王真禎

（南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建南平 353000）

食品微生物檢驗主要是開展樣品的采集、制備、檢驗等工作，通過檢驗分析出食品中的微生物或毒素，將其作為判定食品安全性的重要指標(biāo)。食品檢驗樣品的采集與制備工作是微生物檢驗的重要前提，對于檢驗報告的出具以及檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義，因此做好檢驗樣品的采集與制備工作尤為重要。

1 食品微生物檢驗概述

食品微生物檢驗可以有效防范人畜共患病的發(fā)生，是衡量食品是否符合食用標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)之一，也是判定食品能否食用的科學(xué)依據(jù)。通過食品微生物檢驗，可判斷出食品的真實衛(wèi)生情況，能對食品的被污染程度做出合理的推斷。因此，嚴(yán)格控制食品微生物檢測各個環(huán)節(jié)，能夠顯著減少食品安全問題，對食品安全、人類健康、經(jīng)濟發(fā)展起著重要 作用。

2 食品微生物檢驗樣品的采集工作要點

對食品微生物檢驗樣品進行采集，需要保證采樣的隨機性與代表性，通過微生物檢驗分析產(chǎn)品質(zhì)量是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。因此，在樣品采集工作中，要選擇具有代表性的樣品，且取樣器件必須根據(jù)產(chǎn)品的類型、狀態(tài)予以確定。

2.1 明確樣品采集要求

在開展樣品采集工作前，需要明確采集要求，提前做好準(zhǔn)備，主要包括以下7點。①在提取樣品前需要先確認(rèn)貨和證完全符合。②取樣過程中應(yīng)避免水、空氣、光照等不良因素的影響，防止樣品受到污染。③樣品采集過程中使用的注射器、剪刀、采血管等均需經(jīng)過高溫殺菌處理，確保采樣過程中無任何污染。④通常采取隨機抽取方式采樣，如果對樣品存在微生物污染情況高度懷疑，可進行集中采集。⑤樣品采集前后，在樣品容器上粘貼標(biāo)簽，標(biāo)明樣品的來源、名稱、采樣時間和數(shù)量等詳細(xì)信息[1]。⑥樣品采集是微生物檢驗工作中不可缺失的步驟，實驗室必須提前保存記錄資料和程序操作，如樣品采集程序和取樣工作人員相關(guān)信息，甚至還要涵蓋設(shè)備、環(huán)境、采集地等信息。⑦完善樣品采集計劃，通過實施計劃促使樣品替代整個批次的產(chǎn)品，確保采集抽取機會一致。

2.2 科學(xué)確定采樣點

在食品微生物檢驗樣品采集過程中，采樣點的確定會直接影響樣品采集質(zhì)量，因此對于采樣點的選擇要覆蓋食品生產(chǎn)到銷售的全過程，從而能夠通過檢驗結(jié)果判定哪個環(huán)節(jié)導(dǎo)致食品出現(xiàn)微生物污染[2]。從當(dāng)前采樣工作情況來看，樣品采集點主要有如下3個。①食品原材料處。對食品原材料進行采樣，常見的有原料、水、添加劑等。②食品生產(chǎn)線。對食品生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵節(jié)點開展樣品采集工作，如半成品或原胚等，主要為了掌握食品生產(chǎn)中微生物的變化情況；③食品倉儲。主要對食品存儲、運輸環(huán)節(jié)中的微生物變化進行采樣檢驗。通過科學(xué)確定這3個采樣點，開展針對性微生物樣品采集工作，能更精準(zhǔn)了解不同環(huán)節(jié)下的食品狀況，判斷引發(fā)微生物污染的具體環(huán)節(jié)。

2.3 合理應(yīng)用采樣方法

樣品采集方法需要結(jié)合食品類型、狀態(tài)、有無外包裝等因素確定合理的采樣方法。從食品包裝來分，可分為以下兩種情況。①包裝食品采樣。針對開袋即食型小包裝食品，為避免交叉污染，要盡量取原包裝，在檢驗之前不能開封；針對大包裝的液體食品，在采樣之前先混合，再用滅菌棒進行混合均質(zhì)；針對大容器包裝的冷凍食品，則要對多部位實施無菌采樣，同時保證始終處于冷凍狀態(tài)。包裝食品的采樣要保證同一個批次和數(shù)量適中，且符合微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)。②非包裝食品采樣。此類食品涵蓋現(xiàn)場制作的散裝食品，具有一定特殊性，采樣時要保證及時性與針對性。具體來講要從多個部位實施無菌采樣，同時將各個樣品裝入不同容器中。針對散裝食品的采樣要遵循“三層五點”原則，即對表層、中層、下層的5個點進行采樣。對生產(chǎn)過程中的食品要進行檢驗批次的合理劃分，分別進行取樣[3]。從食品狀態(tài)來分，可分為以下兩種情況。①液態(tài)食品采樣。液態(tài)食品的采樣比較簡單，通常采樣時只需進行無菌混合，可連續(xù)或間歇攪拌，待勻質(zhì)后采樣即可。②固態(tài)食品采樣。魚肉類食品要進行內(nèi)外兩層采樣，其中內(nèi)層采樣要避免與表層出現(xiàn)交叉污染。對鮮肉要用滅菌工具采樣，冷凍食品無需解凍，直接用滅菌電鉆深層采樣。

