林若漫，林振華

（深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳 518000）

生物毒素又稱天然毒素，是廣泛存在于自然環(huán)境和食品中的一類次生代謝產物，具有不可復制、多樣性和復雜性等特點，根據(jù)來源可以劃分為微生物毒素、動物毒素、植物毒素以及其他毒素[1]。某些毒素具有劇毒性和致癌性，如肉毒桿菌毒素和黃曲霉毒素等，其廣泛存在于食品領域。近年來，食品中生物毒素導致的中毒事件時有發(fā)生，毒素隨食品進入人體內可造成惡心、腹瀉、頭暈、致幻、呼吸麻痹甚至死亡等癥狀，嚴重威脅著人們的身體健康?！秶倚l(wèi)生計生委辦公廳關于2015年全國食物中毒事件情況的通報》[2]中顯示，2015年，有毒動植物及毒蘑菇引起的食品安全事故占全年食物中毒事件總報告起數(shù)的40.2%，總死亡人數(shù)的73.6%。2019—2021年國內飼料原料和飼料中霉菌毒素污染調查報告顯示[3-4]，采用免疫親和柱-高效液相色譜熒光檢測法對樣品中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素進行測定，結果顯示飼料和原料中檢出一種及以上毒素的陽性率在這3年分別為99.33%、99.44%和99.51%，飼料及其原料污染霉菌情況不容樂觀。主要原因是人們對有毒有害物質認知不足、食品加工過程不規(guī)范或食材儲存不當，導致食品的污染或變質。因此，對食品中生物毒素的檢測也成為現(xiàn)階段科研人員和食品檢測機構關注的重點。

由于食品基質的復雜性，食品基質效應往往會對檢測方法的準確性和精密度造成一定的干擾，使用傳統(tǒng)純化學標準物質進行質量控制和能力評價有時難以滿足檢測需求，需要結合同一基質的基體標準物質對檢測體系進行綜合評價。基體標準物質可以有效克服基質效應引起的誤差，保障檢測結果數(shù)值的準確性和可溯源性。當前國內外對于基體標準物質的研究都非常重視，相比于國外，我國基體標準物質的研究起步相對較晚，針對生物毒素的基體標準物質研究更少，主要依賴進口，但國外生物毒素基體標準物質價格昂貴、貨物周期長，基體標準物質的研制對保障人們的身體健康、滿足市場檢測和科研需求、填補我國相關技術和標準空白具有重要意義。本文將從國內外生物毒素基體標準物質研究現(xiàn)狀、制備工藝等方面進行綜述，以期為后續(xù)生物毒素基體標準物質使用者和研究者提供參考。

1 基體標準物質的概述

標準物質是一種對檢測數(shù)值具有可比性和溯源性的計量標準，是分析檢測工作中重要的材料或物質[5]。標準物質主要用于方法的研制和評價、建立測量的溯源性，是實驗室分析測試的質量保證[6-7]。標準物質主要分為純化學品標準物質和基體標準物質。與純化學品標準物質相比，基體標準物質與實際樣品成分盡可能保持一致[8]，可以提高測試結果和質量控制的可靠性。基體標準物質可以避免基質本身含有的活性物質與生物毒素產生反應，降低基質對測定結果造成的干擾。歐盟在法規(guī)（2002/657/EC）中規(guī)定，在分析檢測過程中，需要采用基體標準物質進行過程的質量控制。以標準物質作為質量控制的手段是檢測分析的關鍵，而制備高水平的基體標準物質保證食品檢測數(shù)據(jù)的可靠性和準確性是當前食品安全的重中之重。

基體標準物質陽性樣本獲取一般有兩種方法，自然污染陽性樣本或空白基質加標法。自然污染陽性樣本篩選工作量大，具有一定的盲目性，通常采用模擬毒素實際污染的途徑制備陽性樣品，如接種霉菌、飼喂等。基體標準物質制備過程中的主要方法有粉碎、勻漿、冷凍干燥、篩分、攪拌均勻和分裝等，最后通過均勻性、穩(wěn)定性、定值和不確定度評定等步驟完成研制。

2 國內外生物毒素基體標準物質研究現(xiàn)狀

2.1 國外有證生物毒素基體標準物質研究現(xiàn)狀

近年來，有證生物毒素基體標準物質的開發(fā)在國內外都非常重視。生物毒素基體標準物質開發(fā)方面，美國標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）和歐洲標準局和標準物質（Institute for Reference Materials and Measurements，

