霍寧寧，李研東，韓 雪，艾連峰，王振來

（1．河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2．河北省獸藥飼料工作總站，河北 石家莊 050035；3．石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050011）

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年7月發(fā)布的194號(hào)公告［1］中規(guī)定，除中藥、驅(qū)蟲藥等部分藥物外，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)禁止使用所有促生長(zhǎng)和治療預(yù)防性藥物。自此藥物飼料添加劑退出歷史舞臺(tái)。而中獸藥因其天然、毒副作用小、價(jià)格低廉、符合法規(guī)要求等優(yōu)勢(shì)［2］，在獸藥市場(chǎng)的激烈競(jìng)爭(zhēng)中脫穎而出。中獸藥產(chǎn)品的快速崛起，在帶來利潤(rùn)的同時(shí)也給不法分子帶來了可乘之機(jī)，有些企業(yè)利用中獸藥檢測(cè)技術(shù)滯后單一、標(biāo)準(zhǔn)匱乏的現(xiàn)狀，通過添加化學(xué)藥物的手段達(dá)到非法獲利的目的［3］。中藥植物源性成分來源多樣，有效成分復(fù)雜，如生物堿類、黃酮類、皂苷類、色素、糖類、揮發(fā)油等物質(zhì)均可對(duì)常規(guī)儀器檢測(cè)產(chǎn)生影響［4-5］，因而快速篩查其中的非法添加物十分困難，且非法添加藥物的廣泛性和隱蔽性也對(duì)檢測(cè)儀器的選擇性、分辨率和準(zhǔn)確性提出更高要求，傳統(tǒng)獸藥檢測(cè)方法和儀器顯然無法滿足高通量和快速的檢測(cè)要求。目前報(bào)道的關(guān)于獸藥中違禁藥物添加方面的儀器檢測(cè)技術(shù)主要有分光光度法［6］、氣相色譜法［7］、液相色譜法［8-9］、質(zhì)譜法［2，10-11］等。其中《中華人民共和國(guó)獸藥典》［12］和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告［13］等規(guī)定的獸藥檢驗(yàn)方法多以液相色譜法為主，其前處理過程往往依據(jù)現(xiàn)有藥典和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，方法適用性較差，抗干擾能力不足，檢測(cè)的目標(biāo)物有限，對(duì)于獸藥中違禁藥物的檢測(cè)局限性較大。辜慧等［3］建立了UPLCMS∕MS法同時(shí)檢測(cè)減肥類、壯陽(yáng)類、降糖類、解熱鎮(zhèn)痛類中藥制劑中易被添加的27種化藥成分，但檢測(cè)種類少，且此種類的中藥制劑成分較為簡(jiǎn)單；曹秀等［10］建立了26種獸藥制劑中喹諾酮類、磺胺類、孔雀石綠及金剛烷胺的檢測(cè)方法，檢出限低，但檢測(cè)藥物種類少，在篩查中可能會(huì)忽略其他非法添加藥物；林仙軍等［14］采用UPLC-Q-TOF MS法建立了快速篩查獸藥中72種非法添加化學(xué)藥物的方法，但藥物的添加濃度較高。目前關(guān)于獸藥中非法添加化合物的分析標(biāo)準(zhǔn)只有四川省的DB 51∕T 1855-2014［15］和山東省的DB 37∕T 2817-2016［16］，而相關(guān)的國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)均未見報(bào)道。

隨著高分辨質(zhì)譜的應(yīng)用日益廣泛，其高選擇性、高靈敏度、高分辨率，以及對(duì)未知化合物的高通量篩查優(yōu)勢(shì)愈加凸顯。結(jié)合高速發(fā)展的樣品前處理技術(shù)和復(fù)雜樣品基質(zhì)成分的多組分分析技術(shù)被更多的研究者采用［14，17-24］，本文采用0．5%甲酸乙腈-水對(duì)樣品進(jìn)行提取，將提取液經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化后，超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)分析，建立了小分子篩查數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合Trace Finder篩查軟件分析，初步確立了適用于中獸藥口服液中167種非法添加藥物的高通量快速篩查方法。該方法可進(jìn)行上百種非法添加藥物的篩查檢測(cè)，適用于復(fù)雜中藥基質(zhì)的高選擇性、高通量的篩查，一定程度上擴(kuò)充了藥物篩查種類和數(shù)量，適用于具備儀器條件的政府監(jiān)管部門和第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)使用，也可為相關(guān)企業(yè)在原材料質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)控制、成品監(jiān)督等方面提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

