許 炎，曹 禹，郝思靜，黃江平，王旭芳，吳 丹

（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200083；2.上海公安學(xué)院，上海201210；3.浙江中和司法鑒定中心，浙江 寧波 315300）

人類組織和體液的來源認(rèn)定一直是法醫(yī)物證學(xué)研究的熱點(diǎn)。來自犯罪現(xiàn)場(chǎng)的體液斑痕類型和組織來源對(duì)于幫助現(xiàn)場(chǎng)重建，證明DNA證據(jù)與犯罪活動(dòng)之間的聯(lián)系，指明偵查方向，完善司法鑒定證據(jù)鏈等均有著重要的意義。目前，絕大部分法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室仍在使用常規(guī)的化學(xué)顯色和酶聯(lián)免疫反應(yīng)等傳統(tǒng)方法來進(jìn)行體液識(shí)別。這類檢驗(yàn)均屬于蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)，如免疫金標(biāo)試劑條法檢測(cè)人前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）和人血紅蛋白，其檢測(cè)靈敏度較低[1]，且通常需要耗費(fèi)一定的檢材，不適用微量物證檢驗(yàn)。對(duì)于唾液等其他體液，目前尚未見類似試劑條法。

重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification,RPA）是2006年由英國(guó)TwistDx生物技術(shù)公司開發(fā)的一種體外核酸等溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)[2]。該技術(shù)解決了需要利用準(zhǔn)確控溫的熱循環(huán)儀器來進(jìn)行PCR擴(kuò)增的限制，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，無需特殊設(shè)備，更適合快速檢驗(yàn)，已在疾病診斷、農(nóng)業(yè)、食品、生物安全等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用和發(fā)展。

目前，國(guó)內(nèi)尚未見利用RPA技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)物證體液斑痕屬性鑒定的報(bào)道。本研究在前期篩選出多種體液特異性信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）分子標(biāo)識(shí)[1]的基礎(chǔ)上，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和RPA技術(shù)，通過DNA-RNA共提取，同時(shí)完成唾液的生物屬性鑒定和短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）分型檢驗(yàn)，為法醫(yī)物證體液屬性鑒定提供一種新的鑒定策略和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

5名健康男性志愿者提供唾液樣本5份，作為陽性對(duì)照。其他唾液樣本20份均來自日常檢案：被害人口腔拭子8份，現(xiàn)場(chǎng)提取飲料瓶瓶口涂取物5份，嚼過的口香糖涂取物5份，現(xiàn)場(chǎng)果核涂取物2份。

1.2 方法

1.2.1 DNA-RNA共提取

按照AllPrepR○DNA/RNA Micro試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）說明書操作對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取。總RNA用于反轉(zhuǎn)錄和RPA檢測(cè)，基因組DNA用于STR分型。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄

樣本RNA使用TaqMan Gold RT-PCR試劑盒（美國(guó)AB公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作參見試劑盒說明書。反應(yīng)體系均為10 μL，包括：10×TaqMan RT緩 沖 液1 μL、25 mmol/L MgCl22.2 μL、10 mmol/L dNTPs Mix 2 μL、50 μmol/L Oligo d（T）16 0.5 μL、20 U/μL RNase抑 制 劑0.2 μL、50 U/μL MultiScribe反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL、RNA模板3.85 μL。反應(yīng)條件為：25℃10 min，48℃30 min，95℃5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

參考RPA引物設(shè)計(jì)要求，根據(jù)唾液特異性分子標(biāo)識(shí)HTN3基因保守序列設(shè)計(jì)并篩選RPA引物，進(jìn)行特異性確認(rèn)后，在上游引物5’端添加FAM熒光標(biāo)記，由上海生工生物工程有限公司合成。最終設(shè)計(jì)的RPA檢測(cè)引物如下，擴(kuò)增產(chǎn)物為240 bp。

上 游 引 物HTN3RPA-F：CAT CAT TCA CAT CGA GGC TAT AGA TCA

下游引物HTN3RPA-R：AAA TGA TAA TTA GGA AGG GAA GTA TCC TGA AA

1.2.4 構(gòu)建RPA檢測(cè)方法

以1.2.2節(jié)制備的樣本cDNA為模板，采用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置超純水為陰性對(duì)照，測(cè)試在恒溫39℃條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為20 min。

參照RPA擴(kuò)增試劑盒TwistAmp Basic kit（英國(guó)TwistDX公司）配制RPA擴(kuò)增體系（50 μL）：將Rehydration Buffer 29.5 μL加入到含有凍干粉酶的0.2 mL Twist Amp反應(yīng)管中，再依次加入上、下游引物各2 μL（最終濃度為0.4 μmol/L），去離子水12 μL，模板cDNA 2μL，最后加入乙酸鎂溶液2.5μL（280 mmol/L）。

待反應(yīng)結(jié)束后，將50 μL苯酚/三氯甲烷溶液加入到RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中，充分混勻，在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min，取1 μL上清液在3500遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行電泳，利用GeneMapper v3.2進(jìn)行DNA片段分析。

1.2.5 RPA檢測(cè)方法特異性驗(yàn)證

取純化的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用1×TBE緩沖液在5V/cm條件下進(jìn)行恒壓電泳40~60 min，回收目標(biāo)條帶，測(cè)序驗(yàn)證，評(píng)價(jià)建立的RPA檢測(cè)方法的特異性。

