項(xiàng)丹丹，楊曉芳，易干軍，陶海青，初元琦，李春雨

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

香蕉作為世界貿(mào)易量最大的水果，也是世界十大主食之一。香蕉產(chǎn)業(yè)是我國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，該產(chǎn)業(yè)為我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)作出了重要貢獻(xiàn)。然而，香蕉枯萎病（Fusarium wilt of banana）在我國(guó)廣東、廣西等香蕉主產(chǎn)區(qū)的蔓延，嚴(yán)重制約著我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。香蕉枯萎病是一種由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporumf.sp.cubense,Foc）侵染引起維管束壞死的毀滅性土傳真菌病害。Foc遺傳多樣性豐富，根據(jù)致病香蕉品種的類型，可分為4個(gè)生理小種，其中危害性最大的是香蕉枯萎病菌熱帶4 號(hào)生理小種（Foctropical race 4,FocTR4），能侵染幾乎所有香蕉栽培品種[1]。近年來，由于FocTR4引起的枯萎病發(fā)展態(tài)勢(shì)嚴(yán)峻，我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)收獲面積逐年下降[2]。2019 年，F(xiàn)ocTR4 在哥倫比亞以及加勒比海地區(qū)的首次檢出預(yù)示著這種病害已成為全球香蕉產(chǎn)業(yè)的最大威脅[3]。

香蕉枯萎病的防治是世界性難題，目前主要采用培育抗性品種、生物防治、化學(xué)防治等手段進(jìn)行綜合防控[3]?？梗停┎∑贩N的推廣正在香蕉枯萎病的防治中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但近年來病原菌生理小種的多樣化加速了品種抗病性的喪失。生物防治發(fā)揮作用需要的時(shí)間較長(zhǎng)、過程較為復(fù)雜，在病害防控中仍處于研發(fā)階段。化學(xué)殺菌劑具有高效、速效、使用方便、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，在病蟲害綜合防治中占有重要地位。國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了多種殺菌劑對(duì)Foc作用的試驗(yàn)，如NEL等[4]表明1 μg/mL咪鮮胺可顯著抑制Foc菌絲生長(zhǎng)；許文耀等[5]發(fā)現(xiàn)霉靈·溴菌腈對(duì)Foc孢子萌發(fā)有良好的抑制效果；除此之外，許多報(bào)道表明咪鮮胺及其混配劑對(duì)Foc有良好的抑菌活性[6-8]。但在田間環(huán)境下，室內(nèi)試驗(yàn)篩選的藥劑往往不能表現(xiàn)出相同的抑菌效果，難以在生產(chǎn)中得到應(yīng)用與推廣[9]。因此，到目前為止還沒找到一種防治香蕉枯萎病的理想殺菌劑[10]。原因也在于香蕉枯萎病是一種維管束類型的病害，病菌以不同形式存在于土壤中，農(nóng)藥施用于土壤后難以接觸到病菌。深入開展防治香蕉枯萎病化學(xué)藥劑的研究，篩選開發(fā)有效的藥劑，是香蕉枯萎病綜合防治體系中必須攻克的瓶頸。

