林若漫，林振華

（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518000）

生物毒素又稱天然毒素，是廣泛存在于自然環(huán)境和食品中的一類次生代謝產(chǎn)物，具有不可復(fù)制、多樣性和復(fù)雜性等特點(diǎn)，根據(jù)來源可以劃分為微生物毒素、動(dòng)物毒素、植物毒素以及其他毒素[1]。某些毒素具有劇毒性和致癌性，如肉毒桿菌毒素和黃曲霉毒素等，其廣泛存在于食品領(lǐng)域。近年來，食品中生物毒素導(dǎo)致的中毒事件時(shí)有發(fā)生，毒素隨食品進(jìn)入人體內(nèi)可造成惡心、腹瀉、頭暈、致幻、呼吸麻痹甚至死亡等癥狀，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康?！秶倚l(wèi)生計(jì)生委辦公廳關(guān)于2015年全國食物中毒事件情況的通報(bào)》[2]中顯示，2015年，有毒動(dòng)植物及毒蘑菇引起的食品安全事故占全年食物中毒事件總報(bào)告起數(shù)的40.2%，總死亡人數(shù)的73.6%。2019—2021年國內(nèi)飼料原料和飼料中霉菌毒素污染調(diào)查報(bào)告顯示[3-4]，采用免疫親和柱-高效液相色譜熒光檢測法對(duì)樣品中黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素進(jìn)行測定，結(jié)果顯示飼料和原料中檢出一種及以上毒素的陽性率在這3年分別為99.33%、99.44%和99.51%，飼料及其原料污染霉菌情況不容樂觀。主要原因是人們對(duì)有毒有害物質(zhì)認(rèn)知不足、食品加工過程不規(guī)范或食材儲(chǔ)存不當(dāng)，導(dǎo)致食品的污染或變質(zhì)。因此，對(duì)食品中生物毒素的檢測也成為現(xiàn)階段科研人員和食品檢測機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)。

由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性，食品基質(zhì)效應(yīng)往往會(huì)對(duì)檢測方法的準(zhǔn)確性和精密度造成一定的干擾，使用傳統(tǒng)純化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制和能力評(píng)價(jià)有時(shí)難以滿足檢測需求，需要結(jié)合同一基質(zhì)的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)檢測體系進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以有效克服基質(zhì)效應(yīng)引起的誤差，保障檢測結(jié)果數(shù)值的準(zhǔn)確性和可溯源性。當(dāng)前國內(nèi)外對(duì)于基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究都非常重視，相比于國外，我國基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究起步相對(duì)較晚，針對(duì)生物毒素的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究更少，主要依賴進(jìn)口，但國外生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格昂貴、貨物周期長，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制對(duì)保障人們的身體健康、滿足市場檢測和科研需求、填補(bǔ)我國相關(guān)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)空白具有重要意義。本文將從國內(nèi)外生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀、制備工藝等方面進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用者和研究者提供參考。

1 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的概述

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種對(duì)檢測數(shù)值具有可比性和溯源性的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，是分析檢測工作中重要的材料或物質(zhì)[5]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要用于方法的研制和評(píng)價(jià)、建立測量的溯源性，是實(shí)驗(yàn)室分析測試的質(zhì)量保證[6-7]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要分為純化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。與純化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與實(shí)際樣品成分盡可能保持一致[8]，可以提高測試結(jié)果和質(zhì)量控制的可靠性?；w標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以避免基質(zhì)本身含有的活性物質(zhì)與生物毒素產(chǎn)生反應(yīng)，降低基質(zhì)對(duì)測定結(jié)果造成的干擾。歐盟在法規(guī)（2002/657/EC）中規(guī)定，在分析檢測過程中，需要采用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行過程的質(zhì)量控制。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為質(zhì)量控制的手段是檢測分析的關(guān)鍵，而制備高水平的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保證食品檢測數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性是當(dāng)前食品安全的重中之重。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)陽性樣本獲取一般有兩種方法，自然污染陽性樣本或空白基質(zhì)加標(biāo)法。自然污染陽性樣本篩選工作量大，具有一定的盲目性，通常采用模擬毒素實(shí)際污染的途徑制備陽性樣品，如接種霉菌、飼喂等。基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備過程中的主要方法有粉碎、勻漿、冷凍干燥、篩分、攪拌均勻和分裝等，最后通過均勻性、穩(wěn)定性、定值和不確定度評(píng)定等步驟完成研制。

