徐子妍，李浩，周煥斌，周雪平*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，杭州 310058；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

植物易受到真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲、寄生性植物的侵染脅迫。全球每年因各種病原物和害蟲危害導(dǎo)致水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、大豆（Glycine max）等主要糧食作物產(chǎn)量損失20%～40%，而近半數(shù)的經(jīng)濟(jì)損失由植物病毒病造成，每年高達(dá)300億美元[1]。植物病毒病害因難以防治的特性而素有“植物癌癥”之稱，病害發(fā)生時會嚴(yán)重影響農(nóng)作物的正常生長發(fā)育，使感病植株出現(xiàn)矮化、萎縮、花葉、缺綠、斑駁、壞死、叢簇等癥狀，嚴(yán)重時會導(dǎo)致寄主死亡，影響農(nóng)作物產(chǎn)量與品質(zhì)，威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及糧食安全。多年來，由于缺乏抗性品種及有效的化學(xué)農(nóng)藥，植物病毒病害多以預(yù)防為主，即采用培育無毒種子種苗、清除病株、切斷昆蟲介體傳播途徑等措施，因此開發(fā)廣譜、高效的抗病毒品種是當(dāng)務(wù)之急。

規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白［clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas),CRISPR/Cas］系統(tǒng)是古細(xì)菌或細(xì)菌抵抗病毒以及其他外來遺傳元件的免疫系統(tǒng)。近年來，基于CRISPR/Cas的基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于目的基因敲除、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、堿基編輯、DNA片段插入和替換等多個研究領(lǐng)域[2]。這一革命性的技術(shù)可應(yīng)用于農(nóng)作物糧食增產(chǎn)、品質(zhì)改良、抗性提升等多個育種方向，尤其可以提升農(nóng)作物抵御病原物侵染的能力，減少病原物對農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的危害。

植物病毒基因組根據(jù)構(gòu)成的不同，可分為DNA病毒和RNA病毒。得益于CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已有多種Cas 蛋白可分別靶向DNA病毒序列和RNA病毒序列，通過切割病毒基因組的關(guān)鍵序列，抑制其侵染、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等多個過程，從而提高攜帶CRISPR/Cas 基因編輯材料寄主對病毒的抵抗力。同時，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)還可以靶向寄主因子，通過敲除感病基因來抑制病毒的侵染，亦可提高寄主抗性[3]。此外，植物病毒基因組因相對簡單、方便改裝、易于侵染，也被應(yīng)用于傳遞CRISPR/Cas，完成對寄主靶基因的編輯[4]，該策略可繞開植物組培轉(zhuǎn)化操作，進(jìn)一步節(jié)省人力、物力。最新研究成果顯示，多種病毒已經(jīng)被成功用于遞送核酸酶等大分子物質(zhì)進(jìn)入寄主，縮短了基因編輯周期[5-6]。

1 CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas 是一類來源于細(xì)菌或古細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。由于其具有精準(zhǔn)靶向基因序列的特征，因此被開發(fā)為高效的基因編輯工具。與前兩代的鋅指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFNs）基因編輯技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALENs）基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)工作原理更為簡單，主要通過引導(dǎo)RNA（guide RNA,gRNA）引導(dǎo)Cas 蛋白至特異性位點(diǎn)切割DNA 序列，并通過內(nèi)源的同源定向修復(fù)（homology-directed repair,HDR）和非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）修復(fù)，從而產(chǎn)生堿基的插入或缺失，具有操作門檻低、編輯效率高、成果轉(zhuǎn)化快等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為農(nóng)作物育種、基因功能研究的重要工具[7]。

根據(jù)Cas基因主要元件序列的不同，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)目前被分為2大類［分類1（Class 1）和分類2（Class 2）］，其中Class 1系統(tǒng)（包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型）的基因編輯利用由多個效應(yīng)蛋白組成的復(fù)合物行使功能，而Class 2系統(tǒng)（包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型）僅需一個效應(yīng)蛋白[8]。被廣泛應(yīng)用的CRISPR/Cas9 屬于Class 2系統(tǒng)中的Ⅱ型，僅由gRNA和Cas9蛋白2部分組成。其編輯載體的構(gòu)建步驟非常簡單，只需根據(jù)靶向序列設(shè)計特異性的、長度為19～20 bp的單向?qū)NA（single guide RNA,sgRNA），就可以引導(dǎo)Cas9蛋白到特異性位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)切割。由于Cas蛋白結(jié)合靶序列需要特定的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif,PAM），而CRIPSR/Cas9蛋白只能識別NGG的PAM位點(diǎn)，無法識別其他位點(diǎn)，這極大地限制了其應(yīng)用范圍。因此，通過開發(fā)多種CRIPSR/Cas9的變體及同源蛋白來拓寬其在動植物中的編輯范圍很有必要。如Cas9 變體CRIPSR/Cas9-NG、SpCas9-EQR、SpCas9-VQR、SpCas9-VEQR、SpCas9/SpG、SpCas9/SpRY 等能夠識別NGN、NGAG、NGA、NGCG、NGN、NNN的PAM位點(diǎn)[9]；同時，Cas9的同源蛋白SaCas9（金黃色葡萄球菌，Staphylococcus aureus）、ScCas9（犬 鏈 球 菌，Streptococcus canis）、St1Cas9（嗜熱鏈球菌，Streptococcus thermophiles）、BlatCas9（側(cè)孢短芽孢桿菌，Brevibacillus laterosporus）等能夠有效識別NNG、NNGRRT、NNAGAW、NNNCND的PAM位點(diǎn)[9]。

