王海強(qiáng)，張巖，葉莊新，卓繼沖，張傳溪，李俊敏，陳劍平

（寧波大學(xué)植物病毒學(xué)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和浙江省植物保護(hù)生物技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315211）

negevirus（nege-like virus）是 一 類 正 義 單 鏈RNA病毒，在自然界中廣泛分布，主要侵染昆蟲綱、甲殼綱等節(jié)肢動物，是近幾年新增的一個病毒分類單元。negeviruses 的基因組一般由9 000～10 000個核苷酸（nucleotide, nt）組成，包含至少3 個開放閱讀框（open reading frame, ORF）。ORF1 最長，靠近病毒基因組的5′末端，一般包含4 個保守結(jié)構(gòu)域：病毒甲基轉(zhuǎn)移酶（viral methyltransferase, vMet）結(jié)構(gòu)域、RNA 核糖體甲基轉(zhuǎn)移酶（RNA ribosomal methyltransferase, FtsJ）結(jié)構(gòu)域、RNA 病毒解旋酶（viral helicase, Hel）結(jié)構(gòu)域以及RNA 依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）結(jié)構(gòu)域。ORF2 和ORF3 則分別編碼糖蛋白DISBORF2_chro 和膜蛋白SP24[1-2]。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，negeviruses 在進(jìn)化過程中形成了2 個不同的分支，分別為nelorpivirus和sandewavirus[3]。前人的研究表明，部分昆蟲中negeviruses 的ORF1 不編碼FtsJ，還 有 一 些 新 鑒 定 的negeviruses 的ORF1 和ORF2存在重疊區(qū)域[4-7]。

在昆蟲細(xì)胞中，RNA病毒的自我復(fù)制會誘發(fā)宿主的RNA 干擾抗病毒免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生靶向RNA病毒基因組的病毒來源的干擾小RNA（virusderived small interfering RNA,vsiRNA）。vsiRNA由昆蟲宿主的Dicer 酶切割產(chǎn)生，其長度主要為21～22 nt，而且vsiRNA 的5′末端核苷酸常為腺嘌呤（adenine, A）和尿嘧啶（uracil, U）[8]。不同長度的vsiRNA在病毒基因組的分布不具有鏈特異性，但是會形成明顯的熱點區(qū)域[8]。negeviruses 侵染雙翅目的糞蠅、半翅目的蚜蟲及粉虱等多種昆蟲后，均能在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量vsiRNA，且長度偏好性、正負(fù)義鏈比例及5′末端核苷酸分布等均具有典型昆蟲宿主Dicer酶的切割特征，表明negeviruses在宿主細(xì)胞中的復(fù)制十分活躍[4,7,9]。

傳統(tǒng)的RNA 病毒鑒定主要依賴于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）和血清學(xué)檢測等方法，但這些方法主要針對已知病毒的鑒定[10]。對于未知的新病毒，之前主要是對病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)并通過電子顯微鏡觀察完成鑒定，但這些方法具有局限性，且很難在較短時間內(nèi)完成[10]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以第二代高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)的病毒宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為新病毒的鑒定提供了新方案，該技術(shù)可以一次性測定樣品中所有的轉(zhuǎn)錄本，包括RNA病毒通過復(fù)制產(chǎn)生的全長基因組。基于宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的新病毒鑒定方案，通過對測序數(shù)據(jù)的處理、分析，從而鑒定樣品中的病毒序列，進(jìn)一步結(jié)合Sanger 測序、cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends,RACE）及系統(tǒng)發(fā)育分析等方法，完成新病毒的鑒定及全長基因組的獲取。

黑守瓜（Aulacophora lewisii）是一種鞘翅目葉甲科的農(nóng)業(yè)害蟲，主要危害瓜類蔬菜。黑守瓜成蟲在土壤中產(chǎn)卵，幼蟲主要危害瓜類蔬菜根部，成蟲則以瓜類蔬菜的葉、莖、花、果實為食[11]。2021年，本實驗室利用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在黑守瓜中鑒定到一種新的昆蟲特異性病毒Aulacophora lewisii iflavirus 1[12]。基于此，本研究繼續(xù)以黑守瓜為試驗對象，通過宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)鑒定并獲得了黑守瓜中一種新的negevirus，測定該病毒的基因組全長，并對其基因組結(jié)構(gòu)、分類地位及病毒來源的干擾小RNA（vsiRNA）等作出進(jìn)一步分析。

1 材料與方法

1.1 昆蟲樣品采集和RNA 提取

黑守瓜采集于浙江省溫州市某黃瓜田塊（葉片），將單頭黑守瓜活蟲直接置于液氮中，并使用Trizol試劑盒（RNAiso Plus，日本TaKaRa公司）提取黑守瓜的總RNA（提取方法參考上述試劑盒說明書）?？俁NA經(jīng)質(zhì)控檢測合格后，分成3份，分別用于轉(zhuǎn)錄組測序、小RNA提取和測序、病毒序列驗證。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