IRMM）以糧食、飼料、加工食品為基質，開發(fā)了多款真菌毒素基體標準品，如以脫脂花生和花生醬為基質制備的黃曲霉毒素B1基體標準物質，以全脂奶粉為基質制備的黃曲霉毒素M1基體標準物質，以玉米粉為基質制備的嘔吐毒素基體標準物質。此外還有學者研制了植物毒素基體標準物質，如以油菜籽為基質制備的硫代葡萄糖苷基體標準物質。加拿大國家研究委員會（National Research Council Canada，NRC）計量研究中心是研制海洋生物毒素有證標準物質種類最多且獲全球公認的機構，開發(fā)的產品如以貝類為基質的失憶性生物毒素基體標準品和腹瀉性生物毒素基體標準品等。

2.2 國內有證生物毒素基體標準物質研究現(xiàn)狀

在國內有證標準物質唯一官方公布平臺“國家標準物質資源共享平臺”上，關于食品中生物毒素的基體標準物質中一級標準物質7種，二級標準物質52種，涉及化合物包括黃曲霉毒素、騰毒素、伏馬毒素、細交鏈孢菌酮酸、玉米赤霉烯酮、河豚毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素等，其中涉及化合物最多的為黃曲霉毒素B1，有23種，占目前公布總數(shù)的39.0%，涉及的食品基質占比最多的為玉米粉，有14種，占比23.7%[9]。此外，還有玉米/花生調和植物油、糙米粉、大米粉、小麥粉、奶粉、花生醬、葡萄酒、織紋螺肉和河豚魚肉等。

2.3 黃曲霉毒素類基體標準物質研究現(xiàn)狀

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFTs）是由黃曲霉和寄生曲霉菌產生的高毒性、低分子質量的雙呋喃環(huán)類毒素，最常見和最主要的黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2，其他黃曲霉毒素均是這4種毒素的衍生物，如哺乳動物誤食含有黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的谷物飼料后，在其體內經過羥基化作用衍生轉化成黃曲霉毒素M1[10]。這類毒素中以黃曲霉毒素B1毒性最大，且是已知的化學物質中致癌性最強的一種[11]，被列為I類致癌物，廣泛存在于土壤和各級農產品中，主要污染花生、玉米、小麥等糧食谷物，并通過食物鏈影響人們的身體健康[12]。李麗等[13]通過對全國各代表性區(qū)域種植的玉米進行篩選，經粉碎、混勻后制備了均勻性和穩(wěn)定性滿足要求的基體標準物質，定值含量為（27±3）μg·kg-1，并獲批為國家二級標準物質，為我國糧食中黃曲霉毒素B1的檢測和鑒定提供計量標準。

基體標準物質的均勻性和穩(wěn)定性一直是研制過程的重點和難點。張磊[14]選擇以黃曲霉菌接種的花生替代天然污染的花生，為降低基體活性采用高溫高壓和γ射線輻照滅菌，為了提高黃曲霉毒素B1基體標準物質的穩(wěn)定性采用了添加穩(wěn)定劑、雙層包裝、高抗性花生作為原料，同時通過將樣品粉碎至微米級以及添加乳化劑的方式以提高標準物質的均勻性，為后續(xù)基體標準物質的制備提供了一套完整的制備工藝流程。

當前針對黃曲霉毒素的檢測方法和有證標基體準物質主要集中在玉米、花生等作物中，而對于以這些作物為原料的飼料中黃曲霉毒素的檢測技術研究較少，也缺乏相應的基體標準物質。為彌補這一空白，趙天天等[15]以玉米為飼料原料，向其中添加黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標準溶液，混勻后對樣品進行干燥、輻照滅菌、分裝和真空包裝最終制得飼料中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2基體標準物質，經定值分別為（71.23±1.60）μg·kg-1、 （75.53±1.28）μg·kg-1、（74.87±1.79）μg·kg-1和（75.77±2.68）μg·kg-1。