此外，以CRISPR/Cas12 為代表的新型基因編輯技術(shù)也應(yīng)運(yùn)而生。CRISPR/Cas12 屬于Class 2 系統(tǒng)中的Ⅴ型[10]，僅由源于CRISPR 的RNA（CRISPRderived RNA,crRNA）和Cas蛋白2部分組成并發(fā)揮作用。與Cas9相比，Cas12蛋白具有分子量更小、分子之間連接更緊湊、脫靶效率更低并且能夠識別富含T的PAM等優(yōu)點(diǎn)。這些CRISPR系統(tǒng)大大拓展了科研工作者的基因編輯工具箱，豐富了其在植物基因編輯中的應(yīng)用。

以上所述Cas 蛋白均靶向DNA 序列，無法對RNA 序列進(jìn)行編輯。2016 年，ABUDAYYEH 等首次報道了一種新的Cas蛋白，命名為Cas13a，它屬于Class 2系統(tǒng)中的Ⅵ型蛋白[11]。與Cas12類似，Cas13a同樣由crRNA和Cas蛋白2部分組成并發(fā)揮編輯功能[12]。其工作原理與其他編輯系統(tǒng)相似，通過crRNA 將Cas13a 引導(dǎo)至RNA 序列特定位點(diǎn)進(jìn)行編輯。這套系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對RNA序列的編輯，在更好地研究生物體內(nèi)RNA的各種調(diào)控作用，尤其是在植物寄主中RNA 病毒的防控以及農(nóng)作物育種等研究方向上具有里程碑式意義。

除了天然的Cas 蛋白核酸酶，經(jīng)過改造的Cas9蛋白（dCas9和nCas9）也被廣泛用于單堿基編輯、引導(dǎo)編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。CRISPR/Cas介導(dǎo)的堿基編輯技術(shù)可在動植物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效的單堿基替換，它由dCas9和胞嘧啶脫氨酶或者腺嘌呤脫氨酶組成，從而能實(shí)現(xiàn)從C→T 或者從A→G 的替換[13]。與HDR 相比，堿基編輯技術(shù)不需要DNA雙鏈斷裂以及供體模板即可實(shí)現(xiàn)高效的單堿基替換，對編輯對象尤其是在提高農(nóng)作物抗性的同時對其農(nóng)藝性狀影響更小，因此，在未來的作物育種研究中單堿基編輯的可操作性更強(qiáng)。此外，利用dCas9攜帶甲基化、去甲基化等相關(guān)基因核心元件，在不切割基因序列的情況下，可以將該元件靶向至定點(diǎn)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)精確的甲基化修飾等過程，調(diào)控基因開關(guān)，實(shí)現(xiàn)定向調(diào)控。

目前，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)已被應(yīng)用于包括水稻、番茄（Solanum lycopersicum）、玉米、小麥等多種農(nóng)作物的性狀改良、抗性提升等研究中，給未來農(nóng)作物基因功能研究以及作物育種帶來了更多的可能性，尤其是單堿基編輯技術(shù)的開發(fā)，將為多種農(nóng)藝性狀精確矯正、作物增產(chǎn)、病蟲害防治帶來曙光。

2 基因編輯技術(shù)在植物抗病毒研究中的應(yīng)用

目前，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)不僅被應(yīng)用于植物基因組編輯工作，而且已被廣泛用于植物抗病毒工程研究中，是除傳統(tǒng)抗病毒策略外最具發(fā)掘潛力和技術(shù)優(yōu)勢的抗病毒手段，對于后續(xù)抗病毒育種研究具有重要的指導(dǎo)意義。根據(jù)編輯對象的不同，目前利用CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)防治病毒的主要策略可以分為2種：一是攜帶CRISPR/Cas的寄主直接靶向病毒基因序列，通過破壞病毒功能性序列來抵抗病毒侵染；二是病毒若要成功侵染植物并進(jìn)行復(fù)制、增殖，則需要利用多種寄主內(nèi)源基因協(xié)助其完成侵染、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、組裝等整個過程，因此可通過靶向此類寄主植物的內(nèi)源基因，以阻礙病毒侵染、復(fù)制、增殖等多個環(huán)節(jié)，從而達(dá)到抵抗病毒、降低病毒積累量的目的（圖1和表1）。

