全玉東，吳孔明

（植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱“Bt”）是一種革蘭氏陽(yáng)性需氧菌，廣泛分布于土壤、水、植物等生態(tài)系統(tǒng)中。作為重要的昆蟲(chóng)病原體，Bt在不同培養(yǎng)階段產(chǎn)生的毒素（蛋白）對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)（如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等）具有高效和特異的殺蟲(chóng)效果，已被開(kāi)發(fā)為生物殺蟲(chóng)劑并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1]。目前，世界上Bt 病原體或毒素生物制劑約占微生物農(nóng)藥市場(chǎng)的75%～95%[2]，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)作物的種植面積已超過(guò)1.01 億hm2，占轉(zhuǎn)基因作物種植面積的53%以上[3]。Bt病原體或蛋白的大量使用，具有提高經(jīng)濟(jì)效益、減少農(nóng)藥用量、增加生物多樣性以及保障人體健康和食品安全性的作用。對(duì)Bt或Bt基因的合理運(yùn)用和相關(guān)研究，不僅是有害生物綜合治理（integrated pest management,IPM）策略的重要組成部分，而且是發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的關(guān)鍵[4]。

1996年，美國(guó)批準(zhǔn)轉(zhuǎn)cry1Ab抗蟲(chóng)基因玉米商業(yè)化，隨后多種cry轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)被大面積種植。在經(jīng)歷了近25年的使用后，當(dāng)前已在田間監(jiān)測(cè)到超過(guò)20 種靶標(biāo)害蟲(chóng)演化出對(duì)部分晶體蛋白（crystal proteins, Cry 蛋白）毒素的高耐受性[5]。此外，雖然Cry蛋白或cry基因可高效防治多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，但部分重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)如草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）、小地老虎（Agrotis ipsilon）等具有對(duì)Cry蛋白的先天不敏感性[6-7]。一種分離于Bt品系A(chǔ)B88營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段上清液中約88.5 kDa 的蛋白Vip3Aa（vegetative insecticidal protein 3Aa，營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白3Aa），對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有高度的殺蟲(chóng)活性，特別是對(duì)小地老虎（A.ipsilon）等Cry 蛋白不敏感害蟲(chóng)[8]。為了治理或延緩靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Cry 蛋白等的抗性，提出科學(xué)合理的Bt 使用策略，學(xué)者們提出“庇護(hù)所”“高劑量”“多基因”等學(xué)說(shuō)[4]。目前，vip3作為“多基因”策略中重要的組成部分，和cry基因一起應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物中，用來(lái)治理靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Cry 蛋白的抗性或增加殺蟲(chóng)圖譜數(shù)等[9-10]。

目前，Vip3 殺蟲(chóng)蛋白家族已發(fā)現(xiàn)有14 個(gè)模式樣本（Vip3Aa～j、Vip3Ba～c、Vip3Ca），超過(guò)110 種蛋白。值得注意的是，在2020 年新的命名法中，根據(jù)序列的同源性和結(jié)構(gòu)，Vip3殺蟲(chóng)蛋白家族被稱作Vip，原Vip1、Vip2、Vip4 則分別稱作Vpb1、Vpa、Vpb4 蛋白家族。在當(dāng)前市場(chǎng)上所使用的主要為Vip3Aa（Vip3Aa19、Vip3Aa20）[5,11-12]。中國(guó)也一直高度重視作物轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的研究，提出尊重科學(xué)、監(jiān)督管理、有序推進(jìn)的發(fā)展方針，并于2021年開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因玉米和大豆的產(chǎn)業(yè)化試點(diǎn)工作[13]。鑒于Vip3對(duì)發(fā)展Bt作物和殺蟲(chóng)劑的特殊重要性，本文綜述了Vip3 的結(jié)構(gòu)和功能、殺蟲(chóng)機(jī)制、抗性治理及其在轉(zhuǎn)基因作物上的應(yīng)用情況。