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2主要存在于糧食谷物中；黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2主要存在牛奶和相關乳制品中，其中黃曲霉毒素M1性質穩(wěn)定，不僅耐高溫也耐酸堿，因此含有黃曲霉毒素M1的牛乳被用于制備嬰幼兒奶粉會導致奶粉中黃曲霉毒素M1含量不合格[16]。魏敏等[17]通過給牛喂養(yǎng)被霉菌污染的飼料方式，獲取含有黃曲霉毒素M1的牛奶乳品，制備了滿足檢測要求的乳粉中黃曲霉毒素M1基體標準物質，定值結果為（2.45±0.41）μg·kg-1，并獲批為國家二級標準物質，對保障我國乳品質量具有重要意義。

2.4 伏馬毒素類基體標準物質研究現(xiàn)狀

伏馬毒素是一種霉菌毒素，主要是由輪狀鐮刀菌（Fusarium Verticilllioides）、串珠鐮刀菌（Fusarium Moniliforme）等在一定條件下產生的水溶性代謝產物，被列為2B級致癌物。目前，伏馬毒素已發(fā)現(xiàn)A、B、C和P四大類，伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3最為常見，其中伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）毒性最強，污染最多，廣泛存在于小麥、水稻、高粱以及玉米等糧食作物中。伏馬毒素具有極強的熱穩(wěn)定性，在普通加工過程中其性質和結構均能保持穩(wěn)定，因此伏馬毒素污染不僅影響糧食產量，還會通過食物鏈進入人體，威脅健康[18]。孟佳佳等[19]通過將產毒鐮刀菌接種到玉米培養(yǎng)基中的方式，獲得了含有伏馬毒素B1和伏馬毒素B2的陽性基質樣本，通過粉碎混勻，并采用空白玉米粉進行逐級稀釋，成功制備了一批均勻性和穩(wěn)定性符合要求的玉米粉中伏馬毒素B1和伏馬毒素B2基體標準物質，經定值分別為（1.07±0.09）mg·kg-1和（0.43±0.07）mg·kg-1，為我國谷物質量安全風險評估提供技術支持與物質保障。進口標準物質價格昂貴、貨物周期長，為替代進口標準物質，填補國內在玉米粉中伏馬毒素基體標準物質研制的空白，牛欣寧等[20]通過將玉米樣品放置在伏馬毒素B1的標準溶液中浸泡，經過冷凍干燥制備成基體標準物質，定值為 （1475.56±169.98）μg·kg-1，可用于實驗儀器校準及實驗過程質量控制等。

2.5 嘔吐毒素類

嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇或脫氧瓜萎鐮菌醇，為鐮刀菌產生的有毒代謝物，在小麥、玉米甚至肉和奶制品中都有檢出[21]，長期攝入對血液和免疫系統(tǒng)均會產生影響[22-24]。 針對目前國內外谷物中檢出頻率最多、污染最普遍的真菌霉素——嘔吐毒素，許嬌嬌等[25]在國內首次以天然污染的食品面粉為候選物，經均質、分裝、滅菌、定值，為保證存放和運輸過程中的穩(wěn)定性，使用Co-60γ射線進行照射滅菌，成功研制了均勻性和穩(wěn)定性符合要求、定值為（2366±187）μg·kg-1的嘔吐毒素基體標準物質，為后續(xù)國內開展食品中嘔吐毒素的監(jiān)測數(shù)據(jù)的準確性提供保障。

2.6 交鏈孢霉毒素

交鏈孢霉屬（Alternaria）是一類廣泛分布于土壤和農產品中的真菌，農作物感染后會發(fā)生腐敗。交鏈孢霉代謝產生的毒素統(tǒng)稱為交鏈孢霉毒素（Alternaria Toxins），其中以細交鏈孢菌酮酸（Tenuazonic Acid，TeA）和騰毒素（Tentoxin，TEN）污染最為常見。謝繼安等[26]以天然污染交鏈孢霉毒素的小麥樣籽粒為基體，通過對全國各產區(qū)代表性樣品進行篩查，分別選取了來自安徽的天然污染低濃度和山西省的天然污染高濃度細交鏈孢菌酮酸和騰毒素小麥籽粒樣品作為候選物，通過磨粉、過篩、混勻、輻照滅菌等制備了兩種不同濃度的小麥粉中細交鏈孢菌酮酸和騰毒素基體標準物質，均獲批國家二級標準物質，同時也是國際上唯一的以天然污染細交鏈孢菌酮酸和騰毒素的小麥粉基體標準物質。