表1 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)在植物抗病毒中的應(yīng)用Table 1 Application of CRISPR/Cas gene editing technology on plant resistance to viruses

表1（續(xù)） Continuation of Table 1

圖1 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)應(yīng)用下的抗病毒策略Fig.1 Antiviral strategy under the application of CRISPR/Cas gene editing technology

2.1 靶向病毒基因組

2.1.1 DNA 病毒

在植物中，根據(jù)基因組核酸的不同，DNA 病毒可分為雙鏈DNA 病毒和單鏈DNA 病毒。其中，雙鏈DNA 病毒比較少見，主要為花椰菜花葉病毒科（Caulimoviridae）病毒，該病毒科寄主范圍較窄，主要侵染花椰菜（Brassica oleracea)、大豆、水稻等。該病毒科代表種花椰菜花葉病毒屬于花椰菜花葉病毒屬（Caulimovirus），主要由蚜蟲以半持久性方式傳播，也能以機(jī)械方式傳播接種[14]。單鏈DNA病毒以雙生病毒科（Geminiviridae）研究最為廣泛，該病毒科在全世界范圍內(nèi)廣泛存在，能夠侵染禾本科（Gramineae）、茄科（Solanaceae）、葫蘆科（Cucurbitaceae）和豆科（Leguminosae）等多種重要農(nóng)作物，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，對我國乃至世界的農(nóng)業(yè)發(fā)展及糧食安全帶來重大打擊[15]。雙生病毒以滾環(huán)復(fù)制的方式進(jìn)行增殖，即以單鏈DNA 為模板，形成閉合環(huán)狀雙鏈DNA 中間體，并以此進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增子代DNA來進(jìn)行增殖，多通過粉虱科（Aleyrodidae）、蚜總科（Aphidoidea）、葉蟬科（Cicadellidae）等昆蟲介體進(jìn)行傳播。為了抵抗雙生病毒對植物引起的病害，JI等針對甜菜嚴(yán)重曲頂病毒（beet severe curly top virus,BSCTV）基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)設(shè)計了43個靶標(biāo)位點(diǎn)，通過瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明不同靶標(biāo)位點(diǎn)的病毒積累量都不同程度地減少，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)sgRNA/Cas9 轉(zhuǎn)基因的擬南芥（Arabidopsis thaliana）和本氏煙（Nicotiana benthamiana）對BSCTV 表現(xiàn)出高度抗性[16]。BALTES等在煙草中針對菜豆黃矮病毒（bean yellow dwarf virus,BeYDV）基因組的復(fù)制起始蛋白（replication initiator protein, Rep）多個結(jié)合位點(diǎn)和滾環(huán)復(fù)制所必需的3 個Rep 基序（基序Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）設(shè)計了11 個靶標(biāo)位點(diǎn)，使得本氏煙中的病毒積累量降低了87%，從而賦予了植物對BeYDV的抗性[17]。ALI等針對病毒的衣殼蛋白（coat protein, CP）、Rep 和基因間隔區(qū)（intergenic region,IR）設(shè)計了sgRNA，結(jié)果顯示：靶向番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的IR區(qū)域能夠顯著降低病毒積累量，減輕病害癥狀；雙生病毒的IR區(qū)域存在保守的TAATATAC序列，通過設(shè)計針對該保守序列的IR-sgRNA，能夠同時靶向TYLCV、甜菜曲頂病毒（beet curly top virus,BCTV）和魚黃草花葉病毒（merremia mosaic virus, MeMV）基因組，從而獲得抵御多種病毒侵染的廣譜抗性[18]。使用類似的方法，穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白靶向木爾坦棉花曲葉病毒（cotton leaf curl Multan virus, CLCuMuV）編碼的C1蛋白和IR區(qū)域的雙gRNA 轉(zhuǎn)基因煙草被賦予對該病毒侵染的抵抗能力[19]。KHAN等獲得了表達(dá)dCas9-sgRNA的轉(zhuǎn)基因本氏煙材料，驗(yàn)證結(jié)果表明，在沒有切割基因組的情況下該材料能夠有效抑制棉花曲葉病毒（cotton leaf curl virus,CLCuV）的復(fù)制[20]。此種策略同時在大麥（Hordeum vulgare）、番茄、香蕉（Gonja manjaya）的抗病毒工程研究中得到了檢驗(yàn)，在不同寄主中分別針對小麥矮縮病毒（wheat dwarf virus, WDV）[21]、TYLCV[22]和香蕉線條病毒（banana streak virus,BSV）[23]等病毒基因組設(shè)計特異性sgRNA進(jìn)行定點(diǎn)靶向，達(dá)到了阻礙病毒復(fù)制、減少病毒積累量的目的。