2.4 包裝密封樣品

食品微生物檢驗樣品采集完成后，要對其進行完全密封的包裝處理，必須從采樣點開始進行封裝，直至送進無菌實驗室，且途中要盡可能避免無關(guān)人員與樣品接觸，提高樣品檢驗結(jié)果的可靠性。通常會用專門的粘膠對樣品進行密封包裝，放置在特定容器中保存好，做好詳細(xì)信息記錄。

3 食品微生物檢驗樣品的制備工作要點

樣品制備是食品微生物檢驗的重要工作，是獲得準(zhǔn)確的檢驗結(jié)果的基礎(chǔ)。因此，制備處理過程一定要嚴(yán)格遵守制備要求和實驗室無菌操作標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 液體樣品制備方法

對于液體樣品可充分搖動液體，使樣品中的微生物分布均勻，然后用滅菌吸管提取25 mL液體樣品，與225 mL蒸餾水或生理鹽水混合，形成1∶10的樣品稀釋液。需要注意的是，吸管伸入樣品的深度不能大于2.5 cm。如果樣品已開瓶或開罐，必須做好表面的消毒工作，嚴(yán)格按照無菌操作要求進行操作。對于含有CO2的液體飲料先將樣品液體倒進已經(jīng)殺菌完成的小瓶中，瓶口用滅菌紗布蓋住，輕微搖晃，等沒有氣體產(chǎn)生后再開展檢驗工作。酸性食品需用10%滅菌的NaCO3調(diào)節(jié)pH值至中性后才能開展檢驗。

3.2 半固體樣品制備方法

樣品無法用吸管直接吸取，可用滅菌容器稱取樣品25 g，加入225 mL 45 ℃的滅菌生理鹽水或蒸餾水中，此類樣品溶化后必須第一時間檢驗。從樣品稀釋到接種，切記不能超過15 min。

3.3 固體食品樣品制備方法

固體食品的處理過程比較復(fù)雜，具體處理方法有如下4類。①搗碎均質(zhì)法。將100 g或以上的樣品搗碎并混合均勻，從樣品中稱取25 g投入裝有225 mL 稀釋液的無菌均質(zhì)中，勻速混合1 min。此方法對大多數(shù)食品樣品有效。②剪碎振搖法。將100 g或以上的樣品剪碎并混合均勻，從樣品中稱取25 g進一步剪碎，放入帶有225 mL稀釋液和一定量玻璃珠（直徑為 5mm左右）的稀釋容器中，將瓶蓋封住，快速振搖60次。③研磨法。將100 g以上的樣品剪碎并混勻，稱取25 g投入無菌缽中進行充分研磨，研磨后放入帶有225 mL無菌稀釋液的稀釋瓶中，充分搖勻。④整粒振搖法。有自然保護膜的顆粒狀樣品，可直接稱取25 g整粒樣品投入無菌稀釋瓶中，重復(fù)上述振搖操作[4]。

3.4 特殊樣品的制備方法

樣品制備對食品微生物檢驗的結(jié)果精準(zhǔn)度有直接影響，由于一些食品本身的物化表現(xiàn)、對微生物的抑制作用、酸堿性等存在特殊性，因此對于食品微生物檢驗樣品的制備方法要根據(jù)其特點進行操作。①對于酸性或堿性的樣品，先將稀釋緩沖樣液的酸堿值調(diào)成中性。②對于大蒜、洋蔥等高抑制物質(zhì)或腌漬食品、酸堿性食品等，可采取緩沖蛋白胨水或其他稀釋液。③對于可可粉、奶粉等樣品，可適當(dāng)?shù)卣{(diào)整溫度和時間。④對于高脂肪樣品，可根據(jù)脂肪水平，在稀釋液中加入適量的聚山梨醇酯80，以促進乳化。⑤對于冷凍樣品，置于實驗室18～27 ℃ 溫度下，最多不超過3 h，在2 ℃左右不超過24 h。