2.7 赤潮毒素

赤潮毒素是由海洋中存在的赤潮藻類產生的具有生物活性的物質，具有難防治、反應快、毒性大等特征。目前已知的有十幾種，根據(jù)中毒癥狀和傳遞媒介類型主要可以分為神經性、麻痹性、記憶缺失性和腹瀉性貝毒以及西加魚毒。其中麻痹性貝毒是分布最廣、危害最大的一類赤潮毒素，也是最早被發(fā)現(xiàn)的貝毒，是一種由鞭毛蟲和藍細菌引起的強效神經毒素[27]。腹瀉性貝類毒素是海洋廣泛分布的一些引發(fā)赤潮的生物分泌的一類聚醚或大環(huán)內酯化合物，常見的如軟海綿酸（Okadaic Acid，OA），該類毒素中毒癥狀以嘔吐和腹瀉為主。近年來，有毒有害赤潮在我國近海海域發(fā)生規(guī)模和次數(shù)均呈不斷增加的趨勢，阻礙了水產行業(yè)的發(fā)展。

由于腹瀉性和麻痹性貝毒化學結構比較復雜，難以通過化學合成方式獲取。桂文鋒[28]通過向扇貝投喂塔瑪亞歷山大藻和利瑪原甲藻，通過儀器持續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)內臟是扇貝毒素積累的主要部位，用塔瑪亞歷山大藻和利瑪原甲藻分別喂食到7 d和4 d后體內毒素超過安全限量值，將貝肉和內臟取出，勻漿，冷凍干燥后制備成均勻性和穩(wěn)定性符合要求含麻痹性貝毒和腹瀉性貝毒的基體標準物質。HIGMAN等[29]也通過向貝類喂食亞歷山大藻，確定了實驗室條件制備麻痹類貝毒基體標準物質的可行性。為保證腹瀉性貝類毒素檢測結果的可靠性，傅博強等[30]采用空白基質加標法，以紫貽貝為原料，將軟海綿酸溶液添加到肉漿中，冷凍干燥后粉碎、混勻制備成均勻性和穩(wěn)定性符合要求的軟海綿酸基體標準物質，經定值為（2.96±0.50）μg·g-1；王秋艷等[31]則采用自然基體污染法經測定腹瀉性貝類毒素陽性的貽貝，經冷凍干燥等工藝制備基體標準物質，定值為 （8.83±0.60）μg·g-1，該方法原料成本更低，可以用于腹瀉性貝類毒素檢測過程質量控制等。WANG等[32]通過對貝毒產生條件，如時間、溫度、營養(yǎng)物和鹽濃度等條件進行了優(yōu)化，經過35 d培養(yǎng)后收獲了含有鰭藻毒素-1和軟海綿酸的干藻粉，經定值分別為21.6 mg·g-1和15.2 mg·g-1，可為后續(xù)水產養(yǎng)殖行業(yè)中相關毒素的監(jiān)管提供技術支撐。

2.8 河豚毒素

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）最早由日本學者從河豚魚的卵巢中發(fā)現(xiàn)，是一種廣泛存在于某些脊椎和無脊椎動物體內的一種非蛋白質、高活性的神經毒素，可麻痹人體神經中樞和血管中樞，危及生命[33]。目前，河豚毒素的檢測主要采用純品標準物質作為質量控制和添加回收[34]。王偉等[35]首次報道以野生河鲀魚的精巢、卵巢、肝臟以及肌肉組織為基體，通過正己烷脫脂分離處理，采用兩次冷凍干燥程序制備了均勻性和穩(wěn)定性符合要求的河豚毒素基體標準物質，定值結果為（5.20±0.03）mg·kg-1，可用于對水產品中河豚毒素的檢測過程進行質量控制。

3 結語

食品中生物毒素是導致食品安全問題的關鍵環(huán)節(jié)。生物毒素基體標準物質對于食品中生物毒素分析檢測的可靠性具有非常重要的意義，但生物毒素在生物體內的含量普遍較低、污染部位不均勻、難以獲取特定目標含量的陽性樣品是阻礙生物毒素基體標準物質制備的關鍵點。我國生物毒素基體標準物質無論從種類還是數(shù)量上都無法滿足市場需求，主要集中在真菌毒素和海洋生物毒素類基體標準物質上，存在大量的空白，應該擴大毒素和基質種類的范圍，提高基體標準物質研制水平，以滿足我國科研和檢測市場需求，提高檢測結果的可靠性。