1 Vip3 殺蟲(chóng)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

Vip3 包含787 個(gè)氨基酸，平均分子量約為89 kDa。Vip3 的N-端富含α-螺旋，序列分析顯示其具有高度的保守性，特別是氨基酸12—188（pfam12495）被發(fā)現(xiàn)存在于所有Vip3A 亞家族中。Vip3 的N-端區(qū)域被認(rèn)為可能作為一種信號(hào)肽參與蛋白質(zhì)的激活調(diào)節(jié)。與此形成鮮明對(duì)比的是，Vip3的C-端區(qū)域主要由β-折疊構(gòu)成，存在高度的可變性，與碳水化合物結(jié)合組件（carbohydrate-binding module,CBM）具有高度相似性，被猜想和特異性靶向結(jié)合或增加膜上毒素（Vip3）濃度有關(guān)[14-15]。

近年通過(guò)冷凍電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，Vip3Aa由Ⅰ～Ⅴ5 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，并由4 個(gè)單體圍繞中心孔構(gòu)建成四聚體[16]，類似的構(gòu)象也在Vip3B 蛋白的掃描電鏡三維（three dimension, 3D）結(jié)構(gòu)中被發(fā)現(xiàn)[17-18]。以Vip3Aa 為例，Vip3Aa 原毒素（protoxin）在自然狀態(tài)下（pH 7～11）被四聚體組裝成“金字塔”形（pyramid-shaped）結(jié)構(gòu)，其N-端位于頂端的尖端區(qū)域（“塔尖”）[16,18]。與Cry蛋白類似，Vip3Aa原毒素也需要被昆蟲(chóng)中腸內(nèi)存在的蛋白酶激活，通過(guò)類胰蛋白酶的消化過(guò)程生成2個(gè)約20、65 kDa的片段，并在氨基酸位點(diǎn)198/199附近被切割，但這2個(gè)片段仍保持強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)[16,19-22]。在被胰蛋白酶激活后的Vip3Aa中主要觀察到一種新的“注射器”狀（syringe-like）結(jié)構(gòu)活化毒素，它由3 個(gè)反平行N-端螺旋（α2～α4）以類似“折疊麻花狀藤條”的方式經(jīng)歷一系列旋轉(zhuǎn)，形成一個(gè)長(zhǎng)的連續(xù)螺旋，最后組裝成平行的四螺旋結(jié)構(gòu)[16-18]。

Vip3Aa 的結(jié)構(gòu)域Ⅰ從N-端延伸到初級(jí)蛋白酶裂解位點(diǎn)（K198），由4個(gè)細(xì)長(zhǎng)折疊彎曲的α-螺旋（α1～α4）組成，特別是α1～α2的可變長(zhǎng)度允許內(nèi)部單體的第2和第3螺旋旋轉(zhuǎn)，進(jìn)一步形成一個(gè)八螺旋束，最終形成“注射器”狀結(jié)構(gòu)（活化構(gòu)象，圖1）的四聚體核心突出部分（“莖”）[16-18]。結(jié)構(gòu)域Ⅱ（氨基酸200—325）由5個(gè)α-螺旋組成，包含四聚體的核心并使Vip3Aa 的低聚物穩(wěn)定。結(jié)構(gòu)域Ⅲ（氨基酸328—532）由3個(gè)反平行β-折疊組成，排列成一個(gè)β-棱鏡結(jié)構(gòu)[16,18,21]。Vip3Aa或Vip3B的結(jié)構(gòu)域Ⅲ與Cry蛋白（δ-內(nèi)毒素）的結(jié)構(gòu)域Ⅱ極為相似[18,23]。有趣的是，在一些Cry 蛋白毒素中，Vip3Aa 或Vip3B 的結(jié)構(gòu)域Ⅱ已被證明能夠識(shí)別與碳水化合物的特異性結(jié)合，其結(jié)構(gòu)域Ⅲ也被推斷與受體的結(jié)合有關(guān)[18,24-25]。Vip3Aa 的結(jié)構(gòu)域Ⅳ和Ⅴ（以氨基酸675 為劃分位點(diǎn)）通過(guò)一段長(zhǎng)鏈序列連接到結(jié)構(gòu)域Ⅲ上，具有類似的CBM 折疊[14,16-18,20-21]。雖然這些結(jié)構(gòu)域的作用尚不是很清楚，但已有的研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域Ⅳ～Ⅴ對(duì)殼聚糖和幾丁質(zhì)有強(qiáng)烈的偏好，并且缺失任意一個(gè)都將使Vip3Aa或Vip3Af的殺蟲(chóng)活性完全喪失[21,25-26]。有趣的是，結(jié)構(gòu)域Ⅳ～Ⅴ并不會(huì)對(duì)Vip3Af的受體特異性結(jié)合產(chǎn)生影響，并且在Sf21細(xì)胞存活能力測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自Vip3Af純化的結(jié)構(gòu)域Ⅰ～Ⅲ和野生型中的結(jié)構(gòu)域具有相同的殺死細(xì)胞的能力[21,24]。但對(duì)甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲(chóng)的生物學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，包含CBM片段（結(jié)構(gòu)域Ⅰ～Ⅳ）的突變體在一定濃度下可和Vip3Aa產(chǎn)生拮抗作用[27]。此外，還發(fā)現(xiàn)位于結(jié)構(gòu)域Ⅴ的Vip3Aa64 的Y776N（Y到N）殘基突變體對(duì)高溫儲(chǔ)存期間保持殺幼蟲(chóng)活性很重要，預(yù)示著結(jié)構(gòu)域Ⅴ與蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)[28]。