有研究表明，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對雙生病毒的編碼區(qū)和非編碼區(qū)表現(xiàn)出不同的編輯效率，且不同雙生病毒編碼區(qū)的同源定向修復(fù)非常高效，因此通過靶向病毒的編碼區(qū)，可能會引起病毒重組形成新的病毒變體，從而逃避CRISPR/Cas9 的識別與編輯。MEHTA 等[24]通過靶向非洲木薯花葉病毒（African cassava mosaic virus,ACMV）的AC2 和AC3蛋白編碼序列獲得了Cas9轉(zhuǎn)基因木薯材料，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組并沒有表現(xiàn)出明顯的抗性，進(jìn)一步測序發(fā)現(xiàn)，有33%～48%的被編輯病毒在靶標(biāo)識別位點(diǎn)進(jìn)化出1 個保守的單核苷酸突變，并通過這種突變逃避sgRNA的識別，避免被CRISPR/Cas9切割。這種病毒通過突變逃避編輯的現(xiàn)象需引起科研工作者在抗病毒工程研究中對基因編輯技術(shù)的重視。

2.1.2 RNA 病毒

根據(jù)基因組的不同，RNA病毒可分為單鏈RNA（single-stranded RNA, ssRNA）和雙鏈RNA（doublestranded RNA, dsRNA）病毒。其中，ssRNA 病毒進(jìn)一步可以分為正義ssRNA（+ssRNA）病毒和負(fù)義ssRNA（－ssRNA）病毒[14]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白突變體以及Cas13蛋白能夠切割RNA鏈，據(jù)此利用CRISPR/FnCas9 針對黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus,CMV）和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的基因組設(shè)計了sgRNA，并獲得了穩(wěn)定遺傳的煙草和擬南芥，其后代病毒感染癥狀顯著減弱，病毒積累量顯著減少[25]。此外，利用CRISPR/Cas13a對融合綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）作為熒光標(biāo)簽的蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus,TuMV）基因組進(jìn)行靶向發(fā)現(xiàn)，編輯病毒基因組的不同區(qū)域均有效降低了GFP表達(dá)量，同時減少了系統(tǒng)葉片中TuMV-GFP RNA基因組的積累，干擾了TuMV 病毒的復(fù)制和傳播[26-27]。ZHANG 等[28]利用CRISPR/Cas13a（LshCas13a）在雙子葉植物煙草中靶向TMV RNA基因組的同時，賦予單子葉植物水稻對南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）和水稻條紋花葉病毒（rice stripe mosaic virus,RSMV）的抗性。而利用CRISPR/Cas13a 編輯馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y, PVY）基因組的保守編碼區(qū)，其轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)出對多種PVY變體的廣譜抗性[29]。

2.2 靶向宿主植物內(nèi)源基因

植物病毒除編碼復(fù)制酶外，并不編碼其他復(fù)制相關(guān)蛋白，因此需要依賴于宿主植物復(fù)制相關(guān)因子完成自身復(fù)制。此外，病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯及移動也需要寄主因子進(jìn)行協(xié)作，而這些基因大多為植物感病基因，因此可以通過編輯該類基因抑制病毒復(fù)制等環(huán)節(jié)，進(jìn)一步減少病毒積累量，降低致病性。2002年，研究人員在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)了由真核翻譯起始因子4E（eukaryotie translation initiation factor 4E,eIF4E）介導(dǎo)的隱形抗病毒基因，eIF(iso)4E突變體表現(xiàn)出對煙草蝕刻病毒（tobacco etch virus,TEV）的高抗性[30]。辣椒（Capsicum annuum）、野番茄（Solanum habrochaites）、萵苣（Lactuca sativa）、甜瓜（Cucumis melo）、水稻和大麥中的eIF4E也可獲得對馬鈴薯病毒的抗性。此外，eIF4E還介導(dǎo)寄主對多種病毒的抗性，例如黃瓜花葉病毒、蕪菁皺縮病毒（turnip crinkle virus,TCV）、甜瓜壞死斑病毒（melon necrotic spot virus, MNSV）、大麥黃花葉病毒（barley yellow mosaic virus, BYMV）、大麥輕度花葉病毒（barley mild mosaic virus,BaMMV）和水稻黃斑駁病毒（rice yellow mottle virus,RYMV）。