黑守瓜總RNA 利用Illumina HiSeq 4000 平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。原始序列數(shù)據(jù)（raw data）利用Trimmomatic 0.39 軟件進(jìn)行質(zhì)控（去除低質(zhì)量序列和接頭序列），再利用Trinity 2.8.5 軟件對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行無參考基因組組裝（de-novo組裝）[13]，得到樣品的轉(zhuǎn)錄組拼接序列（Contigs）。使用Trinity 2.8.5 提供的腳本（Trinity_stats.pl）統(tǒng)計轉(zhuǎn)錄本N50（Contig N50）以對轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量進(jìn)行評估。

1.3 昆蟲宿主物種鑒定

利用BLASTn工具將拼接好的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與生命條形碼數(shù)據(jù)庫（Barcode of Life Data System,BOLD；https://www.boldsystems.org/）進(jìn)行同源性比對。將比對上的昆蟲線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome oxidase subunitⅠ,COⅠ）基因與NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中非冗余核酸庫（Non-Redundant Nucleotide Sequence Database,NT）進(jìn)行比對，以明確和驗證具體的昆蟲物種。

1.4 黑守瓜中新病毒的鑒定

下載NCBI 上所有病毒的最新蛋白序列信息（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses）并構(gòu)建本地病毒數(shù)據(jù)庫，利用拼接好的轉(zhuǎn)錄本作為種子序列與該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對（DIAMOND BlastX 0.9.28.129軟件）。將鑒定到的潛在病毒的Contigs序列同時與NCBI 的非冗余蛋白庫（Non-Redundant Protein Sequence Database,NR）及NT庫進(jìn)行同源性比對以明確病毒序列。

1.5 病毒基因組確認(rèn)及全長序列獲取

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中鑒定到的新病毒Contigs序列設(shè)計特異性引物，引物序列見表1。使用預(yù)混液形式的2步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑（去基因組）［HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)］（購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司），利用黑守瓜的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，利用凝膠DNA 小量回收試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］進(jìn)行回收、連接轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物送至杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行Sanger 測序。使用RACE 試劑盒（SMARTer?RACE 5′/3′ Kit，日本TaKaRa 公司）通過cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）克隆新病毒基因組5′末端和3′末端的缺失序列（RACE 引物序列見表1）。根據(jù)RACE 以及Sanger 測序得到不同序列的重疊區(qū)，利用多序列比對方法對其進(jìn)行拼接，以得到完整的新病毒基因組序列。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 病毒基因組序列分析

利用Expasy 在線網(wǎng)站（https://web.expasy.org/translate）預(yù)測病毒基因組各個ORF，并在InterProScan網(wǎng)站（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence）上注釋不同ORF 所編碼的相應(yīng)蛋白。同時，使用Bowtie2 2.3.5.1 軟件將高通量測序質(zhì)控得到的原始讀長（reads）回貼到明確的病毒基因組全長序列中，并利用R語言4.1.3對結(jié)果進(jìn)行可視化，得到病毒基因組在宿主體內(nèi)的表達(dá)豐度。

表1（續(xù)） Continuation of Table 1

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MAFFT 7.487 軟件對新鑒定病毒的RdRp序列與已報道的negeviruses 的RdRp 序列進(jìn)行多序列比對[14]，利用ModelTest-NG軟件對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的模型進(jìn)行預(yù)測和評估[15]，最后利用RAxML-NG軟件基于最大似然法（maximum likelihood, ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將進(jìn)化樹的自展值（bootstrap）設(shè)置為1 000[16]。

1.8 小RNA 分析

利用小RNA 文庫構(gòu)建試劑盒（Illumina TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit）構(gòu) 建 用 于 小RNA 測序的文庫，將文庫置于Illumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行單端測序。數(shù)據(jù)下機(jī)后，對小RNA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控（去除低質(zhì)量序列、接頭序列等），再使用Bowtie 1.2.3軟件將小RNA數(shù)據(jù)回貼到已明確的病毒全基因組中（不允許錯配）。在此基礎(chǔ)上參照先前報道的方法，使用Perl腳本對小RNA數(shù)據(jù)進(jìn)行特征分析并對結(jié)果進(jìn)行可視化[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序與數(shù)據(jù)質(zhì)控

田間采集到的疑似黑守瓜單頭樣品經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序，共得到21 514 793 個原始讀長（reads）。對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，獲得21 084 498 個高質(zhì)量讀長（clean reads），進(jìn)一步使用Trinity 2.8.5軟件進(jìn)行denovo組裝得到104 125 條拼接的轉(zhuǎn)錄本Contigs 序列。轉(zhuǎn)錄組組裝預(yù)測基因的平均序列長度為1 700 nt，Contig N50為1 499 nt。

