王亞琴

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058）

0 引言

FV3000 是一款高速、高靈敏度、高精確性，可實(shí)現(xiàn)從宏觀到微觀全面觀察成像的全新一代活細(xì)胞成像工具，是目前市場(chǎng)上應(yīng)用較為普遍的一款激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM），也是浙江大學(xué)水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱水稻重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）新引進(jìn)的一臺(tái)大型設(shè)備。由于它具有超分辨率成像和層析成像能力，相比一般顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡具有不可比擬的優(yōu)越性，已經(jīng)成為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究領(lǐng)域中的大型綜合儀器。

隨著高校開(kāi)展前沿學(xué)科、交叉學(xué)科、學(xué)科群的建設(shè)，對(duì)儀器設(shè)備的使用及管理提出了更多的需求。大型設(shè)備的投入及運(yùn)行對(duì)培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力，提高科研水平起著重要作用，同時(shí)也是衡量學(xué)院學(xué)科建設(shè)和科研水平的重要指標(biāo)[1]。LSCM 作為大型儀器的一員，其本身價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、耗材消耗較大，使用及維護(hù)成本較高。為貫徹落實(shí)《國(guó)務(wù)院關(guān)于國(guó)家重大科研基礎(chǔ)設(shè)施和大型科研儀器向社會(huì)開(kāi)放的意見(jiàn)》（國(guó)發(fā)〔2014〕70 號(hào)）精神，優(yōu)化資源配置，釋放服務(wù)潛能，提高使用效率[2]，水稻重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室依托浙江省科技創(chuàng)新云服務(wù)平臺(tái)，國(guó)有資產(chǎn)管理云服務(wù)平臺(tái)，將FV3000 主動(dòng)對(duì)接國(guó)家平臺(tái)，并配置專業(yè)技術(shù)人員操作管理，實(shí)行開(kāi)放共享。本文結(jié)合多年使用和管理經(jīng)驗(yàn)，對(duì)FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡的使用及規(guī)范管理進(jìn)行總結(jié)，以期為相關(guān)的管理人員和使用者提供借鑒參考。

1 激光掃描共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)介

共聚焦顯微術(shù)（Confocal Microscopy）概念是20 世紀(jì)50 年代中期，由哈佛大學(xué)的Marvin Minsky 博士提出，并于1957 年申請(qǐng)技術(shù)專利，隨后多名學(xué)者對(duì)共焦成像開(kāi)展了更為細(xì)致的研究，但受限于激光及計(jì)算機(jī)等技術(shù)發(fā)展水平的制約，直到20 世紀(jì)70 年代才研制出第一臺(tái)真正實(shí)用的共聚焦顯微鏡，80 年代中期才出現(xiàn)第一臺(tái)激光掃描共聚焦顯微鏡。

LSCM 是一種典型的高技術(shù)光電儀器，它主要是把熒光顯微鏡、激光掃描及計(jì)算機(jī)圖像處理等裝置組合在一起，通過(guò)有效阻止非焦平面信息的干擾，提高掃描圖像的分辨率和對(duì)比度，最終獲得比較清晰的圖像。同時(shí)，通過(guò)連續(xù)切片操作，三維圖像的掃描和重構(gòu)，獲得樣品的整體信息。另外，LSCM 可以定量分析細(xì)胞內(nèi)的特定物質(zhì)和信號(hào)，同時(shí)定位不同的成分[3]。作為一種技術(shù)含量較高的研究工具，LSCM 可以對(duì)樣品進(jìn)行定性、定量、定位和定時(shí)研究，由于這些強(qiáng)大的技術(shù)功能，目前，LSCM 在分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、病理學(xué)、食品科學(xué)、材料科學(xué)等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4]。

2 FV3000 的主要用途

FV3000 具有完成活細(xì)胞和組織成像所需的高靈敏度和高速度，可以為細(xì)胞、組織和較小的生物體完成2D 到6D（x，y，z，t，λ，p）的從宏觀到微觀的成像操作，同時(shí)具備直觀且可以調(diào)整的用戶界面，支持從圖像采集到圖像處理和分析的整個(gè)工作流程，其主要用途有：

（1）用于組織切片、生物材料熒光標(biāo)記、活細(xì)胞熒光標(biāo)記的高分辨率成像，同時(shí)得到清晰銳利的多層Z 平面結(jié)構(gòu)的光學(xué)切片，用于構(gòu)建標(biāo)本三維實(shí)體結(jié)構(gòu)，并做形態(tài)分析和三維空間測(cè)量。

（2）用于活細(xì)胞生物分子、細(xì)胞器或離子等生物物質(zhì)的定性、定量、定時(shí)和定位分布檢測(cè)等，適合用于快速變化樣品，捕捉變化過(guò)程信號(hào)，可監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈉、鎂、鈣離子濃度變化，捕捉鈣火花，并且縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低光毒性。

（3）用于獲取圖像的時(shí)間信息，研究熒光標(biāo)本隨時(shí)間濃度、強(qiáng)度、擴(kuò)散速度、空間移動(dòng)等變化的數(shù)據(jù)信息，進(jìn)行相關(guān)動(dòng)力學(xué)研究。