2016 年，CHANDRASEKARAN 等[31]首次利用CRISPR/Cas9 對黃瓜（Cucumis sativus）的eIF4E基因進(jìn)行敲除，獲得的T3代非轉(zhuǎn)基因純合突變體對黃瓜脈黃化病毒（cucumber vein yellow virus,CVYV）、小西葫蘆黃花葉病毒（zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）和番木瓜環(huán)斑病毒（papaya ring spot virus,PRSV）具有廣譜抗性。此外，利用CRISPR/Cas9 對擬南芥中的eIF4E進(jìn)行突變，其突變體對TuMV具有抗性[32]；水稻中的eIF(iso)4E進(jìn)行突變后可抵御水稻東格魯球狀病毒（rice tungro spherical virus,RTSV）侵染[33]。GOMEZ等利用CRISPR/Cas9同時對木薯中的eIF4E異構(gòu)體nCBP-1和nCBP-2進(jìn)行敲除，此舉措增強(qiáng)了植株對木薯褐色線條病毒（cassava brown streak virus,CBSV）的抗病能力[34]。

eIF4E基因在植物的翻譯起始過程中發(fā)揮著重要作用，且eIF4E家族存在高度功能冗余，馬鈴薯病毒能夠選擇性地利用eIF4E基因或eIF(iso)4E基因或兩者兼用來完成增殖過程，因此敲除其中一個基因不足以讓植物產(chǎn)生高度抗性，只有同時敲除多個eIF4E基因才能賦予植物最強(qiáng)的抗病毒能力，但同時也會顯著影響植物的正常生長發(fā)育[35]。挖掘天然抗性等位基因的關(guān)鍵位點(diǎn)，在賦予植物廣譜抗病毒能力的同時不影響植物的生長發(fā)育尤為重要，這也對植物抗病毒育種提出了更高要求。2019 年，BASTET等利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的堿基編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了將擬南芥中eIF4E中的第176位天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?，從而獲得了對三葉草黃脈病毒（clover yellow vein virus, ClYVV）具有抗性且正常生長發(fā)育的遺傳材料，彌補(bǔ)了無法對eIF4E多基因進(jìn)行編輯的空缺[36]。

卡哈爾體（Cajal bodies, CBs）是真核細(xì)胞中獨(dú)特的亞核結(jié)構(gòu)，通常與核仁功能相關(guān)。CBs在RNA代謝、轉(zhuǎn)錄、剪接，核糖體生物合成以及端粒維持的核糖核蛋白（ribonucleoprotein,RNP）形成中發(fā)揮著重要作用，同時CBs 還參與細(xì)胞周期、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。而Colin 作為卡哈爾體的特征蛋白，是其形成和維持功能活性所必需的結(jié)構(gòu)支架蛋白，并且Colin 蛋白能夠促進(jìn)PVY 病毒的復(fù)制，增強(qiáng)其致病性。MAKHOTENKO等通過基因槍將CRISPR/Cas9-sgRNA 遞送到馬鈴薯的頂端分生組織以對Colin基因進(jìn)行編輯，其突變體后代對PVY 的抗病性有所提高[37]。

由大豆花葉病毒（soybean mosaic virus, SMV）引起的大豆花葉病是限制全球大豆產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要病害之一。大豆異黃酮合酶（Glycine maxisoflavones synthase, GmIFS）的多態(tài)性可引起大豆異黃酮積累量的增加，增強(qiáng)寄主對SMV 抗性[38]。ZHANG 等利用CRISPR/Cas9 同時對大豆中的GmF3H1、GmF3H2和GmFNSII-1基因進(jìn)行敲除，提高了大豆異黃酮的積累量，3 靶點(diǎn)突變體大豆對SMV抗性提升[39]。

番茄褐色皺果病毒（tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV）是煙草花葉病毒屬中的一種新興病毒，2014 年在中東地區(qū)被首次報道，目前已在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。鑒于其對番茄種植產(chǎn)業(yè)造成的巨大危害，2021 年被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》（http://www.zys.moa.gov.cn/flfg/201904/t20190428_6245344.htm），因此，創(chuàng)制出抗ToBRFV 的新型種質(zhì)資源迫在眉睫。擬南芥中編碼的TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION1（TOM1）基因是煙草花葉病毒屬病毒復(fù)制和增殖所必需的，其突變后能顯著抑制TMV 的積累。ISHIKAWA 等[40]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對番茄中TOM1的同源基因進(jìn)行敲除，賦予了番茄對ToBRFV的抗性。

3 植物病毒遞送CRISPR 元件的建立與優(yōu)化

隨著對植物病毒基因組功能以及植物與病毒互作機(jī)制的深入研究，多種植物病毒已被成功開發(fā)為生物技術(shù)研究工具。寄主植物本身對病毒具有遺傳免疫機(jī)制，根據(jù)其轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing, PTGS）的機(jī)制可以令病毒攜帶寄主的基因片段，在病毒侵染激活寄主自身免疫系統(tǒng)降解病毒RNA 的同時也可以降解目的基因的微RNA（microRNA），達(dá)到識別并抑制該基因表達(dá)的目的。煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）能夠侵染50 科400 多種寄主，介導(dǎo)本氏煙、番茄等多種寄主植物發(fā)生病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virusinduced gene silencing, VIGS）。目前，多種植物病毒已被證實(shí)可作為RNA沉默載體，可用于多種農(nóng)作物基因的功能研究。植物病毒也可用于表達(dá)外源蛋白，從而控制農(nóng)作物農(nóng)藝性狀或者進(jìn)行疫苗生產(chǎn)。隨著基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展，病毒可通過遞送CRISPR元件進(jìn)入寄主體內(nèi)實(shí)現(xiàn)對寄主特定基因的編輯。