167種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品（First Standard，阿爾塔公司）；乙腈（色譜純，默克公司）；屈臣氏蒸餾水；甲酸（88%，賽默飛世爾科技公司）。

UltiMate 3000-Q-Exactive Focus超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜，Accucore RP-MS色譜柱（Thermo公司）；Oasis PRiME HLB（6 mL，200 mg）固相萃取柱、HLB（3 mL，60 mg）固相萃取柱、MCX（6 mL，150 mg）固相萃取柱（Waters公司）；Captiva EMR-Lipid（3 mL，300 mg）固相萃取柱（Agilent公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

167種質(zhì)量濃度為100 μg∕mL的標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)溶液，配制成10 μg∕mL的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確量取167種混標(biāo)儲(chǔ)備液（10 μg∕mL），用甲醇稀釋成1 μg∕mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液待用。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱：Accucore RP-MS柱（100 mm × 2．1 mm，粒徑2．6 μm）；流動(dòng)相A：0．05%甲酸水；流動(dòng)相B：0．05%甲酸乙腈；梯度洗脫程序：0 ～ 2．5 min，98% ～ 95% A；2．5 ～ 5．8 min，95% ～90% A；5．8 ～ 6．5 min，90% ～ 85% A；6．5 ～ 7．5 min，85% ～ 80% A；7．5 ～ 9．5 min，80% ～ 70% A；9．5 ～10．5 min，70% ～ 60% A；10．5 ～ 12 min，60% ～ 55% A；12 ～ 14 min，55% ～ 45% A；14 ～ 18 min，45% ～5% A；18 ～ 21 min，5% A；21 ～ 22．5 min，5% ～ 98% A；22．5 ～ 25 min，98% A；流速：0．3 mL∕min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI源），正負(fù)離子檢測(cè)模式（ESI+、ESI-）同時(shí)掃描，掃描方式為一級(jí)全掃描，數(shù)據(jù)依賴型二級(jí)質(zhì)譜掃描（Full MS∕dd-MS2），源區(qū)主要參數(shù)設(shè)置：鞘氣流速：9 arb，噴霧電壓：3 kV，毛細(xì)管（離子傳輸管）溫度：320 ℃，S-lens電壓：55 kV，輔助氣加熱溫度：30 ℃。質(zhì)譜一級(jí)掃描模式為Full MS，掃描范圍（m∕z）為100 ～ 900，一級(jí)分辨率為70 000，C-Trap的離子數(shù)目為1 × 106，離子最大注入時(shí)間為100 ms；二級(jí)掃描模式為dd-MS2模式，二級(jí)分辨率為35 000，頂點(diǎn)激發(fā)時(shí)間為3 ～ 6 s，設(shè)置階梯碰撞能分別為20、35、50 kV，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為8 s。采集數(shù)據(jù)前使用正負(fù)離子校正液進(jìn)行質(zhì)量軸校正。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)通過Xcalibur質(zhì)譜工作臺(tái)提取化合物碎片離子信息，通過Trace Finder篩查軟件建立篩查數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 樣品前處理

為構(gòu)建適用于絕大部分樣品的前處理方法，實(shí)驗(yàn)選擇樣品基質(zhì)成分復(fù)雜，且不容易去除基質(zhì)影響的清解合劑做為代表性樣品。

提?。悍Q取中獸藥口服液樣品0．25 g（精確至0．01 g），置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL 0．5%甲酸乙腈水（乙腈∶水 = 9∶1）溶液，渦旋混勻10 min，超聲提取20 min，12 000 r∕min 離心10 min；取上清液至25 mL容量瓶中定容，待凈化。

凈化：取上清液5 mL，過Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，將流出液在40 ℃下氮吹濃縮至0．1 mL左右，用0．2%甲酸水定容至1 mL，渦旋混勻做為原液。取原液0．2 mL定容到1 mL，渦旋混勻后做上機(jī)液，上機(jī)液過0．2 μm微孔濾膜后，供質(zhì)譜分析。