2 國內(nèi)外生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀

2.1 國外有證生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀

近年來，有證生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的開發(fā)在國內(nèi)外都非常重視。生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開發(fā)方面，美國標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）和歐洲標(biāo)準(zhǔn)局和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Institute for Reference Materials and Measurements，

IRMM）以糧食、飼料、加工食品為基質(zhì)，開發(fā)了多款真菌毒素基體標(biāo)準(zhǔn)品，如以脫脂花生和花生醬為基質(zhì)制備的黃曲霉毒素B1基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以全脂奶粉為基質(zhì)制備的黃曲霉毒素M1基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以玉米粉為基質(zhì)制備的嘔吐毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。此外還有學(xué)者研制了植物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如以油菜籽為基質(zhì)制備的硫代葡萄糖苷基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。加拿大國家研究委員會(huì)（National Research Council Canada，NRC）計(jì)量研究中心是研制海洋生物毒素有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類最多且獲全球公認(rèn)的機(jī)構(gòu)，開發(fā)的產(chǎn)品如以貝類為基質(zhì)的失憶性生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)品和腹瀉性生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)品等。

2.2 國內(nèi)有證生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀

在國內(nèi)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)唯一官方公布平臺(tái)“國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺(tái)”上，關(guān)于食品中生物毒素的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)7種，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)52種，涉及化合物包括黃曲霉毒素、騰毒素、伏馬毒素、細(xì)交鏈孢菌酮酸、玉米赤霉烯酮、河豚毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素等，其中涉及化合物最多的為黃曲霉毒素B1，有23種，占目前公布總數(shù)的39.0%，涉及的食品基質(zhì)占比最多的為玉米粉，有14種，占比23.7%[9]。此外，還有玉米/花生調(diào)和植物油、糙米粉、大米粉、小麥粉、奶粉、花生醬、葡萄酒、織紋螺肉和河豚魚肉等。

2.3 黃曲霉毒素類基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFTs）是由黃曲霉和寄生曲霉菌產(chǎn)生的高毒性、低分子質(zhì)量的雙呋喃環(huán)類毒素，最常見和最主要的黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2，其他黃曲霉毒素均是這4種毒素的衍生物，如哺乳動(dòng)物誤食含有黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的谷物飼料后，在其體內(nèi)經(jīng)過羥基化作用衍生轉(zhuǎn)化成黃曲霉毒素M1[10]。這類毒素中以黃曲霉毒素B1毒性最大，且是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種[11]，被列為I類致癌物，廣泛存在于土壤和各級(jí)農(nóng)產(chǎn)品中，主要污染花生、玉米、小麥等糧食谷物，并通過食物鏈影響人們的身體健康[12]。李麗等[13]通過對(duì)全國各代表性區(qū)域種植的玉米進(jìn)行篩選，經(jīng)粉碎、混勻后制備了均勻性和穩(wěn)定性滿足要求的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值含量為（27±3）μg·kg-1，并獲批為國家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為我國糧食中黃曲霉毒素B1的檢測和鑒定提供計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性一直是研制過程的重點(diǎn)和難點(diǎn)。張磊[14]選擇以黃曲霉菌接種的花生替代天然污染的花生，為降低基體活性采用高溫高壓和γ射線輻照滅菌，為了提高黃曲霉毒素B1基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性采用了添加穩(wěn)定劑、雙層包裝、高抗性花生作為原料，同時(shí)通過將樣品粉碎至微米級(jí)以及添加乳化劑的方式以提高標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性，為后續(xù)基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備提供了一套完整的制備工藝流程。

當(dāng)前針對(duì)黃曲霉毒素的檢測方法和有證標(biāo)基體準(zhǔn)物質(zhì)主要集中在玉米、花生等作物中，而對(duì)于以這些作物為原料的飼料中黃曲霉毒素的檢測技術(shù)研究較少，也缺乏相應(yīng)的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。為彌補(bǔ)這一空白，趙天天等[15]以玉米為飼料原料，向其中添加黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后對(duì)樣品進(jìn)行干燥、輻照滅菌、分裝和真空包裝最終制得飼料中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)定值分別為（71.23±1.60）μg·kg-1、 （75.53±1.28）μg·kg-1、（74.87±1.79）μg·kg-1和（75.77±2.68）μg·kg-1。

黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2主要存在于糧食谷物中；黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素M2主要存在牛奶和相關(guān)乳制品中，其中黃曲霉毒素M1性質(zhì)穩(wěn)定，不僅耐高溫也耐酸堿，因此含有黃曲霉毒素M1的牛乳被用于制備嬰幼兒奶粉會(huì)導(dǎo)致奶粉中黃曲霉毒素M1含量不合格[16]。魏敏等[17]通過給牛喂養(yǎng)被霉菌污染的飼料方式，獲取含有黃曲霉毒素M1的牛奶乳品，制備了滿足檢測要求的乳粉中黃曲霉毒素M1基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值結(jié)果為（2.45±0.41）μg·kg-1，并獲批為國家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)保障我國乳品質(zhì)量具有重要意義。

2.4 伏馬毒素類基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀

伏馬毒素是一種霉菌毒素，主要是由輪狀鐮刀菌（Fusarium Verticilllioides）、串珠鐮刀菌（Fusarium Moniliforme）等在一定條件下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物，被列為2B級(jí)致癌物。目前，伏馬毒素已發(fā)現(xiàn)A、B、C和P四大類，伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3最為常見，其中伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）毒性最強(qiáng)，污染最多，廣泛存在于小麥、水稻、高粱以及玉米等糧食作物中。伏馬毒素具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在普通加工過程中其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)均能保持穩(wěn)定，因此伏馬毒素污染不僅影響糧食產(chǎn)量，還會(huì)通過食物鏈進(jìn)入人體，威脅健康[18]。孟佳佳等[19]通過將產(chǎn)毒鐮刀菌接種到玉米培養(yǎng)基中的方式，獲得了含有伏馬毒素B1和伏馬毒素B2的陽性基質(zhì)樣本，通過粉碎混勻，并采用空白玉米粉進(jìn)行逐級(jí)稀釋，成功制備了一批均勻性和穩(wěn)定性符合要求的玉米粉中伏馬毒素B1和伏馬毒素B2基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)定值分別為（1.07±0.09）mg·kg-1和（0.43±0.07）mg·kg-1，為我國谷物質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持與物質(zhì)保障。進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格昂貴、貨物周期長，為替代進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，填補(bǔ)國內(nèi)在玉米粉中伏馬毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的空白，牛欣寧等[20]通過將玉米樣品放置在伏馬毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)溶液中浸泡，經(jīng)過冷凍干燥制備成基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值為 （1475.56±169.98）μg·kg-1，可用于實(shí)驗(yàn)儀器校準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)過程質(zhì)量控制等。

2.5 嘔吐毒素類

嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇或脫氧瓜萎鐮菌醇，為鐮刀菌產(chǎn)生的有毒代謝物，在小麥、玉米甚至肉和奶制品中都有檢出[21]，長期攝入對(duì)血液和免疫系統(tǒng)均會(huì)產(chǎn)生影響[22-24]。 針對(duì)目前國內(nèi)外谷物中檢出頻率最多、污染最普遍的真菌霉素——嘔吐毒素，許嬌嬌等[25]在國內(nèi)首次以天然污染的食品面粉為候選物，經(jīng)均質(zhì)、分裝、滅菌、定值，為保證存放和運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性，使用Co-60γ射線進(jìn)行照射滅菌，成功研制了均勻性和穩(wěn)定性符合要求、定值為（2366±187）μg·kg-1的嘔吐毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為后續(xù)國內(nèi)開展食品中嘔吐毒素的監(jiān)測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性提供保障。

2.6 交鏈孢霉毒素

交鏈孢霉屬（Alternaria）是一類廣泛分布于土壤和農(nóng)產(chǎn)品中的真菌，農(nóng)作物感染后會(huì)發(fā)生腐敗。交鏈孢霉代謝產(chǎn)生的毒素統(tǒng)稱為交鏈孢霉毒素（Alternaria Toxins），其中以細(xì)交鏈孢菌酮酸（Tenuazonic Acid，TeA）和騰毒素（Tentoxin，TEN）污染最為常見。謝繼安等[26]以天然污染交鏈孢霉毒素的小麥樣籽粒為基體，通過對(duì)全國各產(chǎn)區(qū)代表性樣品進(jìn)行篩查，分別選取了來自安徽的天然污染低濃度和山西省的天然污染高濃度細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素小麥籽粒樣品作為候選物，通過磨粉、過篩、混勻、輻照滅菌等制備了兩種不同濃度的小麥粉中細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均獲批國家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同時(shí)也是國際上唯一的以天然污染細(xì)交鏈孢菌酮酸和騰毒素的小麥粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