3.5 樣品制備運輸

食品微生物檢驗樣品不能存放太久，且不同食品樣品對環(huán)境的要求也有顯著區(qū)別，因此在對樣品進行制備的過程中，需要結(jié)合現(xiàn)實情況對環(huán)境合理把控。例如，若樣品容易變質(zhì)，工作人員需將其放置在干燥環(huán)境中，同時避免陽光直射，溫度最好控制在-4～0 ℃，且盡快進行檢驗；若是貝類食品，從樣品采集、運輸、制備，再到最后的檢驗工作環(huán)節(jié)，整個過程用時不能超過6 h；若是干制食品，工作人員要用塑料袋進行密封保存，防止與空氣中的水分接觸，這類食品應(yīng)當(dāng)在7 d內(nèi)完成檢驗[5]。

4 樣品中微生物的檢驗方法

食品微生物檢驗方法多種多樣，不同被檢樣品適用于不同的方法原理，通過對不同的檢驗方法進行深刻了解，能夠為精準(zhǔn)檢驗出食品微生物夯實基礎(chǔ)。微生物檢驗方法有以下幾種。①抗體檢驗。此方法應(yīng)用較為廣泛，在大量的抗體檢驗方法中，最常見且應(yīng)用最便捷的是酶聯(lián)免疫吸附法。它主要是利用了酶聯(lián)免疫吸附方法對金黃色葡萄球菌的高敏感性，因此在金黃葡萄球菌這一微生物的檢驗中得到大量應(yīng)用。②免疫技術(shù)檢驗。該檢驗方法主要利用了抗原、抗體之間的特定結(jié)合反應(yīng)，借助病原體的催化作用生成大量免疫球蛋白，實現(xiàn)對食品微生物的檢測。該方法對肉毒梭菌、彎曲桿菌等病原菌的檢測有著良好效果。結(jié)合工作經(jīng)驗來看，免疫學(xué)技術(shù)法有精準(zhǔn)度高、操作便捷、無需分離樣品等優(yōu)點，但同時也存在假陽性過多、靈敏度低等不足，因此在選擇此檢驗方法時，需要根據(jù)實際情況合理確定。③電阻電導(dǎo)測定法。該方法主要是基于溶液導(dǎo)電率進行測定，能夠有效檢驗食品微生物的含量，利用蛋白質(zhì)、糖類等大分子物質(zhì)與氨基酸等小分子物質(zhì)存在導(dǎo)電度差異的特性，合理計算出微生物含量。④快速酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物檢測法。其原理是利用細(xì)菌的高度繁殖過程產(chǎn)生的霉菌與指示劑反應(yīng)測定微生物的數(shù)量。⑤快速檢驗法。此檢驗方法大部分已經(jīng)商品化，常見的有染色成像計數(shù)法和ATP生物發(fā)光法。染色成像計數(shù)，即對細(xì)胞染色，測定樣品中的活菌數(shù)量，主要用到紫外線顯微鏡與熒光過濾膜，活細(xì)胞與死細(xì)胞分別呈現(xiàn)熒光橙和熒光綠。此方法的檢測時長約0.5 h，如果樣品中的細(xì)菌數(shù)量太少，則要適量增加細(xì)菌數(shù)量。ATP生物發(fā)光法的原理是混合熒光素與ATP，將微生物的ATP轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庑盘?，再根?jù)熒光值判斷微生物數(shù)量。此檢測方法需 1.0 h左右，且如果微生物數(shù)量偏少，還要適量增加微生物。從效果來看，兩種方法只能對微生物數(shù)量進行檢測，無法分辨微生物種類。⑥分子生物法。該方法最常用的是核酸探針方法（即通常所說的基因探針技術(shù)）以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。其中，核酸探針方法主要利用了基因最小分子脫氧核糖苷酸分子結(jié)構(gòu)中堿基的特異性配對，用對應(yīng)細(xì)菌的已知DNA序列實施同位素標(biāo)記操作，添加至解旋過后的待測DNA樣品中，根據(jù)所得雙鏈DNA數(shù)量來判斷菌種數(shù)量和種類，很好地解決了微生物檢測的特異性以及敏感性問題[6]。

5 微生物檢驗過程中存在的不足及完善對策

在樣品采集與制備過程中，存在樣品存放的環(huán)境和儀器設(shè)備監(jiān)管不到位，檢驗樣品的采集不具有代表性，樣品制備的設(shè)備不夠完善，食品微生物采集、制備操作不夠規(guī)范等問題。為了改善這些問題，微生物檢驗操作需要注意以下要點。