1.5 篩查結(jié)果判定

參考《獸藥殘留檢測(cè)中質(zhì)譜方法確證指南》［25］和歐盟2002∕657∕EC［26］準(zhǔn)則，應(yīng)用高分辨質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析時(shí)，若有1個(gè)母離子和1個(gè)子離子或2個(gè)子離子匹配則可確證分析的樣品含有該化合物。對(duì)于疑似陽(yáng)性樣品，進(jìn)一步在dd-MS2模式下針對(duì)疑似含有的化合物進(jìn)行二級(jí)特征碎片離子掃描，當(dāng)有2個(gè)或以上豐度較高的碎片離子與標(biāo)準(zhǔn)譜圖中相應(yīng)的碎片離子精確質(zhì)量偏差小于5 ppm且碎片離子的相對(duì)豐度比在最大允許偏差范圍內(nèi)時(shí)，確證含有該化合物。

對(duì)供試品溶液進(jìn)行Full MS∕dd-MS2全掃描，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)篩查數(shù)據(jù)庫(kù)中m∕z的精確分子質(zhì)量、保留時(shí)間和至少有一個(gè)碎片離子對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行篩查。當(dāng)未知物出峰時(shí)間偏差在 ± 0．5 min內(nèi)，母離子響應(yīng)值在105及以上、精確質(zhì)量數(shù)偏差在5 ppm范圍內(nèi)，子離子響應(yīng)值在104及以上、精確質(zhì)量數(shù)偏差在5 ppm范圍內(nèi)，同位素豐度比范圍在70%范圍內(nèi)，則檢測(cè)結(jié)果為疑似陽(yáng)性樣品，否則判定為陰性樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩查數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

根據(jù)167種非法添加化學(xué)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品信息，通過儀器方法分析，自建了167種化合物的基本信息及色譜-質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)庫(kù)（見表1）。

表1 167種化合物的基本信息及色譜-質(zhì)譜信息Table 1 Basic information and chromatography-mass spectrometry information of 167 compounds

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.2 色譜條件的優(yōu)化

考察了多個(gè)因素對(duì)色譜分離、靈敏度及離子化效率的影響，包括流動(dòng)相及流動(dòng)相梯度選擇。由于本文所考察的化合物性質(zhì)差異較大，含有8對(duì)同分異構(gòu)體，多西環(huán)素單鹽酸半乙醇半水合物與鹽酸四環(huán)素，潑尼松龍與可的松，磺胺間二甲氧嘧啶與磺胺鄰二甲氧嘧啶，鹽酸萊克多巴胺與鹽酸苯氧丙酚胺，磺胺氯噠嗪與磺胺氯吡嗪，磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪與磺胺間甲氧嘧啶，磺胺二甲基嘧啶與磺胺二甲異嘧啶，磺胺惡唑與磺胺異惡唑，本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)流動(dòng)相的梯度條件、流動(dòng)相的成分進(jìn)行考察，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的最佳分離以及各化合物的良好峰形和最佳響應(yīng)。考察了乙腈-0．05%甲酸水、0．05%甲酸乙腈-0．05%甲酸水、甲醇-水和乙腈-水分別作為流動(dòng)相時(shí)，不同梯度下目標(biāo)物在Accucore RP-MS（100 mm × 2．1 mm，2．6 μm）色譜柱上的分離效果。結(jié)果顯示，在甲醇-水或乙腈-水中，同分異構(gòu)體均未能完全分離，與甲醇-水相比，乙腈-水中均加入0．05%甲酸時(shí)，增加了化合物的電離效果，大部分待測(cè)物的相應(yīng)靈敏度提高，峰形得到改善；理論上，加入0．1%甲酸時(shí)化合物的電離效果會(huì)更加明顯，但對(duì)于負(fù)離子模式的化合物而言，會(huì)抑制負(fù)離子模式的化合物電離?？紤]到目標(biāo)物在正負(fù)離子模式所需的最適溶液pH和當(dāng)前的靈敏度和峰形均已滿足要求，且上述8對(duì)同分異構(gòu)體均已實(shí)現(xiàn)完全分離（見圖1），因此實(shí)驗(yàn)最終選擇0．05%甲酸乙腈-0．05%甲酸水作為最佳流動(dòng)相，并按“1．3”梯度洗脫條件進(jìn)行分離。