三唑類殺菌劑具有優(yōu)良的保護(hù)、治療作用，其內(nèi)吸性強(qiáng)，作用的病原菌產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)低，持效期長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境與使用者安全，因此在殺菌劑領(lǐng)域占有重要地位。目前三唑類殺菌劑品種已有四十幾種，占市場(chǎng)上殺菌劑的1/3[11]。且丙環(huán)唑、戊唑醇、腈菌唑、丙硫菌唑等三唑類殺菌劑被陸續(xù)研發(fā)出來。三唑類殺菌劑屬于甾醇脫甲基抑制劑（sterol demethylation inhibitor,DMI）類殺菌劑，主要通過抑制甾醇生物合成中細(xì)胞色素P450 甾醇14α-脫甲基酶（cytochrome P450 sterol 14α-demethylase,CYP51）的活性來破壞病原菌細(xì)胞膜功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。該類殺菌劑屬于N-1-取代-1，2，4-三唑環(huán)的有機(jī)氮雜環(huán)類化合物，主要通過發(fā)揮內(nèi)吸功能，隨蒸騰作用運(yùn)輸至植物各部位。由于其獨(dú)特的作用方式及優(yōu)異的生物活性，三唑類殺菌劑已被廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、水稻、高粱等作物以及水果和蔬菜等的多種真菌病害防治中。但目前尚未見系統(tǒng)比較不同三唑類殺菌劑防治香蕉枯萎病效果的報(bào)道。因此，本研究基于常用的三唑類殺菌劑，開展殺菌劑對(duì)FocTR4 的抑菌效果研究，通過對(duì)三唑類殺菌劑與其靶標(biāo)CYP51 的相互作用來探究它們對(duì)FocTR4 的抑制效果。本研究結(jié)果不但可為我國(guó)香蕉枯萎病的化學(xué)防治提供新策略，而且也為殺菌劑的科學(xué)合理應(yīng)用提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株FocTR4（菌株Ⅱ5，VCG01213），保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所香蕉遺傳改良中心，使用前將菌株于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)（28 ℃，3 d）。丙硫菌唑、腈菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)默克公司。分別稱取對(duì)應(yīng)量的不同三唑類殺菌劑原藥溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）中配制成10 mg/mL的母液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。使用時(shí)將母液用DMSO稀釋到所需濃度，母液和稀釋后的藥劑每隔2 周重新配制。RNA提取試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒（HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit）和 以RNA 為 模 板的染料法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）試 劑 盒（HiScript?ⅡOne Step qRT-PCR SYBR Green Kit），均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit），購(gòu)自廣州市紅爍林生物科技有限公司。

1.2 抑菌活性的測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同三唑類殺菌劑對(duì)FocTR4 的抑菌活性。將PDA 加熱至完全融化，待其冷卻至40～50 ℃時(shí)加入相應(yīng)濃度的丙硫菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇和腈菌唑，使得4 種三唑類殺菌劑在PDA 培養(yǎng)基中的終質(zhì)量濃度分別為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、15、20 μg/mL，用已滅菌的打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，菌餅倒置接種在冷卻至室溫的PDA平板上。用封口膜將平板密封，倒置放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，同時(shí)以加入等體積的DMSO 為對(duì)照。培養(yǎng)7 d后利用十字交叉法測(cè)定各平板菌落的生長(zhǎng)直徑并計(jì)算各濃度三唑類殺菌劑的抑制率，通過概率值分析法計(jì)算半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50%of maximal effect,EC50）值。菌絲生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式如下：

1.3 菌絲形態(tài)觀察

菌株培養(yǎng)和處理同1.2節(jié)。于28 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7 d 后，用牙簽挑取菌落邊緣少量菌絲于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）（pH 7.4）中，用移液槍輕輕吹打菌絲至分散，并吸取少量菌液滴加于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)并拍照。

在平板邊緣打取直徑為8～10 mm的菌餅，將菌餅置于2.5%戊二醛-4.0%多聚甲醛固定液（pH 6.8）中，于4 ℃條件下進(jìn)行前固定。3 h后用PBS（pH 6.8）沖洗樣品3 次，繼續(xù)用1%鋨酸固定并過夜，再次用PBS（pH 6.8）沖洗樣品3 次。用30%、50%、70%、90%、95%、100%、100%、100%乙醇梯度脫水，每個(gè)濃度梯度處理15～20 min。臨界點(diǎn)干燥、粘樣、噴金鍍膜后，于S-3400N-Ⅱ掃描電子顯微鏡（日本日立公司）下觀察、拍照。以上每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 菌絲電導(dǎo)率的測(cè)定

菌株培養(yǎng)和處理同1.2 節(jié)。參考張俊[13]的方法測(cè)定菌絲細(xì)胞膜的通透性以確定菌絲電導(dǎo)率。用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取菌餅并放入配制好的馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth,PDB）培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用5 層擦鏡紙過濾。將稱取的0.15 g 菌絲放入已提前裝好等量雙蒸水的小燒杯中，加入不同質(zhì)量濃度（0.25、1.25 μg/mL）的丙硫菌唑、丙環(huán)唑、戊唑醇、腈菌唑，以加入等體積的DMSO 為對(duì)照。分別在5、15、30、60、90、120、150、180、240、300、360 min時(shí)用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率，最后將菌絲煮沸15 min，冷卻至室溫后測(cè)定最終電導(dǎo)率，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。菌絲相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式如下：