3.1 DNA 病 毒 遞 送CRISPR 元 件

雙生病毒作為DNA病毒的重要成員，具有2.5～3.0 kb 的單鏈環(huán)狀DNA 基因組。通過雙生病毒傳遞CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有多種優(yōu)勢：首先，雙生病毒寄主范圍廣，能夠侵染多種植物，同一病毒載體能夠應(yīng)用于多種寄主的基因編輯（表2）；其次，雙生病毒的復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）可在宿主細(xì)胞內(nèi)啟動復(fù)制，加快病毒復(fù)制速度，提高基因編輯效率；再者，雙生病毒可在宿主體內(nèi)通過高效復(fù)制產(chǎn)生大量序列特異性核酸酶（sequence-specific nucleases,SSNs）和gRNA，大大提高靶向效率；最后，雙生病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)依賴同源重組進(jìn)行復(fù)制，因此可通過外源增加SSNs和gRNA提高同源定向修復(fù)效率。

雙生病毒基因組小，易于操作，但這也限制了雙生病毒用作載體的載貨能力。通過替換雙生病毒CP蛋白可使雙生病毒能夠攜帶800～1 000 bp的外源蛋白序列，同時不影響其運(yùn)動和復(fù)制能力。然而，CRISPR/Cas 蛋白多為4 000 bp 左右的外源蛋白，雙生病毒無法攜帶此類大分子蛋白。為了增強(qiáng)雙生病毒的載貨能力，需同時去除其運(yùn)動蛋白和衣殼蛋白，形成非侵染性復(fù)制子，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化遞送至植物細(xì)胞中，這大大提高了雙生病毒在植物中的HDR效率。

BALTES 等首次利用BeYDV 遞送ZFN 和修復(fù)模板進(jìn)入煙草細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了目的基因的有效編輯，并進(jìn)一步利用BeYDV 復(fù)制子遞送TALEN 和CRISPR/Cas9 元件驗(yàn)證了雙生病毒復(fù)制子具有足夠的承載能力，提高了其在煙草中的編輯效率[44]。ERMáK等利用BeYDV復(fù)制子在調(diào)節(jié)番茄花青素生物合成的基因上游插入一個強(qiáng)啟動子，使得番茄組織中花青素的含量顯著提高，與傳統(tǒng)的DNA遞送方法相比，使用雙生病毒復(fù)制子的方法可使編輯效率提高近10倍[45]。VU等基于BeYDV復(fù)制子創(chuàng)建了依賴于CRISPR/LbCpf1系統(tǒng)的同源重組載體表達(dá)系統(tǒng)，效率較Cas9 蛋白介導(dǎo)的同源系統(tǒng)提高了3～4倍[46]。GIL-HUMANES等開發(fā)了基于WDV復(fù)制子精準(zhǔn)靶向谷類作物基因的編輯系統(tǒng)，由該雙生病毒復(fù)制子介導(dǎo)的報告基因在小麥中的表達(dá)量增加了110倍，且與非病毒遞送方法相比，利用其攜帶CRISPR/Cas9 核酸酶和修復(fù)模板讓小麥中的基因編輯效率提高了12倍，并可在小麥的同一細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)多重基因靶向，雖然效率僅有1%[47]。WANG 等使用WDV復(fù)制子系統(tǒng)在水稻中實(shí)現(xiàn)了由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲入，其工作效率進(jìn)一步提高至19.4%[48]。雙生病毒復(fù)制子介導(dǎo)的基因編輯不僅能夠在煙草、番茄、小麥和水稻中實(shí)現(xiàn)有效編輯，而且同樣適用于馬鈴薯基因組研究。BUTLER 等在2015 年和2016 年發(fā)表的2項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)了雙生病毒復(fù)制子介導(dǎo)的基因編輯的可行性并展望了其廣闊的應(yīng)用前景[49-50]。

除用雙生病毒復(fù)制子系統(tǒng)來傳遞表達(dá)CRISPR/Cas9 外，YIN 等首次利用雙生病毒載體開發(fā)了病毒誘導(dǎo)型基因組編輯系統(tǒng)（virus-induced genome editing system,VIGE），通過雙生病毒載體遞送gRNA 至轉(zhuǎn)基因Cas9的本氏煙中，實(shí)現(xiàn)了對NbPDS3和NbIspH內(nèi)源基因的有效打靶[51]。