此外，對(duì)比Vip3Af 蛋白3D 結(jié)構(gòu)和通過(guò)丙氨酸掃描技術(shù)檢測(cè)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，對(duì)Vip3A 的結(jié)構(gòu)或功能提供了關(guān)鍵認(rèn)識(shí)。在Vip3A 原毒素中，其四聚體由2個(gè)二聚體構(gòu)成，由氨基酸T167和F229單體間相互作用形成的這2個(gè)二聚體對(duì)四聚體的穩(wěn)定具有重要作用，而E168 和N242 氨基酸單體相互作用對(duì)二聚體中單體的聚合有重要作用[16,21]。這些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)在隨后的丙氨酸突變體（通過(guò)丙氨酸掃描技術(shù)將原氨基酸突變?yōu)楸彼幔┲卸纪耆珕适Я藲?蟲(chóng) 活 性[16,21,26]。雖 然 突 變 體T167A、T168A 和N242A仍保持四聚體構(gòu)象，但F229A在原毒素階段表現(xiàn)為二聚體（pH 9），在被胰蛋白酶消化后將完全變成27 kDa 小肽片段[21,26]。此外，丙氨酸突變體E483A 原毒素完全成了單體，被胰蛋白酶消化后出現(xiàn)和F229A 一樣的27 kDa 小肽片段[21,26]。據(jù)推測(cè)，T167和N163可能在原毒素中產(chǎn)生一個(gè)單體間相互作用網(wǎng)絡(luò)，E168、F229和Y272在原毒素和活化毒素結(jié)構(gòu)中保持基本相同的接觸，并且很可能在針狀物形成期間起穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，E483加強(qiáng)了這種相互作用，使堿基與四聚體的核心和β-棱鏡結(jié)構(gòu)域連接。值得注意的是，四聚體保存的完整性對(duì)殺蟲(chóng)活性起著至關(guān)重要的作用[16,21,26]。

Vip3 高度保守的N-端區(qū)域?qū)λ饷舾行院蜌⑾x(chóng)活性具有重要的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)交換Vip3Ab1和Vip3Bc1 的N-端（20 kDa）序列發(fā)現(xiàn)，盡管蛋白水解活性相似，但殺蟲(chóng)活性已完全喪失[29]。但在N-端缺失突變體Vip3AcAa中觀察到，刪除前198個(gè)氨基酸（對(duì)應(yīng)20～22 kDa 片段）增加了其對(duì)胰蛋白酶水解的敏感性，并消除了其對(duì)棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）和甜菜夜蛾（S.exigua）的毒性[30]。然而，從Vip3Aa 核心活性毒素的N-端序列中去除前200個(gè)殘基，可將其對(duì)棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）、小地老虎（A.ipsilon）、棉葉蟲(chóng)（Spodoptera littoralis）、三化螟（Scirpophaga incertulas）的殺蟲(chóng)活性提高2～3倍[31]。此外，從Vip3Aa中刪除前27個(gè)N-端氨基酸可使蛋白質(zhì)失去活性，導(dǎo)致其溶解度完全喪失。相比之下，從Vip3Aa中刪除前33個(gè)氨基酸后，其對(duì)斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、小菜蛾（Plutella xylostella）和埃及金剛鉆（Earias vitella）沒(méi)有任何殺滅作用[32]；而刪除前39 個(gè)N-端氨基酸會(huì)使其對(duì)斜紋夜蛾（S.litura）、玉米禾螟（Chilo partellus）的毒性產(chǎn)生不同的影響[33]。Vip3Af 的定點(diǎn)突變體M34L（氨基酸Met突變?yōu)長(zhǎng)ys）顯著增加了其對(duì)棉葉蟲(chóng)（S.littoralis）的毒性[34]。這些結(jié)果表明，Vip3 的N-端對(duì)溶解性、水解性和殺蟲(chóng)活性具有重要的影響。