1.5 丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量測(cè)定

在超凈工作臺(tái)中，將相應(yīng)濃度的三唑類殺菌劑加入冷卻至40～50 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，使不同殺菌劑的終質(zhì)量濃度分別為0.25、1.25 μg/mL，同時(shí)分別以加入等體積的DMSO 為對(duì)照。待平板冷卻凝固，將已提前滅菌的玻璃紙平鋪于PDA 表面，待玻璃紙表面水分吹干后接種菌餅，隨后密封置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后收集菌絲。采用MDA 含量檢測(cè)試劑盒（微量法）（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行MDA 含量的測(cè)定：分別稱取對(duì)照組和處理組菌絲樣品0.10 g，加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，于8 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)結(jié)束后，在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值，計(jì)算樣品中MDA含量。

1.6 CYP51 酶活性的測(cè)定

菌株培養(yǎng)和處理同1.2節(jié)。根據(jù)細(xì)胞色素P450芳香化酶檢測(cè)試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）說明書要求進(jìn)行CYP51酶活性的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取0.10 g 菌絲樣品，加入1 mL 提取液，利用超聲波破碎菌絲細(xì)胞（冰浴，功率200 W，超聲3 s 停10 s，重復(fù)30 次），于4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min，收集上清液，置于冰上待測(cè)。加入50 μL 終止液終止反應(yīng)，在450 nm 波長(zhǎng)下依次測(cè)定各孔的吸光度值。用標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出樣品經(jīng)過稀釋后的蛋白質(zhì)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.7 基因表達(dá)量的測(cè)定

參照RNA 提取試劑盒說明書提取菌絲的總RNA，以RNase-free 水為對(duì)照，檢測(cè)RNA 的濃度與純度；采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；采用cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體試劑添加和反應(yīng)條件按照說明書要求進(jìn)行，反應(yīng)終止后得到的cDNA 于－80 ℃冰箱中保存，備用。

所用引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，20 μL qRT-PCR體系：0.4 μL 10 μmol/L正、反向引物，10 μL 2×通用型高靈敏度染料法定量PCR 預(yù)混液（Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix），2 μL cDNA（提前用ddH2O 稀釋4 倍），7.2 μL ddH2O。反應(yīng)擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸10 s，40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線制作：95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性60 s，升溫至95 ℃保持15 s，結(jié)束整個(gè)過程。目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.8 同源建模和分子對(duì)接

選擇與FocTR4 的CYP51（TR4-CYP51）蛋白質(zhì)序列一致性大于50% 的蛋白質(zhì)序列pdb ID 6CR2[14]、5V5Z[15]、5ESI[16]和5JLC[16]進(jìn) 行 多 模 板 建模[17]。使用Modeller 9.20 軟件[18]多模板建模工具預(yù)測(cè)CYP51 的三維結(jié)構(gòu)，獲得1 000 個(gè)結(jié)構(gòu)，通過DOPE 軟件打分選擇最佳模型；用AutoDock Tools制備受體pdbqt 文件，加氫和分配電荷。采用AutoDock Vina工具進(jìn)行分子對(duì)接，選擇血紅素鐵原子為對(duì)接中心，設(shè)置對(duì)接盒子為15 ?×15 ?×15 ?。根據(jù)模板晶體結(jié)構(gòu)中配體的結(jié)合構(gòu)象，主要按照如下2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)選擇最優(yōu)的結(jié)合構(gòu)象：第一是配體結(jié)合在4 個(gè)芳香氨基酸殘基Tyr137、Phe131、Phe230 和Phe511 組成的結(jié)合口袋中；第二是三氮唑環(huán)上的N原子與血紅素鐵接近，N-FE 接近垂直于血紅素平面。使用PyMOL軟件和Ligplot軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和對(duì)接構(gòu)象的可視化。

1.9 親和動(dòng)力學(xué)分析

前期的研究中，我們已通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了純度較高的CYP51 蛋白（純度≥90%）[17]。采用表面等離子共振（surface plasmon resonance,SPR）技術(shù)，通過Biacore T200軟件（瑞士GE公司）進(jìn)行多循環(huán)動(dòng)力學(xué)測(cè)定，分析不同三唑類殺菌劑與CYP51之間的相互作用。采用氨基偶聯(lián)反應(yīng)將CYP51蛋白共價(jià)連接于CM5傳感芯片表面。將三唑類殺菌劑稀釋成濃度梯度125.000、62.500、31.250、15.625 nmol/L，緩沖液為含5%DMSO的HBS-EP［0.01 mol/LN-（2-羥乙基）哌嗪-N′-（2-乙磺酸）（HEPES），0.15 mol/L NaCl，0.003 mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），0.05%（體積比）表面活性劑P20，pH 7.4］。依次進(jìn)行親合力與動(dòng)力學(xué)測(cè)試，每個(gè)濃度設(shè)置1 個(gè)循環(huán)，結(jié)合120 s，解離300 s，設(shè)置溫度25 ℃，流速30 μL/min。Biacore T200 Evaluation 軟件用于數(shù)據(jù)分析，同時(shí)使用1∶1穩(wěn)態(tài)親和力模型進(jìn)行動(dòng)力學(xué)/親和力擬合分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