（4）可對(duì)樣本進(jìn)行光譜掃描，獲取熒光標(biāo)本光譜信息，研究熒光材料光譜特性、獲取未知染料發(fā)射光譜圖。

3 FV3000 的組成和技術(shù)參數(shù)

3.1 激光照射系統(tǒng)

激光照射系統(tǒng)包括紫色固體激光器：405 nm；青色固體激光器：445 nm；藍(lán)色固體激光器：488 nm；藍(lán)綠色固體激光器：514 nm；綠色固體激光器：561 nm；紅色固體激光器：640 nm。開(kāi)放式和一體化的激光耦合器，通過(guò)單獨(dú)一根高透過(guò)率光纖導(dǎo)出，近紫外到紅光區(qū)域一體化色差校正，無(wú)須調(diào)節(jié)光纖中心。

3.2 共聚焦掃描檢測(cè)系統(tǒng)

共聚焦掃描檢測(cè)系統(tǒng)包括4 個(gè)獨(dú)立的光譜型熒光檢測(cè)通道和熒光檢測(cè)器；1 個(gè)透射DIC 檢測(cè)通道，所有通道可以獨(dú)立設(shè)置不同激光；2 個(gè)大靶面制冷型超高靈敏檢測(cè)器。

3.3 全自動(dòng)倒置顯微鏡系統(tǒng)

全自動(dòng)倒置顯微鏡系統(tǒng)包括8 孔電動(dòng)激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤，包含窄帶帶通紫外激發(fā)（UV）、窄帶帶通藍(lán)光激發(fā)（B）和寬帶綠光激發(fā)（G）3種；8 孔電動(dòng)萬(wàn)能聚光鏡，可適用物鏡1.25～100 倍；130 W 超高壓汞燈，無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)，齊焦距離為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)45 mm。

3.4 計(jì)算機(jī)工作站

計(jì)算機(jī)工作站配置有CPU Intel Xeon W-2133 3.6 GHz六核CPU，Windows 10 Professional 64 bit 操作系統(tǒng)。

3.5 圖像采集及分析軟件

圖像采集及分析軟件包含圖像采集和系統(tǒng)自動(dòng)控制，光路全電動(dòng)控制切換，三維/四維可視圖象重建功能，具有Alphablend、Isosurface、MIP 等多種三維渲染模式。

4 FV3000 顯微鏡室的環(huán)境要求

4.1 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫濕度盡量保持恒定

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的環(huán)境溫度應(yīng)保持在20～24 ℃，濕度40%～60%，室內(nèi)遮光。需要特別注意的是，在比較潮濕的地區(qū)要配備除濕器。

4.2 實(shí)驗(yàn)室要配備防震設(shè)備

激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)盡量放置在一樓，同時(shí)將設(shè)備安裝在具有防振功能的專用臺(tái)子上，防止因較高樓層的振動(dòng)影響儀器的使用。

4.3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)要保持干凈整潔

定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清理，保持室內(nèi)干凈整潔，實(shí)驗(yàn)者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)要穿白大褂及鞋套，使用完畢后，要及時(shí)做好臺(tái)面、物鏡、目鏡等容易被污染的光學(xué)部件的清潔工作。

5 FV3000 管理人員的要求及職責(zé)

5.1 管理人員要求

由于激光掃描共聚焦顯微鏡功能多樣、硬件和軟件配置都比較復(fù)雜，操作步驟又因樣品和成像要求有所不同，使用時(shí)熒光倒置顯微鏡和電腦成像軟件之間需要不斷地切換，同時(shí)圖像采集時(shí)參數(shù)設(shè)置較多[5-9]，操作不當(dāng)會(huì)對(duì)儀器造成較大的損傷，為此需要配備具有一定專業(yè)技術(shù)水平、責(zé)任心強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員或教師擔(dān)任操作管理人員，且須經(jīng)過(guò)培訓(xùn)和考核方可上機(jī)操作。為了提高管理人員的專業(yè)素質(zhì)和管理能力，管理人員應(yīng)定期參加設(shè)備相關(guān)的操作技能培訓(xùn)，積極參加LSCM 研究領(lǐng)域的會(huì)議及論壇，以便和專業(yè)人士進(jìn)行技術(shù)學(xué)習(xí)和交流，同時(shí)及時(shí)收集和歸納整理用戶的反饋信息，總結(jié)儀器的使用情況并及時(shí)作出改進(jìn)。

5.2 管理人員職責(zé)

激光掃描共聚焦顯微鏡儀器功能強(qiáng)大，應(yīng)用廣泛，如何更好地使用儀器，保證其正常安全運(yùn)行的同時(shí)再開(kāi)發(fā)其他功能和應(yīng)用，技術(shù)人員起到了關(guān)鍵作用。其主要職責(zé)有：

（1）制定并執(zhí)行FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡的操作規(guī)程，認(rèn)真整理好設(shè)備的使用、維護(hù)和維修記錄，并及時(shí)登錄開(kāi)放共享網(wǎng)絡(luò)管理平臺(tái)，填報(bào)儀器設(shè)備的管理及使用狀況。