近年來(lái)的研究表明，Vip3Aa 和Vip3Af 的C-端對(duì)殺蟲(chóng)活性也有顯著的影響，與昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)具有一定的結(jié)合能力[14,16,25]。位于C-端的突變體（C-端某些氨基酸突變?yōu)楸彼峄蚱渌煌陌被幔┠茱@著降低原高敏感的靶標(biāo)害蟲(chóng)的活性或使其完全失活，如氨基酸E483、W552、I699 等[14,16,25]。此外，碳水化合物結(jié)合基序（CBM_4_9 超家族，pfam02018）存在于除Vip3Ba 之外的所有Vip3 中（氨基酸536—652）[14-15]。然而，目前關(guān)于Vip3Aa C-端的特異性結(jié)合以及相關(guān)受體的研究仍缺乏直接的證據(jù)。

2 Vip3 殺蟲(chóng)蛋白的作用機(jī)制

Vip3 自1996 年被鑒定出[8]后，其作用機(jī)制受到了廣泛關(guān)注。Vip3Aa、Vip3B 和Vip3C 在結(jié)構(gòu)上具有顯著的相似性，Vip3Aa作為Vip3的重要代表性殺蟲(chóng)模型被深入解析（圖1）。此外，對(duì)Vip3B 的3D 結(jié)構(gòu)和Vip3Ca的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，它們與Vip3Aa具有相似的作用模式[14-15,35]。因此，后文主要以Vip3Aa 的作用模式為代表對(duì)Vip3 的作用機(jī)制進(jìn)行總結(jié)和探討。Vip3Aa 作用機(jī)制的研究主要以鱗翅目昆蟲(chóng)中腸和Sf9 細(xì)胞為對(duì)象，Vip3Aa 被蛋白酶激活后會(huì)與中腸刷狀緣上皮細(xì)胞的頂膜結(jié)合并形成穿孔[14,36-37]。Vip3Aa 在昆蟲(chóng)體內(nèi)的作用過(guò)程主要包括：1）原毒素的攝取；2）被中腸消化酶活化[19]；3）穿過(guò)圍食膜到達(dá)中腸上皮細(xì)胞并與相關(guān)的特異性受體結(jié)合[24,36-37]；4）某些通道或過(guò)程[如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）通道、細(xì)胞凋亡過(guò)程等]被激活[38-40]；5）N-端移位和重新構(gòu)建，形成一個(gè)新四螺旋狀長(zhǎng)條，可以到達(dá)并滲透脂質(zhì)雙層，形成孔隙或造成某些離子的流失[16-18]，最終可能導(dǎo)致中腸的病變或蟲(chóng)體的死亡。其中，位于中腸刷狀緣上皮細(xì)胞內(nèi)的特異性受體結(jié)合過(guò)程已被鑒定，在Cry 蛋白參與的同Vip3Aa、Vip3Af競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，這種特異性受體結(jié)合并不會(huì)受到影響[24,37]。

此外，研究Vip3Aa原毒素與Sf9細(xì)胞的作用（圖1）發(fā)現(xiàn)，Vip3Aa可能直接與細(xì)胞表面的清除類C家族蛋白受體（scavenger receptor class C like protein,SR-C）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（fibroblast growth factor receptor,FGFR）等受體蛋白結(jié)合，然后通過(guò)受體蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（endocytosis）進(jìn)入細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25,38,41-42]。同時(shí)，還鑒定出了部分Vip3Aa的特異性受體，如草地貪夜蛾（S.frugiperda）SR-C（Sf-SR-C）、草地貪夜蛾（S.frugiperda）FGFR（Sf-FGFR），這些受體與細(xì)胞凋亡（apoptosis）過(guò)程的激活具有重要的關(guān)聯(lián)性[38,41-42]。特別是Sf-SR-C被檢測(cè)出對(duì)細(xì)胞的內(nèi)吞作用具有重要影響[38]。一種約48 kDa的類胞外糖蛋白家族（tenascins）Vip3Aa受體被發(fā)現(xiàn)能夠穿過(guò)小地老虎（A.ipsilon）的上皮細(xì)胞組織，推測(cè)此受體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸通道的形成具有干擾作用[43]。但是目前與活化的Vip3Aa 相關(guān)的中腸上皮細(xì)胞中受體的鑒定仍然缺乏明確的證據(jù)，將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