采用GraphPad Prism 7.00和Statistics 19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)照組和不同三唑類殺菌劑處理組采用單因素方差分析方法，并選擇Tukey’s 多重比較法進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同三唑類殺菌劑對(duì)Foc TR4生物活性的影響

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了4種三唑類殺菌劑對(duì)香蕉枯萎病菌FocTR4 的抑制作用。結(jié)果表明：對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)迅速，各藥劑處理組菌絲生長(zhǎng)緩慢；對(duì)FocTR4的抑制效果存在濃度依賴效應(yīng)，隨著三唑類殺菌劑濃度的升高，菌落直徑逐漸減?。▓D1A）。在相同濃度下，不同殺菌劑對(duì)FocTR4 抑制效果存在顯著差異，其中丙硫菌唑的抑菌活性最高，EC50為0.79 μg/mL（R2=0.95）；戊唑醇和丙環(huán)唑?qū)ocTR4 的抑制作用低于丙硫菌唑，EC50分別為1.33 μg/mL（R2=0.95）和5.32 μg/mL（R2=0.95）；腈菌唑的抑菌活性遠(yuǎn)低于其他3 種殺菌劑，其EC50為10.13 μg/mL（R2=0.95）（圖1A～B）。

利用光學(xué)顯微鏡觀察殺菌劑處理對(duì)FocTR4菌絲形態(tài)的影響發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組菌絲表面光滑，生長(zhǎng)粗細(xì)均勻，分枝正常；而處理組菌絲呈現(xiàn)不規(guī)則分枝增多、生長(zhǎng)粗細(xì)不均等畸形現(xiàn)象（圖1C）。進(jìn)一步通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，三唑類殺菌劑處理可引起FocTR4 菌絲出現(xiàn)表面干癟、凹陷和扁平化現(xiàn)象，其中丙硫菌唑?qū)ocTR4 菌絲的形態(tài)影響最為明顯。光學(xué)顯微鏡下觀察到腈菌唑引起FocTR4菌絲分枝增多，但掃描電子顯微鏡觀察到其對(duì)菌絲的顯微結(jié)構(gòu)無明顯影響（圖1D）。以上結(jié)果表明，這4種殺菌劑均可影響FocTR4 菌絲的正常生長(zhǎng)發(fā)育，且不同殺菌劑引起的菌絲畸形程度存在差異。

圖1 不同三唑類殺菌劑對(duì)Foc TR4的抑制效果及菌絲形態(tài)Fig.1 Inhibitory effects of different triazole fungicides against Foc TR4 and hyphae morphology

2.2 不同三唑類殺菌劑對(duì)Foc TR4 細(xì)胞膜通透性的影響

電導(dǎo)率可作為病原菌菌絲細(xì)胞膜損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，電導(dǎo)率越大，表明細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲漏越嚴(yán)重，細(xì)胞膜的損傷越厲害。因此，本研究通過測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)FocTR4菌絲在雙蒸水中的相對(duì)電導(dǎo)率來表征三唑類殺菌劑對(duì)菌絲細(xì)胞膜通透性的影響，相對(duì)電導(dǎo)率越大，表示菌絲細(xì)胞膜通透性越高。如圖2所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和處理組菌絲的相對(duì)電導(dǎo)率均逐漸升高，且不同時(shí)間點(diǎn)各處理組菌絲電導(dǎo)率均顯著高于對(duì)照組，在處理時(shí)間點(diǎn)為360 min 時(shí)，對(duì)照組的電導(dǎo)率為20.69%，經(jīng)0.25、1.25 μg/mL丙硫菌唑處理的菌絲相對(duì)電導(dǎo)率分別達(dá)到59.16%和61.42%（圖2A），相同條件下戊唑醇處理的菌絲相對(duì)電導(dǎo)率分別為32.03%和51.37%（圖2B），丙環(huán)唑處理組相對(duì)電導(dǎo)率分別為30.55%和47.65%（圖2C），腈菌唑處理組的相對(duì)電導(dǎo)率分別為30.70%和41.55%（圖2D）。以上結(jié)果表明，4種三唑類殺菌劑均可引起FocTR4菌絲細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，提高相對(duì)電導(dǎo)率，且濃度越高，對(duì)菌絲細(xì)胞膜通透性的影響越大。除此之外，不同殺菌劑對(duì)菌絲細(xì)胞膜通透性的影響也存在差異，表現(xiàn)為丙硫菌唑＞戊唑醇＞丙環(huán)唑＞腈菌唑。

