品平行配制6份，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）作為日內(nèi)精密度；該濃度樣品連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算RSD，作為日間精密度，結(jié)果見表3。3種PBUTs的平均回收率為92．5% ～ 114%，日內(nèi)、日間RSD為1．6% ～ 3．5%，本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足實(shí)際樣品分析要求，可用于透析前后模擬液中PBUTs的定量檢測(cè)。

2.9 基質(zhì)效應(yīng)

當(dāng)采用質(zhì)譜方法檢測(cè)生物樣品時(shí)，常出現(xiàn)較嚴(yán)重的基質(zhì)干擾，因此應(yīng)考察基質(zhì)效應(yīng)。以超純水配制的IS、P-CS和HA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為溶劑樣品；空白基質(zhì)配制的IS、P-CS和HA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為基質(zhì)樣品；將IS、P-CS和HA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白模擬液進(jìn)行處理后得到的樣品溶液作為處理樣品。將上述樣品的響應(yīng)值（A）進(jìn)行比較，基質(zhì)效應(yīng)（ME） =A基質(zhì)樣品∕A溶劑樣品× 100%，提取回收率 =A處理樣品∕A基質(zhì)樣品×100%，結(jié)果如表3所示。IS、P-CS和HA的基質(zhì)效應(yīng)為80．6% ～ 105%，提取回收率為95．0% ～ 113%，表明基質(zhì)不影響PBUTs的檢測(cè)，可以滿足測(cè)定要求。

表3 3種PBUTs的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率Table 3 Recoveries，relative standard deviations，matrix effects and extraction recoveries of 3 PBUTs

2.10 實(shí)際樣品分析

選取12支市售的同一規(guī)格高通量透析器進(jìn)行透析模擬實(shí)驗(yàn)，采用本方法對(duì)透析前后模擬液中PBUTs的濃度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算清除率。結(jié)果顯示，3種PBUTs的清除率平行性均較好，RSD小于10%。表明該方法能夠快速、準(zhǔn)確地評(píng)估透析器對(duì)PBUTs的清除效果。

3 結(jié) 論

本文基于高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以含有適當(dāng)濃度PBUTs的牛血清白蛋白水溶液作為模擬液，采用有機(jī)溶劑沉淀蛋白和超濾離心前處理方法，建立了可同時(shí)評(píng)價(jià)透析器對(duì)3種PBUTs清除效果的方法。該方法前處理簡(jiǎn)單、成本低廉、回收率高、重復(fù)性好，一次測(cè)定即可完成透析器對(duì)3種PBUTs清除效果的評(píng)價(jià)，可為血液凈化行業(yè)研發(fā)具有高效清除性能的透析器提供技術(shù)支持。