1.2.6 RPA檢測(cè)方法應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

對(duì)來自日常檢案的唾液樣本20份進(jìn)行RT-RPA檢測(cè)，以結(jié)果的一致性評(píng)價(jià)方法應(yīng)用效果。用Ver-FilerTMPlus PCR試劑盒（美國(guó)AB公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，取1μL擴(kuò)增產(chǎn)物在3500遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行電泳。利用GeneMapper v3.2進(jìn)行STR分析，觀察STR基因座的檢出數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 RPA檢測(cè)方法的建立

以陽性對(duì)照唾液樣本cDNA為模板，超純水為陰性對(duì)照，利用HTN3RPA-F和HTN3RPA-R引物，經(jīng)RPA擴(kuò)增，在擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)為20 min時(shí)便可獲得較為理想的擴(kuò)增結(jié)果（圖1），擴(kuò)增產(chǎn)物為240 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物條帶與目的條帶大小一致，陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。

圖1 RPA技術(shù)判定唾液的特異標(biāo)記基因HTN3

2.2 RPA檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)回收并純化擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，直接測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶與目的基因序列完全一致。

2.3 RPA檢測(cè)方法的應(yīng)用效果

應(yīng)用本研究建立的RPA檢測(cè)方法對(duì)來自日常檢案的20份唾液樣本進(jìn)行HTN3 RPA檢測(cè)和常規(guī)STR分型，結(jié)果顯示：1份樣本未獲得STR分型，HTN3 RPA檢測(cè)陰性；1份樣本僅獲得15個(gè)基因座的STR分型，HTN3 RPA檢測(cè)陽性；其余樣本均獲得20個(gè)以上基因座的STR分型（VerFilerTMPlus PCR試劑盒共24個(gè)STR基因座），且HTN3 RPA檢測(cè)也均為陽性（圖2和表1）。結(jié)果表明，RPA檢驗(yàn)方法與常規(guī)的STR鑒定可相互驗(yàn)證，排除RPA檢驗(yàn)的假陽性結(jié)果。

表1 RPA檢測(cè)方法在實(shí)際案件唾液類生物樣本中的應(yīng)用評(píng)價(jià)表

圖2 RPA技術(shù)判定唾液的毛細(xì)管電泳圖譜（陽性結(jié)果）

3 討論

RPA技術(shù)以T4噬菌體核酸復(fù)制機(jī)制為原理[2]，在恒溫條件下，利用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白協(xié)同實(shí)現(xiàn)引物與模板的特異性結(jié)合，定位后引發(fā)鏈交換反應(yīng)并啟動(dòng)DNA合成，完成模板上目標(biāo)片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。與PCR技術(shù)相比，本研究建立的RPA方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）設(shè)備簡(jiǎn)單。一般RPA反應(yīng)溫度在30℃～42℃之間，本實(shí)驗(yàn)僅需要一臺(tái)恒溫水浴鍋在39℃條件下完成RPA檢測(cè)，極大減少了傳統(tǒng)PCR技術(shù)所需的設(shè)備成本和實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求。（2）快速檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在39℃條件下擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)20 min時(shí)便可獲得較為理想的擴(kuò)增結(jié)果，相比傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR[1]，該技術(shù)極大縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，有利于快速檢測(cè)。（3）特異性強(qiáng)。RPA反應(yīng)與傳統(tǒng)PCR均需要上、下游引物，且引物要求在30～35 bp之間，長(zhǎng)于PCR引物，對(duì)靶序列的擴(kuò)增更準(zhǔn)確，特異性更強(qiáng)。HTN3和STATH是唾液鑒定常用的兩種標(biāo)記物[3-4]。前期研究[5]中顯示，HTN3在唾液和口腔黏膜中有特異性高表達(dá)，而STATH則在鼻腔分泌物中顯示出更高表達(dá)水平。因此，本研究選擇了特異性更高的HTN3作為檢測(cè)標(biāo)記物。（4）結(jié)果易于判定。由于擴(kuò)增產(chǎn)物為長(zhǎng)度明確的DNA片段，完全可以在現(xiàn)有的法醫(yī)物證DNA電泳分析技術(shù)平臺(tái)上進(jìn)行操作，并同步完成物證的STR分型檢驗(yàn)。

由于RPA通常在較低溫度（30℃～42℃）下進(jìn)行，在目的基因含量低的情況下，容易出現(xiàn)由引物二聚體或非靶基因[2]形成的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，干擾目的基因的檢測(cè)，這對(duì)引物設(shè)計(jì)提出了更高的要求。RPA引物應(yīng)避免5’端過多的鳥嘌呤，在3’端設(shè)計(jì)一個(gè)GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)以避免引物自身配對(duì)形成二聚體。本實(shí)驗(yàn)采用的是在設(shè)計(jì)的數(shù)對(duì)引物中篩選出的一對(duì)最佳引物，在對(duì)20份現(xiàn)場(chǎng)檢材的HTN3標(biāo)記檢驗(yàn)中經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證未發(fā)現(xiàn)有假陽性結(jié)果。RPA技術(shù)在司法鑒定領(lǐng)域未有相關(guān)報(bào)道和應(yīng)用，本研究引入RPA技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)物證的體液鑒定，可解決體液來源的實(shí)驗(yàn)室快速判定。后續(xù)研究將進(jìn)一步利用RPA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合人類多種體液特異性分子標(biāo)識(shí)，嘗試建立一套特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果判定準(zhǔn)確，可用于常規(guī)法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室的精準(zhǔn)體液鑒定復(fù)合檢測(cè)體系。