2.7 赤潮毒素

赤潮毒素是由海洋中存在的赤潮藻類產(chǎn)生的具有生物活性的物質(zhì)，具有難防治、反應(yīng)快、毒性大等特征。目前已知的有十幾種，根據(jù)中毒癥狀和傳遞媒介類型主要可以分為神經(jīng)性、麻痹性、記憶缺失性和腹瀉性貝毒以及西加魚毒。其中麻痹性貝毒是分布最廣、危害最大的一類赤潮毒素，也是最早被發(fā)現(xiàn)的貝毒，是一種由鞭毛蟲和藍(lán)細(xì)菌引起的強(qiáng)效神經(jīng)毒素[27]。腹瀉性貝類毒素是海洋廣泛分布的一些引發(fā)赤潮的生物分泌的一類聚醚或大環(huán)內(nèi)酯化合物，常見的如軟海綿酸（Okadaic Acid，OA），該類毒素中毒癥狀以嘔吐和腹瀉為主。近年來，有毒有害赤潮在我國近海海域發(fā)生規(guī)模和次數(shù)均呈不斷增加的趨勢(shì)，阻礙了水產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展。

由于腹瀉性和麻痹性貝毒化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，難以通過化學(xué)合成方式獲取。桂文鋒[28]通過向扇貝投喂塔瑪亞歷山大藻和利瑪原甲藻，通過儀器持續(xù)檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟是扇貝毒素積累的主要部位，用塔瑪亞歷山大藻和利瑪原甲藻分別喂食到7 d和4 d后體內(nèi)毒素超過安全限量值，將貝肉和內(nèi)臟取出，勻漿，冷凍干燥后制備成均勻性和穩(wěn)定性符合要求含麻痹性貝毒和腹瀉性貝毒的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。HIGMAN等[29]也通過向貝類喂食亞歷山大藻，確定了實(shí)驗(yàn)室條件制備麻痹類貝毒基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可行性。為保證腹瀉性貝類毒素檢測結(jié)果的可靠性，傅博強(qiáng)等[30]采用空白基質(zhì)加標(biāo)法，以紫貽貝為原料，將軟海綿酸溶液添加到肉漿中，冷凍干燥后粉碎、混勻制備成均勻性和穩(wěn)定性符合要求的軟海綿酸基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)定值為（2.96±0.50）μg·g-1；王秋艷等[31]則采用自然基體污染法經(jīng)測定腹瀉性貝類毒素陽性的貽貝，經(jīng)冷凍干燥等工藝制備基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值為 （8.83±0.60）μg·g-1，該方法原料成本更低，可以用于腹瀉性貝類毒素檢測過程質(zhì)量控制等。WANG等[32]通過對(duì)貝毒產(chǎn)生條件，如時(shí)間、溫度、營養(yǎng)物和鹽濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)過35 d培養(yǎng)后收獲了含有鰭藻毒素-1和軟海綿酸的干藻粉，經(jīng)定值分別為21.6 mg·g-1和15.2 mg·g-1，可為后續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中相關(guān)毒素的監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

2.8 河豚毒素

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）最早由日本學(xué)者從河豚魚的卵巢中發(fā)現(xiàn)，是一種廣泛存在于某些脊椎和無脊椎動(dòng)物體內(nèi)的一種非蛋白質(zhì)、高活性的神經(jīng)毒素，可麻痹人體神經(jīng)中樞和血管中樞，危及生命[33]。目前，河豚毒素的檢測主要采用純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為質(zhì)量控制和添加回收[34]。王偉等[35]首次報(bào)道以野生河鲀魚的精巢、卵巢、肝臟以及肌肉組織為基體，通過正己烷脫脂分離處理，采用兩次冷凍干燥程序制備了均勻性和穩(wěn)定性符合要求的河豚毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值結(jié)果為（5.20±0.03）mg·kg-1，可用于對(duì)水產(chǎn)品中河豚毒素的檢測過程進(jìn)行質(zhì)量控制。

3 結(jié)語

食品中生物毒素是導(dǎo)致食品安全問題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于食品中生物毒素分析檢測的可靠性具有非常重要的意義，但生物毒素在生物體內(nèi)的含量普遍較低、污染部位不均勻、難以獲取特定目標(biāo)含量的陽性樣品是阻礙生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的關(guān)鍵點(diǎn)。我國生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無論從種類還是數(shù)量上都無法滿足市場需求，主要集中在真菌毒素和海洋生物毒素類基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)上，存在大量的空白，應(yīng)該擴(kuò)大毒素和基質(zhì)種類的范圍，提高基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制水平，以滿足我國科研和檢測市場需求，提高檢測結(jié)果的可靠性。