圖2 不同三唑類殺菌劑對(duì)Foc TR4菌絲細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of different triazole fungicides on the relative conductivity of Foc TR4 hypha cells

MDA 是細(xì)胞內(nèi)部生物大分子過氧化的產(chǎn)物之一，也是衡量細(xì)胞膜損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)，MDA 含量越高，表示細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。與相對(duì)電導(dǎo)率結(jié)果一致，不同三唑類殺菌劑處理可導(dǎo)致FocTR4 菌絲細(xì)胞內(nèi)MDA 含量顯著上升（圖3），0.25、1.25 μg/mL 丙硫菌唑處理組菌絲的MDA 含量分別為對(duì)照組（5.43 nmol/mL）的1.72 倍（9.33 nmol/mL，P＜0.001）和2.50 倍（13.57 nmol/mL，P＜0.001）；0.25、1.25 μg/mL戊唑醇處理組菌絲的MDA含量分別為對(duì)照組的1.53 倍（8.33 nmol/mL，P＜0.001）和2.24倍（12.18 nmol/mL，P＜0.001）；0.25、1.25 μg/mL丙環(huán)唑處理組菌絲的MDA 含量分別為對(duì)照組MDA 的1.40 倍（7.62 nmol/mL，P＜0.001）和1.96 倍（10.65 nmol/mL，P＜0.001）；0.25、1.25 μg/mL腈菌唑處理組菌絲的MDA 含量分別為對(duì)照組的1.40 倍（7.58 nmol/mL，P＜0.001）和1.93 倍（10.48 nmol/mL，P＜0.001）。以上結(jié)果表明，三唑類殺菌劑可促進(jìn)MDA在FocTR4菌絲細(xì)胞中的積累，從而造成菌絲不同程度的膜脂過氧化損傷。

圖3 不同三唑類殺菌劑對(duì)Foc TR4 菌絲細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of different triazole fungicides on concentrations of MDA in Foc TR4 hypha cells

2.3 三唑類殺菌劑與靶標(biāo)CYP51 的相互作用

三唑類殺菌劑通過與靶標(biāo)CYP51 作用抑制真菌生長(zhǎng)，其與靶標(biāo)酶的結(jié)合能力能夠在一定程度上反映他們的抑菌能力，因此，本研究通過明確不同三唑類殺菌劑處理對(duì)細(xì)胞色素P450酶活性、CYP51基因表達(dá)量的影響以及不同三唑類殺菌劑與CYP51的結(jié)合作用模式，探究不同三唑類殺菌劑對(duì)CYP51的影響。

如圖4A 所示，不同濃度的4 種殺菌劑對(duì)FocTR4 的細(xì)胞色素P450 酶活性均具有一定的誘導(dǎo)作用，且存在濃度依賴效應(yīng)。其中，與對(duì)照組相比，0.25 μg/mL丙硫菌唑和0.25 μg/mL戊唑醇可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450 酶活性顯著上升（P＜0.05），細(xì)胞色素P450酶活性分別為對(duì)照組的1.70倍和1.45倍；當(dāng)處理組的質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL 時(shí)，4 種殺菌劑均可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450 酶活性上升（P＜0.05）。FocTR4 含 有3 個(gè)CYP51基 因，分 別 為CYP51-1（FOIG_04112）、CYP51-2（FOIG_10483）和CYP51-3（FOIG_00890）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定不同三唑類殺菌劑對(duì)基因表達(dá)量的影響，結(jié)果（圖4）表明：4 種殺菌劑均可顯著上調(diào)CYP51-1（圖4B）和CYP51-3（圖4D）基因的表達(dá)量（P＜0.05），而對(duì)CYP51-2基因的表達(dá)量均無顯著影響（圖4C）。CYP51-1基因表達(dá)量的上調(diào)范圍在0.25 μg/mL處理下為1.29～5.66 倍，在1.25 μg/mL 處理下為3.04～16.08 倍。CYP51-3基因表達(dá)量上調(diào)范圍在0.25 μg/mL 處理下為1.26～6.30 倍，在1.25 μg/mL 處理下為3.50～13.93 倍。與對(duì)細(xì)胞色素P450 酶活性的誘導(dǎo)作用不同，在相同處理濃度下，丙硫菌唑?qū)YP51-1和CYP51-3基因表達(dá)水平的影響顯著小于戊唑醇和丙環(huán)唑。