5.1 培養(yǎng)基質(zhì)量控制

加強樣品存放和檢驗過程中的環(huán)境質(zhì)量控制，進一步完善管理制度與規(guī)范實驗流程，從而實現(xiàn)實驗室的規(guī)范化、科學(xué)化管理，以高質(zhì)量檢驗活動提高實驗室的檢驗水平。其中，需要重點關(guān)注培養(yǎng)基的質(zhì)量控制，培養(yǎng)基無法單獨開展技術(shù)驗證，而需要依據(jù)微生物實驗的詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)展開評估，因此檢驗單位必須參照《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)開展建設(shè)實驗室的工作，且在日常檢驗中嚴(yán)格遵守《微生物檢測理解與實施》中關(guān)于培養(yǎng)基的管理細(xì)則。對培養(yǎng)基的檢測可選用干熱加壓滅菌法，也可選用濕熱加壓滅菌法。

5.2 重視實驗室儀器設(shè)備的日常管理

在微生物檢驗中，檢測設(shè)備最為關(guān)鍵，會對檢驗結(jié)果的精準(zhǔn)性造成直接影響。例如，在檢驗易揮發(fā)的樣品時，可采用干冰冷凍粉碎機對樣品進行冷凍粉碎。無菌實驗室的換氣系統(tǒng)必須達(dá)到潔凈廠房的等級要求，實驗室內(nèi)部的墻壁、底板、天花板連接處必須帶有一定弧度，地面進行防滑處理，保證儀器設(shè)備、桌椅設(shè)施的整潔度，避免實驗人員和儀器設(shè)備、樣品等出現(xiàn)碰撞受損的情況。實驗室內(nèi)有大量的設(shè)備設(shè)施，如水浴箱、培養(yǎng)箱、滅菌高壓鍋和滅菌箱等，都需要做好日常維護保養(yǎng)工作，定期進行清潔與消毒，確保設(shè)備的性能完好。每一次維護保養(yǎng)都需要進行調(diào)試記錄，并保存好相關(guān) 資料。

5.3 加強實驗人員的培訓(xùn)和管理

實驗人員是實驗室作業(yè)中容易出現(xiàn)不規(guī)范操作的主要因素，為了規(guī)避實驗人員采用不合理的操作方法，或是因為重復(fù)實驗多次而對無菌操作觀念有所忽視，則一定要提高實驗人員的能力和思想意識。食品微生物的檢驗工作具有專業(yè)性、技術(shù)性特點，對從業(yè)者的專業(yè)素養(yǎng)要求非常高，可在單位內(nèi)部定期開展技術(shù)人員培訓(xùn)工作，保證每一位實驗人員均具備相應(yīng)資質(zhì)。對實驗人員的操作規(guī)范進行嚴(yán)格規(guī)定，保證對樣品的收集、制備及實驗操作均符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。此外，非實驗人員非必要不得進入無菌實驗室，必須進入時則要嚴(yán)格按照規(guī)定穿戴個體防護品。檢驗單位應(yīng)當(dāng)在無菌實驗室外設(shè)置醒目的警示標(biāo)志，用以增強實驗人員的安全防護意識。

5.4 加強無菌室管理

必須保證微生物檢驗作業(yè)在無菌環(huán)境中進行，確保所有設(shè)備設(shè)施、作業(yè)條件均達(dá)到檢驗標(biāo)準(zhǔn)，門窗、走廊、樣品區(qū)、管理區(qū)、清潔間等均需符合《實驗室生物安全通用要求》規(guī)定的防護等級標(biāo)準(zhǔn)，對無菌室進行日常消毒，用紫外線燈進行照射滅菌，保證室內(nèi)干燥且清潔。在開展檢驗工作之前，應(yīng)當(dāng)選擇臭氧消毒法對實驗室內(nèi)部空氣中的微生物進行全面消殺，將無菌室封閉后，注入臭氧，濃度控制在 20 mg·m-3左右，靜置消殺35 min最優(yōu)，再進行臭氧排放操作，濃度降至0.2 mg·m-3，隨后開展食品微生物的室內(nèi)檢驗工作。

6 結(jié)語

綜上，食品微生物檢驗作為保障食品安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，且微生物污染有著廣泛性、隨機性的特點，因此對檢驗工作要求較高。在食品微生物檢驗中，樣品的采集與制備屬于必要工作，其規(guī)范程度直接關(guān)系到檢驗結(jié)果的精準(zhǔn)度，因此必須保證全程無菌操作，避免樣品被污染。樣品采集需保證代表性、時效性、完整性，樣品制備需要在嚴(yán)格條件下進行，防止出現(xiàn)污染和變質(zhì)。樣品采集與制備工作的規(guī)范性和精準(zhǔn)性是確保檢驗結(jié)果客觀性、公正性的前提，可為實驗結(jié)果提供保障，提升食品檢驗單位的權(quán)威性和專業(yè)性，為廣大消費者的食品安全保駕 護航。