3.2 RNA 病 毒 遞 送CRISPR 元 件

除了DNA 病毒，許多RNA 病毒也被用作植物中遞送元件的載體（表2）。TRV 具有2 條正向單鏈RNA：RNA1和RNA2。RNA1對病毒復(fù)制和運(yùn)動至關(guān)重要，而RNA2則編碼CP、2b、2c蛋白。通常情況下，通過對RNA2中的2b和2c蛋白進(jìn)行刪除從而實(shí)現(xiàn)外源蛋白表達(dá)。利用TRV 可以將ZFN 元件遞送至植物的各種組織和細(xì)胞中，并引起有效的基因編輯，從而避免植物遺傳轉(zhuǎn)化過程，縮短育種時間[52]。2015 年，TRV 首次被應(yīng)用于CRISPR/Cas 基因編輯載體的遞送：ALI等通過農(nóng)桿菌侵染的方法，將帶有八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase,PDS）基因的sgRNA TRV載體遞送至過表達(dá)Cas9的本氏煙轉(zhuǎn)基因品系的葉片中，引起了PDS 的突變，并且TRV能夠侵染分生組織，由此可知其當(dāng)代種子穩(wěn)定攜帶了該遺傳修飾，并可遺傳給后代[53]。此TRV遞送系統(tǒng)可用于抗病毒研究，通過攜帶多個靶向TYLCV 基因組的sgRNA 可獲得抗TYLCV 的轉(zhuǎn)基因本氏煙[54]。TRV 同樣可以攜帶crRNA，將其傳遞到過表達(dá)CRISPR/pCas13a的本氏煙中，使本氏煙能有效抵抗TuMV 的侵染[26]。通過在過表達(dá)Cas9 的本氏煙中比較TRV 和豌豆早褐病毒（pea earlybrowning virus, PEBV）載體遞送sgRNA 效率時發(fā)現(xiàn)：PEBV 介導(dǎo)的基因編輯具有更高的編輯效率（57%～63%）；同時，PEBV同樣可以感染分生組織，這就意味著不需要傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)即可獲得可遺傳的靶向突變[55]。

表2 病毒誘導(dǎo)的基因編輯在植物中的應(yīng)用Table 2 Application of virus-induced gene editing(VIGE)on plants

TMV 也被開發(fā)為遞送sgRNA 的載體，通過TMV 載體遞送高濃度sgRNA 編輯本氏煙內(nèi)源基因，其編輯效率高達(dá)70%；TMV 載體也能夠進(jìn)行多重基因組編輯，以及同一載體同時遞送sgRNA和過表達(dá)某一基因，做到基因敲除與基因過表達(dá)同時進(jìn)行[56-57]。為進(jìn)一步優(yōu)化TMV誘導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，CHIONG 等利用2 個TMV 載體分別遞送Cas9 和sgRNA 時在煙草中引起了插入缺失，而單個TMV載體雖然可同時遞送Cas9 和sgRNA，但與前者相比，其在煙草中的編輯效率顯著較低，僅為7%[58]。

馬鈴薯X 病毒屬（Potexvirus）的病毒也可作為sgRNA 遞送載體，馬鈴薯X 病毒（potato X virus,PVX）是正單鏈RNA 線性病毒，長度為6 345 bp[59]，能夠同時攜帶Cas9 和sgRNA 并遞送至本氏煙中，造成有效突變。PVX 也可遞送胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor,CBE）載體，該系統(tǒng)在NbTOM1處引起了C→T 的堿基替換，證實(shí)PVX 載體可與CBE兼容[60]。同屬于馬鈴薯X病毒屬的狗尾草花葉病毒（foxtail mosaic virus,FoMV）也已被開發(fā)為VIGS載體和基因表達(dá)載體[61]。利用FoMV 載體攜帶sgRNA，可在玉米、狗尾草（Setaria viridis）和本氏煙中實(shí)現(xiàn)基因編輯，但使用FoMV系統(tǒng)靶向玉米耐鹽基因ZmHKT1的編輯效率僅為3%～6%[62-63]。當(dāng)FoMV與甘蔗花葉病毒（sugarcane mosaic virus,ScMV）共同接種時，表現(xiàn)出對狗尾草SvCA2基因更高的編輯效率，其中接種葉為45%，系統(tǒng)葉為60%，但這些編輯是不可遺傳的[63]。URANGA 等提出了使用2 種兼容的病毒載體共同表達(dá)Cas 蛋白和sgRNA，通過將表達(dá)LbCas12a 的TEV 載體和表達(dá)sgRNA 的PVX載體農(nóng)桿菌共同浸潤煙草，獲得了無轉(zhuǎn)移DNA（transferred DNA,T-DNA）插入的基因編輯植株[5]。這種新型雙病毒載體共同介導(dǎo)的編輯系統(tǒng)無須通過遺傳轉(zhuǎn)化即可獲得后代編輯材料，進(jìn)一步簡化了病毒誘導(dǎo)基因編輯系統(tǒng)的操作。