圖4 不同三唑類殺菌劑對(duì)細(xì)胞色素P450酶活性和靶標(biāo)基因CYP51相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of different triazole fungicides on cytochrome P450 enzyme activity and relative expression levels of target gene CYP51

為進(jìn)一步研究不同三唑類殺菌劑與CYP51的作用模式，本研究采用Modeller 9.20 軟件對(duì)CYP51-3蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源建模（圖5A），利用AutoDock Vina 工具分析不同三唑類殺菌劑與CYP51 蛋白質(zhì)的作用模式（圖5B）。采用盲對(duì)接將每個(gè)配體進(jìn)行5次對(duì)接，每次產(chǎn)生20個(gè)構(gòu)象，窮盡性為100。通過分析它們與CYP51的結(jié)合構(gòu)象發(fā)現(xiàn)，這4種殺菌劑均位于同樣的結(jié)合口袋，共同作用的疏水殘基有Ala308、Phe511、Tyr123、Phe131、Ile374 和Tyr137（圖6）。結(jié)合自由能反映了配體和受體間的結(jié)合程度，結(jié)合自由能越小，分子間結(jié)合就越緊密。通過分子對(duì)接得到丙硫菌唑、戊唑醇、腈菌唑和丙環(huán)唑同源建模結(jié)構(gòu)的結(jié)合自由能分別為－33.79、－34.92、－34.08、－36.59 kJ/mol，上述4 種殺菌劑三氮唑環(huán)上的N 原子與CYP51 的血紅素鐵之間的距離分別為2.66、2.81、2.67、2.96 ?（表2）。

圖5 Foc TR4中CYP51蛋白質(zhì)的同源建模Fig.5 Homology modeling of CYP51 protein from Foc TR4

圖6 分子對(duì)接預(yù)測(cè)4種三唑類殺菌劑與CYP51的結(jié)合模式Fig.6 Binding modes of four triazole fungicides with CYP51 predicted by molecular docking

為驗(yàn)證不同三唑類殺菌劑與CYP51 的互作模式，分別對(duì)4 種殺菌劑與CYP51 蛋白質(zhì)進(jìn)行SPR 親和力測(cè)試。如圖7 所示，CYP51 蛋白質(zhì)的響應(yīng)值（response unit,RU）隨殺菌劑濃度的升高而上升，表現(xiàn)出很好的濃度依賴效應(yīng)。4種殺菌劑與CYP51的結(jié)合呈現(xiàn)出2 種模式：丙硫菌唑和腈菌唑在進(jìn)樣幾秒鐘內(nèi)即可以取得穩(wěn)態(tài)反應(yīng)，進(jìn)樣完畢藥物解離迅速，響應(yīng)信號(hào)值立即回歸基線，呈現(xiàn)出“快上快下”的結(jié)合模式；而戊唑醇和丙環(huán)唑與CYP51的結(jié)合呈現(xiàn)出“慢上快下”結(jié)合模式。這些結(jié)果證實(shí)了CYP51 蛋白偶聯(lián)芯片具有良好的活性和特異性。利用1∶1穩(wěn)態(tài)親和力模型對(duì)4種殺菌劑與CYP51的結(jié)合情況進(jìn)行擬合，得到了4 種殺菌劑與CYP51 蛋白質(zhì)的親和動(dòng)力常數(shù)（KD）（表2），分別為2.87×10－7mol/L（丙硫菌唑）、2.42×10－9mol/L（戊唑醇）、7.86×10－8mol/L（丙環(huán)唑）和2.15×10－6mol/L（腈菌唑）。

圖7 不同三唑類殺菌劑與CYP51的結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7 Binding kinetic curves of different triazole fungicides with CYP51