圖1 8對(duì)同分異構(gòu)體的分離色譜圖Fig．1 Separation chromatograms of 8 pairs of isomers

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對(duì)掃描模式、碰撞能、采集點(diǎn)數(shù)和動(dòng)態(tài)排除時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。在選擇掃描采集模式中，根據(jù)167種化合物的化學(xué)性質(zhì)，全氟辛酸、氯霉素類和地克珠利以［M - H］-的響應(yīng)值最高，其他化合物以［M + H］+的響應(yīng)值最高。由于儀器可提供正、負(fù)模式同時(shí)掃描，本實(shí)驗(yàn)選擇正、負(fù)模式同時(shí)掃描對(duì)167種化合物進(jìn)行采集。通常進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索時(shí)，低碰撞能量的質(zhì)譜圖有利于判斷主要碎片，高碰撞能量的質(zhì)譜圖可得到更多質(zhì)譜碎片細(xì)節(jié)，提高化合物的定性準(zhǔn)確性，由于實(shí)驗(yàn)涉及的化學(xué)物質(zhì)種類繁多，本文設(shè)置了較寬范圍的分步碰撞能，以獲得最適合的碰撞能擊打碎片。在質(zhì)譜掃描采集點(diǎn)數(shù)優(yōu)化過程中，質(zhì)譜采集點(diǎn)數(shù)以12 ～ 15個(gè)為最優(yōu)，且Chorm peak Width和Smoothing中的Points參數(shù)值變大可改善質(zhì)譜正負(fù)模式同時(shí)掃描中采集點(diǎn)數(shù)不夠的問題，因此實(shí)驗(yàn)將Chorm peak Width參數(shù)由15改為30，將Smoothing 中的Points數(shù)值從3增至7，以增加采集點(diǎn)數(shù)，此時(shí)色譜峰形逐漸平滑且趨于正態(tài)分布而非平頭峰趨勢(shì)（如圖2）。為避免重復(fù)采集響應(yīng)強(qiáng)度占優(yōu)勢(shì)的某一質(zhì)荷比的母離子的二級(jí)質(zhì)譜，盡可能獲得不同質(zhì)核比的母離子的二級(jí)譜圖，本實(shí)驗(yàn)將動(dòng)態(tài)排除時(shí)間縮短（由15 s改為8 s），以增加獲得不同質(zhì)荷比母離子的二級(jí)質(zhì)譜信息的機(jī)率，避免出現(xiàn)漏采集情況。

圖2 譜圖采集點(diǎn)數(shù)的比較Fig．2 Comparison of the number of spectral acquisition points

2.4 提取溶劑的選擇

由于本實(shí)驗(yàn)涉及化合物的極性差異較大，且獸藥基質(zhì)多為水溶性雜質(zhì)。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，考察了甲醇、乙腈、0．1%乙酸乙腈、1%乙酸乙腈、0．5%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、0．5%甲酸乙腈-水（9∶1）作為提取液的提取效果。結(jié)果顯示（見圖3），在提取液中加入適當(dāng)酸可提高化合物的篩查檢出率，且甲酸的效果優(yōu)于乙酸，但過量的酸度會(huì)抑制硝基咪唑類、頭孢類、內(nèi)酰胺類物質(zhì)的提取效果。就提取液的顏色而言，0．5%甲酸乙腈提取的樣品溶液顏色較淺，表明色素含量少。在實(shí)驗(yàn)過程中，因?yàn)榭诜罕旧砗兴?，考慮到待測(cè)化合物為水溶性化合物，故在提取液中加入少量水可提高篩查檢出率，滿足實(shí)驗(yàn)要求。本實(shí)驗(yàn)最終選擇0．5%甲酸乙腈-水（9∶1）為提取液。

圖3 不同提取液對(duì)添加藥物的篩查結(jié)果Fig．3 Screening results of different extract soltions for drug addition