除上述病毒誘導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)外，大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）的gRNA遞送系統(tǒng)可用于小麥和玉米中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的靶向誘變，對小麥和玉米中的TaGASR7和ZmTMS5基因分別實(shí)現(xiàn)了78%和48%的基因編輯效率[64]。甜菜壞死黃脈病毒（beet necrotic yellow vein virus,BNYVV）gRNA 遞送載體在轉(zhuǎn)基因Cas9 本氏煙中對NbPDS3的編輯效率高達(dá)85%[65]。將CRISPR/Cas9 和sgRNA 插入到負(fù)鏈RNA 病毒苦苣菜黃網(wǎng)彈狀病毒（sonchus yellow net rhabdovirus,SYNV），可實(shí)現(xiàn)90%～100%的編輯效率[6]。蘋果潛隱球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）同樣成功地對2個大豆GW2同源基因進(jìn)行了編輯[66]。

雖然TRV 和PEBV 病毒能夠侵染植物分生組織，但多數(shù)病毒仍無法進(jìn)入植物分生組織，可遺傳的基因突變效率很低。研究人員通過使用核糖體蛋白S5A（ribosomal protein S5A,RPS5A）啟動子驅(qū)動SpCas9 表達(dá)并獲得轉(zhuǎn)基因株系，通過TRV 遞送sgRNA 進(jìn)入煙草葉片，后代種子有2%～6%發(fā)生了基因突變[67]。另外，通過在sgRNA上添加促進(jìn)細(xì)胞間移動的信號，例如開花基因座T（Flowering Locus T,FT）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA, tRNA）等，利用TRV 遞送帶有移動信號的sgRNA 至過表達(dá)Cas 轉(zhuǎn)基因煙草中，后代有65%～100%的突變是可遺傳的[68]，該方法與通過傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)獲得的突變體相比，大大縮短了時間、節(jié)省了經(jīng)濟(jì)和人力成本。

4 展望

CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)徹底顛覆了整個生命科學(xué)研究領(lǐng)域，在短短幾年間，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為領(lǐng)域內(nèi)最受關(guān)注的研究工具。該技術(shù)也為植物性狀改良、抗性提升，尤其為抗病毒育種工程研究開辟了新途徑、提供了新思路。

目前，CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)已被成功應(yīng)用于多種抗病毒研究中，然而該技術(shù)還存在一些局限性，例如使用CRISPR/Cas9 工具抵抗外源病毒侵染時，雙生病毒可以逃避CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的抗性。因此，CRISPR/Cas9 能否加速雙生病毒進(jìn)化仍是一個需要探討的問題。此外，通過病毒遞送CRISPR元件受限于病毒包裹外源蛋白的容量，僅有SYNV和PVX 能夠表達(dá)Cas 蛋白，因而開發(fā)較小分子量Cas 蛋白以用于病毒載體傳遞具有重要的應(yīng)用價值。近日，有2個團(tuán)隊分別開發(fā)出一個新型的“迷你版”CRISPR/Cas12f1 的Un1Cas12f1 和AsCas12f1，大小僅為CRISPR/Cas9的一半，但編輯效率與Cas9相當(dāng)[70]。利用小分子量蛋白進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)的開發(fā)和應(yīng)用可以完全避免轉(zhuǎn)基因操作，消除外源蛋白對寄主的潛在影響，為未來作物育種研究提供更安全的種質(zhì)資源。

此外，已有研究多基于提升寄主植物對病毒的抵抗力或直接靶向病毒序列來達(dá)到抗病毒的目的。但有一大部分植物病毒是將昆蟲作為媒介進(jìn)行傳播，因此，能否通過同時控制昆蟲介體的傳播效率和增強(qiáng)植物對病毒的抵抗能力來控制病毒的侵染、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等多個過程，達(dá)到更為高效的抵抗病毒的效果，獲得更廣譜的抗病毒新材料仍是需要探索的方向。病毒誘導(dǎo)的基因編輯能夠繞開最傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法來獲得轉(zhuǎn)基因材料，但多數(shù)病毒無法進(jìn)入植物的分生組織，雖然有研究報道，在gRNA上添加移動信號能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳突變，但其后代編輯效率相對較低，因此亟須開發(fā)出更高效、穩(wěn)定、便捷、可遺傳的基因編輯系統(tǒng)，拓寬病毒介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，更好地利用龐大的植物病毒王國為科學(xué)研究作出更多貢獻(xiàn)。