表2 不同三唑類殺菌劑與CYP51的分子對(duì)接和親和動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Molecular docking and affinity-kinetic parameters of different triazole fungicides with CYP51

3 討論與結(jié)論

三唑類殺菌劑因其優(yōu)良的保護(hù)、治療作用及內(nèi)吸性功能已被廣泛用于多種植物病原菌的防治。但目前尚無關(guān)于不同三唑類殺菌劑防治香蕉枯萎病效果差異比較的系統(tǒng)性報(bào)道。本研究測(cè)定了4種常用三唑類殺菌劑對(duì)香蕉枯萎病菌FocTR4 的抑菌活性，結(jié)果表明：不同三唑類殺菌劑對(duì)FocTR4菌絲生長(zhǎng)抑制效果差異明顯，其中丙硫菌唑的抑菌活性最高，EC50為0.79 μg/mL，而相同條件下腈菌唑EC50為10.13 μg/mL，二者抑菌活性相差近12倍。由此可見三唑類殺菌劑對(duì)FocTR4 的作用具有一定的選擇性。細(xì)胞膜具有多種生物功能，可為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境，是真菌自我保護(hù)的屏障。病原菌細(xì)胞膜受損可導(dǎo)致細(xì)胞膜屏障作用被破壞，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄，外源物質(zhì)也可以隨意進(jìn)入細(xì)胞，最終導(dǎo)致病原菌形態(tài)發(fā)生改變。三唑類殺菌劑通過抑制真菌甾醇生物合成中CYP51活性，引起麥角甾醇合成受阻以及甾醇前體物質(zhì)的積累，從而破壞細(xì)胞膜的正常功能，在不同程度上對(duì)細(xì)胞膜的通透性、完整性以及細(xì)胞的形態(tài)等各方面產(chǎn)生影響[19]，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，使用三唑類殺菌劑尤其是丙硫菌唑處理可導(dǎo)致FocTR4菌絲出現(xiàn)表面干癟、凹陷和扁平化現(xiàn)象。電導(dǎo)率和MDA含量是衡量細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)。與丙環(huán)唑?qū)吮P菌[20]，戊唑醇、三唑醇對(duì)小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）菌絲細(xì)胞膜的影響結(jié)果[21]一致，丙硫菌唑、戊唑醇、丙環(huán)唑和腈菌唑均可以引起FocTR4 菌絲細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，使細(xì)胞膜通透性提高，表明三唑類殺菌劑對(duì)FocTR4 的生長(zhǎng)影響不僅表現(xiàn)在對(duì)菌絲微觀形態(tài)的改變上，也體現(xiàn)在對(duì)菌絲細(xì)胞膜通透性的改變上，從而引起細(xì)胞內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。同時(shí)，相較于其他3種三唑類殺菌劑，丙硫菌唑?qū)ocTR4的作用效果是最優(yōu)的。