2.2 黑守瓜中一種新negevirus 的鑒定

將組裝好的Contigs 在BOLD 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，提取對應(yīng)的昆蟲COⅠ序列并與在線的NCBI NT 庫比對，發(fā)現(xiàn)該序列與已報道的黑守瓜COⅠ序列（NC_039712.1）有99.82%的序列同源性，明確了該昆蟲物種為黑守瓜（A.lewisii）。

進(jìn)一步利用拼接好的黑守瓜Contigs 與構(gòu)建的本地病毒數(shù)據(jù)庫作同源性比對，發(fā)現(xiàn)黑守瓜中有一個Contig（長度為8 585 nt）與已報道的nege-like virus 病毒Hangzhou merodon fulcratus virga-like virus 1（UHK03236.1）同源性最高（36.33%），表明該Contig可能是黑守瓜中一種新的negevirus。隨后利用RT-PCR、RACE 及Sanger 測序明確了該病毒的基因組全長為9 832 nt，GC 含量為34.26%（附圖1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2022.06.293）。我們將新鑒定的病毒命名為Nbu Aulacophora lewisii nege-like virus 1（NbuALNV-1）。NbuALNV-1 的基因組序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫（登錄號：ON442311）。

2.3 NbuALNV-1 序列分析

NbuALNV-1的基因組包含6個ORFs，其5′末端和3′末端各有1 個非翻譯區(qū)（untranslated region,UTR），5′UTR 的長度為292 nt，3′UTR 的長度為77 nt（圖1）。對NbuALNV-1不同ORF的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明：靠近病毒基因組5′末端的ORF1包含3 個保守結(jié)構(gòu)域，即病毒甲基轉(zhuǎn)移酶（vMet）結(jié)構(gòu)域、RNA 病毒解旋酶（Hel）結(jié)構(gòu)域和RNA 依賴的RNA 聚合酶（RdRp）結(jié)構(gòu)域，ORF2 具有糖蛋白DISB-ORF2_chro 結(jié)構(gòu)域，ORF4 則編碼一個預(yù)測的膜蛋白SP24（圖1）。分析結(jié)果表明，NbuALNV-1具有典型的negeviruses保守結(jié)構(gòu)域，與先前昆蟲中報道的結(jié)果[5]一致。為明確NbuALNV-1在黑守瓜中的豐度，將質(zhì)控后的高質(zhì)量讀長（clean reads）回貼到NbuALNV-1基因組，結(jié)果表明，NbuALNV-1來源的讀長（reads）大多聚集在病毒基因組的3′末端，而5′末端及其他位置的病毒豐度相對較低（圖1）。

圖1 NbuALNV-1的基因組結(jié)構(gòu)與讀長覆蓋度Fig.1 Genome structure and reads coverage of NbuALNV-1

2.4 NbuALNV-1 與其他negeviruses 的同源性比對和分析

為了分析NbuALNV-1 與其他negeviruses 的同源性，使用NbuALNV-1的RdRp氨基酸序列與已報道的nege/nege-like virus 相應(yīng)RdRp 序列進(jìn)行同源性比對。結(jié)果（表2）表明，NbuALNV-1與部分已報道的nege/nege-like virus 的序列同源性為26.2%～35.8%。從圖2 中可知，NbuALNV-1、nege/nege-like virus 及植物病毒北島病毒科（Kitaviridae）的RdRp氨基酸序列中均含有保守的同源序列，包括3 個基序，模式分別為GDD（基序A）、DX（4-5）D（基序B）和GX（2-3）TX（3）N（基序C）。

圖2 nege/nege-like virus與NbuALNV-1的RdRp氨基酸序列同源性比對分析Fig.2 Homology alignment analysis based on RdRp amino acid sequences of nege/nege-like virus and NbuALNV-1

表2 NbuALNV-1與已報道的negeviruses RdRp氨基酸序列的同源性Table 2 Homology of RdRp amino acid sequences among NbuALNV-1 and reported negeviruses

2.5 NbuALNV-1 的分類地位

為進(jìn)一步分析NbuALNV-1與之前報道的nege/nege-like virus 之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，利用它們的RdRp 氨基酸序列進(jìn)行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：NbuALNV-1 并未與已報道的2 個negeviruses 分支類群（sandewavirus 和nelorpivirus）聚合在一起，而是與另外3 種昆蟲特異性病毒（Hubei Wuhan insect virus 9、Aphis glycines virus 3和Fort Crockett virus）聚合，形成了一個獨立分支（unclassified）。值得一提的是，該分支與植物病毒北島病毒科（Kitaviridae）的病毒聚合在一起（圖3），表明昆蟲病毒和植物病毒在進(jìn)化上具有較近的親緣關(guān)系。