（2）在熟練使用FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡已有功能的基礎(chǔ)上，合理開(kāi)發(fā)新功能，使儀器設(shè)備發(fā)揮最大收益。

（3）按規(guī)定對(duì)FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行維護(hù)、維修、校驗(yàn)標(biāo)定及檔案管理工作。

（4）負(fù)責(zé)對(duì)校內(nèi)和校外的服務(wù)及對(duì)使用人員的操作培訓(xùn)工作。

6 FV3000 網(wǎng)絡(luò)預(yù)約使用及管理

大型儀器設(shè)備共享管理系統(tǒng)能夠結(jié)合互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)，有效整合設(shè)備資源，打破科研單位界限，是儀器開(kāi)放共享共用、提高儀器利用率的有效途徑[10]。激光掃描共聚焦顯微鏡應(yīng)用非常廣泛，藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生命科學(xué)等學(xué)科都會(huì)用到此類儀器。為了促進(jìn)各學(xué)院學(xué)科的資源共享，提高大儀設(shè)備使用率，F(xiàn)V3000 已加入浙江大學(xué)大型儀器共享平臺(tái)，實(shí)行網(wǎng)絡(luò)化管理。校內(nèi)外的研究人員可以登錄浙江大學(xué)大型儀器共享管理平臺(tái)（http：//equip.zju.edu.cn/xin/）查詢到儀器型號(hào)、技術(shù)指標(biāo)、應(yīng)用范圍、管理員、收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)等信息，實(shí)行網(wǎng)絡(luò)預(yù)約。操作人員可根據(jù)用戶需求，對(duì)樣本的預(yù)選、圖像采集、顯微圖像分析等系列環(huán)節(jié)進(jìn)行技術(shù)服務(wù)。網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)上儀器使用預(yù)約一覽表可以直觀地查看儀器的預(yù)約使用情況，可以極大地解決儀器空置、使用時(shí)間沖突、使用率低等問(wèn)題[11]。

7 FV3000 開(kāi)放共享及有償服務(wù)

FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡價(jià)格昂貴，運(yùn)行成本和維修保養(yǎng)的費(fèi)用都很高，且設(shè)備需要定期更換燈泡、矯正光路等，后期維修費(fèi)用是否充足，直接影響設(shè)備的使用壽命。為保障大型儀器設(shè)備的良好運(yùn)行，提高大型儀器設(shè)備的使用效益，規(guī)范大型儀器功能開(kāi)發(fā)與維修保養(yǎng)服務(wù)，促進(jìn)開(kāi)放共享，更好地為教學(xué)、科研和學(xué)科建設(shè)服務(wù)，目前FV3000 已納入國(guó)家大型設(shè)備平臺(tái)開(kāi)放共享管理系統(tǒng)，在滿足校內(nèi)教學(xué)科研基本需求的前提下，主動(dòng)為社會(huì)提供分析測(cè)試、協(xié)作咨詢、培訓(xùn)指導(dǎo)等共享服務(wù)工作，有效整合資源，促進(jìn)社會(huì)共享。同時(shí)，F(xiàn)V3000 設(shè)備連接浙江大學(xué)有償服務(wù)系統(tǒng)，根據(jù)有關(guān)文件制定收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)學(xué)校實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備管理處審核通過(guò)后，根據(jù)審定的標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展大型設(shè)備后有償服務(wù)，用戶可通過(guò)線上、線下兩種形式繳納測(cè)試費(fèi)用。有償服務(wù)收入全部納入學(xué)校統(tǒng)一財(cái)務(wù)賬戶管理，集中核算，同時(shí)根據(jù)服務(wù)收入設(shè)立大型設(shè)備專項(xiàng)維修基金，用于儀器日常運(yùn)行及維修。

近年來(lái)，國(guó)家加大對(duì)科研的投入，促進(jìn)高精尖儀器技術(shù)快速發(fā)展，科研工作者對(duì)共聚焦顯微鏡成像實(shí)驗(yàn)需求量在不斷攀升，使得共聚焦掃描顯微鏡的數(shù)量和功能都在快速增長(zhǎng)，如何管好、用好貴重儀器設(shè)備，保證其在穩(wěn)定且高效運(yùn)行的同時(shí)發(fā)揮與其價(jià)值相匹配的功能，更好地為教學(xué)和科研工作服務(wù)，提高設(shè)備使用效益和資源共享率，已成為眾多高校乃至社會(huì)學(xué)術(shù)群體共同關(guān)注的問(wèn)題。水稻重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自購(gòu)置FV3000 共聚焦顯微鏡以來(lái)，已為15 個(gè)院內(nèi)外課題組的280 多位科研人員提供服務(wù)，年使用機(jī)時(shí)1800 h 左右，支撐國(guó)家級(jí)重大重點(diǎn)項(xiàng)目40 余項(xiàng)，發(fā)表高水平研究論文200 余篇，獲省部級(jí)以上獎(jiǎng)勵(lì)8 項(xiàng)，為學(xué)科建設(shè)及發(fā)展提供了強(qiáng)有力的保障。