目前，有關(guān)不同三唑類殺菌劑抑菌活性差異作用機(jī)制，尤其是不同分子結(jié)構(gòu)與其靶標(biāo)的互作模式仍缺乏進(jìn)一步研究。本研究中，三唑類殺菌劑處理可引起FocTR4菌絲中細(xì)胞色素P450酶活性上升，表明4 種三唑類殺菌劑對(duì)細(xì)胞色素P450 酶具有誘導(dǎo)作用。動(dòng)植物或真菌中都不只含有1個(gè)CYP51基因[22]。如煙曲霉（Aspergillus fumigatus）[23]以及稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）[24]中均含有2 個(gè)同源CYP51基因，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[19]、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）[25]以及黃曲霉（Aspergillus flavus）[26]中則均含有3 個(gè)CYP51基因。對(duì)細(xì)胞色素P450 基因的異源表達(dá)和調(diào)控的研究結(jié)果證明，P450 有廣泛的底物誘導(dǎo)特性[27]，如戊唑醇可誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌[25]和亞洲鐮刀菌（Fusarium asiaticum）[28]的CYP51A和CYP51B基因的過量表達(dá)；三唑類殺菌劑可誘導(dǎo)稻瘟病菌[24]和指狀青霉菌（Penicillium digitatum）[29]中CYP51A基因表達(dá)量上調(diào)。同樣地，本研究中，與對(duì)照組相比，4種三唑類殺菌 劑 可誘 導(dǎo)FocTR4 中CYP51-1和CYP51-3的 表達(dá)量顯著性上調(diào)，表明靶標(biāo)基因CYP51的較高表達(dá)是4 種三唑類殺菌劑誘導(dǎo)的結(jié)果。許多研究指出，CYP51 在病原菌對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性中發(fā)揮著重要作用。如與野生型菌株相比，ΔCYP51A的稻瘟病菌和禾谷鐮刀菌菌株對(duì)三唑類殺菌劑的敏感性顯著增加；稻瘟病菌的CYP51A基因被敲除后，其對(duì)多種三唑類殺菌劑敏感性提高[24-25]。以病原菌靶標(biāo)CYP51的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，解析其與三唑類殺菌劑互作的分子機(jī)制，有助于進(jìn)一步闡明FocTR4 對(duì)三唑類殺菌劑敏感性差異的機(jī)制。FocTR4 的3 個(gè)CYP51 中，CYP51-3 和 鐮 刀 菌Fusarium musae的CYP51B 氨基酸序列一致性高達(dá)98.67%[30]，在已報(bào)道的絲狀真菌中，CYP51B被認(rèn)為主要負(fù)責(zé)編碼甾醇14α-脫甲基酶[31]?；诖?，本研究選取了CYP51-3氨基酸序列進(jìn)行同源建模，并進(jìn)一步對(duì)4 種殺菌劑與靶標(biāo)CYP51-3的分子對(duì)接模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，4 種殺菌劑與CYP51 的結(jié)合自由能分別為－33.79 kJ/mol（丙硫菌唑）、－34.92 kJ/mol（戊唑醇）、－34.08 kJ/mol（腈菌唑）和－36.59 kJ/mol（丙環(huán)唑），其中CYP51與丙環(huán)唑的親和力最強(qiáng)，與丙硫菌唑的親和力最弱，但不同殺菌劑之間的結(jié)合自由能無顯著性差異。因此本研究進(jìn)一步采用SPR手段對(duì)4種殺菌劑與CYP51蛋白進(jìn)行親和力檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種殺菌劑均顯示出較好的結(jié)合力。與分子對(duì)接結(jié)果相一致，與戊唑醇和丙環(huán)唑相比，丙硫菌唑與CYP51的結(jié)合模式不同，表現(xiàn)為“快上快下”模式，且結(jié)合能力較弱，其親和動(dòng)力常數(shù)為2.87×10－7mol/L。該結(jié)果與對(duì)CYP51基因表達(dá)量的研究結(jié)論一致，丙硫菌唑?qū)YP51-1和CYP51-3基因表達(dá)的誘導(dǎo)水平顯著小于戊唑醇和丙環(huán)唑。4種殺菌劑中，丙硫菌唑的作用效果優(yōu)于其他3種殺菌劑。推測(cè)原因可能是與其他三唑類殺菌劑相比，丙硫菌唑與CYP51的作用方式存在特異性，戊唑醇和丙環(huán)唑是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，而丙硫菌唑是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。PARKER等[32]的研究結(jié)果表明，當(dāng)戊唑醇、三唑醇、丙環(huán)唑與禾生球腔菌（Mycosphaerella graminicola）的CYP51（MgCYP51）緊密結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生強(qiáng)的Ⅱ型差異光譜（峰值在423～429 nm 波長(zhǎng)處，波谷在406～409 nm波長(zhǎng)處），表明形成了典型的低自旋六配位體復(fù)合物。而丙硫菌唑和MgCYP51蛋白質(zhì)的結(jié)合具有不同的吸收峰，且結(jié)合能力比戊唑醇等其他殺菌劑低800多倍[32]，該研究結(jié)果也很好地證實(shí)了上述推測(cè)。

與其他三唑類殺菌劑相比，丙硫菌唑具有更廣譜的殺菌活性。硫酮結(jié)構(gòu)的引入賦予了丙硫菌唑獨(dú)特的性能以及良好的內(nèi)吸活性。因此，丙硫菌唑?qū)τ谙憬犊菸〉姆乐涡Ч档眠M(jìn)一步的探究，這對(duì)于擴(kuò)大丙硫菌唑的應(yīng)用范圍和高效防治香蕉枯萎病具有重要意義。在此基礎(chǔ)上，本課題組下一步的研究工作將對(duì)FocTR4 的CYP51基因進(jìn)行突變，探究其與三唑類殺菌劑互作中發(fā)揮作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，以期為香蕉枯萎病的田間防治提供理論支持。