圖3 已報道的nege/nege-like virus與NbuALNV-1的RdRp氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（基于最大似然法）Fig.3 Phylogenetic tree of RdRp amino acid sequences of NbuALNV-1 and reported nege/nege-like virus based on the maximum likelihood

2.6 NbuALNV-1 來 源 的 干 擾 小RNA 分 析

本研究進(jìn)一步對NbuALNV-1病毒來源的干擾小RNA（vsiRNA）進(jìn)行分析，通過小RNA 測序共獲得了2 640 965 個小RNA 序列，其中6 622 個為NbuALNV-1 來源的vsiRNA。進(jìn)一步的分析結(jié)果表明，NbuALNV-1 產(chǎn)生的vsiRNA 長度主要為21 nt，且源于病毒基因組正義鏈及其互補(bǔ)鏈（負(fù)義鏈）的vsiRNA 數(shù)量基本一致（圖4A）。這些vsiRNA 在NbuALNV-1 基因組的各個位置均勻分布，且無明顯的正負(fù)義鏈偏好性（圖4B）。此外，NbuALNV-1來源的vsiRNA 5′末端呈現(xiàn)出典型的腺嘌呤（A）和尿嘧啶（U）富集現(xiàn)象（圖4C）。這些結(jié)果均表明NbuALNV-1侵染黑守瓜后能成功誘發(fā)宿主基于小RNA的RNA干擾抗病毒免疫反應(yīng)。

圖4 NbuALNV-1來源的vsiRNA分析Fig.4 Analysis of NbuALNV-1 derived vsiRNA

3 討論

基于高通量測序技術(shù)的病毒宏轉(zhuǎn)錄組為新病毒的鑒定提供了一種快速、高效的方法。本研究利用病毒宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)從黑守瓜中鑒定到一種新的negevirus（NbuALNV-1），其全基因組大小為9 832 nt，具有6個ORFs且包含多個negeviruses保守結(jié)構(gòu)域。目前在其他昆蟲中鑒定到的negeviruses 一般包含3～4 個ORFs，表明自然界中negeviruses 的基因組結(jié)構(gòu)存在多樣性[1,6]。另外，部分已報道的negeviruses ORF1中還具有一個FtsJ結(jié)構(gòu)域，而黑守瓜中的NbuALNV-1 與蚜蟲中的Indomegoura negelike virus 1類似，未鑒定到該保守結(jié)構(gòu)域，因此其在negeviruses侵染和復(fù)制過程中的作用仍有待進(jìn)一步研究和明確[2,4,6]。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，NbuALNV-1 與已明確的negeviruses的2個類群sandewavirus和nelorpivirus均未聚合在一起，而是與其他昆蟲特異性病毒聚合形成一個新的獨立分支，表明NbuALNV-1 可能是negeviruses中的一個新類群，同時，隨著昆蟲中新的negeviruses 類群不斷被鑒定出來，可能還有更多類群需要進(jìn)一步被明確。

基于干擾小RNA（small interfering RNA,siRNA）的抗病毒通路是節(jié)肢動物應(yīng)對外源病毒侵染的主要免疫途徑，該通路的激活在宿主體內(nèi)伴隨著大量vsiRNA的產(chǎn)生[17]。有關(guān)NbuALNV-1來源的siRNA分析結(jié)果顯示，vsiRNA 呈現(xiàn)出典型的昆蟲宿主Dicer 酶切割特點（21～22 nt 的長度偏好性、相近的正負(fù)義鏈比例及5′末端核苷酸的A/U 偏好性），表明NbuALNV-1成功激活了黑守瓜的siRNA抗病毒免疫系統(tǒng)。有意思的是，NbuALNV-1 來源的vsiRNAs 的長度偏好為21 nt，這種長度分布模式和半翅目（如蚜蟲）中negeviruses 的vsiRNAs 不同（以22 nt 為主）[4]，但和已報道的雙翅目（糞蠅）中的vsiRNAs 一致[7]。這些結(jié)果表明，不同目昆蟲中vsiRNAs 的切割機(jī)制可能存在差異，而鞘翅目中的siRNA抗病毒通路在外源病毒侵染過程中的具體機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)從黑守瓜中鑒定出一種新的negevirus，命名為NbuALNV-1，明確了其基因組全長為9 832 nt；并對NbuALNV-1的基因組結(jié)構(gòu)特點、分類地位及產(chǎn)生的vsiRNAs 等特點進(jìn)行了分析和研究。NbuALNV-1是在鞘翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)的首個negevirus，該病毒的鑒定和分析有助于我們進(jìn)一步了解昆蟲中negeviruses 的多樣性，為后續(xù)黑守瓜昆蟲共生病毒的功能研究及其在防控方面的潛在應(yīng)用提供了理論依據(jù)。