2.5 凈化條件的優(yōu)化

為有效去除酮、醛、酚等干擾物質(zhì)的影響，增加對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)定性和定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，本研究參考畜產(chǎn)品的前處理過程，考察了4種不同品牌和填料的固相萃取小柱（PRiME HLB固相萃取柱、HLB固相萃取柱、EMR固相萃取柱、MCX固相萃取柱）的分離、凈化和富集效果。結(jié)果顯示，PRiME HLB和EMR固相萃取柱無需活化、平衡等步驟，可將提取液直接過柱達(dá)到凈化目的，但后者需采用比例為4∶1的提取液-水上樣；而HLB和MCX固相萃取柱需經(jīng)過一系列活化上樣，過程較繁雜。此外，PRiME HLB固相萃取柱對(duì)絕大多數(shù)化合物的保留性強(qiáng)，洗脫液顏色相較提取液明顯變淺，原因可能為部分色素、生物堿、皂苷等保留在凈化柱上。進(jìn)一步考察了上樣體積的影響，結(jié)果顯示，若上樣體積過低，則待測(cè)物可能因洗脫體積小而保留在凈化柱上；加大上樣體積，則雜質(zhì)目標(biāo)物同時(shí)洗脫出固相萃取柱，導(dǎo)致檢出效果變差。最終選擇5 mL提取液過PRiME HLB固相萃取柱凈化，以獲得最好的實(shí)驗(yàn)效果。

2.6 樣品分析

考察顯示，167種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在上機(jī)質(zhì)量濃度為20 ng∕mL時(shí)，絕大部分藥物均檢出，頭孢類和內(nèi)酰胺類藥物在50 ng∕mL時(shí)檢出。因基質(zhì)影響，不同藥物配方非法添加藥物的檢出率略有差異，配方成分復(fù)雜的口服液（如：清解合劑、清瘟解毒口服液等）前處理后，藥物檢出濃度高于簡(jiǎn)單配方的中藥口服液。如四逆湯樣品以50 ng∕mL上機(jī)時(shí)絕大部分藥物均可檢出，頭孢他美酯、頭孢匹啉、氨芐西林和哌拉西林等不能檢出的頭孢類藥物和內(nèi)酰胺類藥物，可在100 ng∕mL上機(jī)濃度時(shí)檢出；選擇含石膏、金銀花、玄參、黃芩、生地黃、連翹、梔子和龍膽等12種中藥基質(zhì)成分的清解合劑空白樣品為基質(zhì)，非法添加藥物在50 ng∕mL水平下（頭孢類和內(nèi)酰胺類藥物為100 ～ 200 ng∕mL）可定性檢出，其中藥物上機(jī)質(zhì)量濃度為100 ng∕mL時(shí)，檢出率為95．81%，藥物上機(jī)質(zhì)量濃度為200 ng∕mL時(shí)，藥物檢出率可達(dá)100%。依據(jù)違法者在中獸藥中主觀添加非法藥物發(fā)揮抗病或治療效果的目的，本文的檢測(cè)濃度已滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。

3 結(jié) 論

本文基于酸性有機(jī)溶劑振蕩超聲提取的方式，對(duì)不同中獸藥口服液中的167種非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行快速測(cè)定；采用自建的篩查數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)樣品數(shù)據(jù)結(jié)果，檢出率可滿足分析測(cè)定要求；使用UltiMate 3000-Q-Exactive Focus進(jìn)行分析，精確測(cè)得目標(biāo)物母離子及子離子的分子量、保留時(shí)間，降低了測(cè)定結(jié)果的不準(zhǔn)確性。該方法采用Trace Finder篩查軟件建立了167種非法添加化學(xué)藥物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可有效實(shí)現(xiàn)不同中獸藥基質(zhì)中非法添加化學(xué)藥物的快速檢測(cè)，滿足對(duì)中獸藥口服液中非法添加物定性篩查的要求，為獸藥企業(yè)監(jiān)控獸藥制劑的質(zhì)量，以及管理部門加強(qiáng)獸藥質(zhì)量監(jiān)控，震懾不法摻假分子提供了技術(shù)保障，從源頭上保證了動(dòng)物源性食品的安全。