圖1 Vip3Aa殺蟲(chóng)機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of insecticidal mechanisms of Vip3Aa

3 Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的研發(fā)

Vip3對(duì)多種鱗翅目昆蟲(chóng)具有高效的殺滅活性，其殺蟲(chóng)圖譜已被CHAKROUN 等[14]、CHAKRABARTY等[15]詳細(xì)總結(jié)，大部分?jǐn)?shù)據(jù)源于對(duì)Vip3A 家族或亞家族（Vip3Aa）的生物學(xué)檢測(cè)，少部分來(lái)自Vip3B 和Vip3C。值得注意的是，地夜蛾屬（Agrotis）和灰翅夜蛾屬（Spodoptera）的昆蟲(chóng)對(duì)Cry 蛋白具有高度的耐受性，而對(duì)Vip3 表現(xiàn)出易感性[6-7]。但一些對(duì)Cry蛋白高度易感的昆蟲(chóng)如玉米螟（Ostrinia nubilalis）、致倦庫(kù)蚊（Culex quinquefasciatus）和搖蚊（Chironomus tepperi）對(duì)Vip3A 都是輕微易感或不敏感[6,8]。鑒于這2 種毒素蛋白的殺蟲(chóng)圖譜具有較高的互補(bǔ)性，在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的研發(fā)中，同時(shí)表達(dá)多種Vip3A 和Cry 蛋白的策略被廣泛采用[9-10]，因而出現(xiàn)了多種Cry蛋白和Vip3A疊加品種（表1），或者通過(guò)基因工程改造Vip3A 的部分序列，嵌入或者連接部分非Vip3A序列（如Cry蛋白）（表2），以達(dá)到增強(qiáng)毒力或延緩抗性的作用。

表1 商業(yè)化應(yīng)用的表達(dá)Vip3A的Bt作物Table 1 Commercially available Bt crops expressing Vip3A

瑞士先正達(dá)（Syngenta）集團(tuán)、德國(guó)拜耳（Bayer）集團(tuán)、美國(guó)杜邦（DoPont）公司、美國(guó)陶氏（Dow_Agrosciences）公司等都開(kāi)發(fā)了轉(zhuǎn)vip3Aa基因（如vip3Aa19、vip3Aa20）作物（表1）。我國(guó)北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司（簡(jiǎn)稱“大北農(nóng)”）也開(kāi)發(fā)出Vip3類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物（轉(zhuǎn)化事件DBN9501），但目前尚未在田間商業(yè)化種植。聯(lián)合使用vip3和cry基因可延緩田間靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的抗性。雖然大量的生物學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，Vip3 和Cry 蛋白的殺蟲(chóng)作用不會(huì)互相影響，但其部分組合被檢測(cè)到增效或拮抗作用[9-10]。表現(xiàn)增效作用的組合有：針對(duì)草地貪夜蛾（S.frugiperda）、灰色條紋黏蟲(chóng)（Spodopteraalbula）、黑色黏蟲(chóng)（Spodoptera cosmioides）的組合Vip3Aa和Cry1Ia，針對(duì)東方黏蟲(chóng)（Mythimna separata）的組合Vip3Aa16 和Cry1A，針對(duì)小蔗螟（Diatraea saccharalis）的組合Vip3Aa 和Cry1Ca，針對(duì)二化螟（Chilo suppressalis）的組合Vip3Aa和Cry9Aa，針對(duì)草地貪夜蛾（S.frugiperda）的組合Vip3Aa 和Cry1Ab（Cry2Ab）等。表現(xiàn)拮抗作用的組合有：針對(duì)煙夜蛾（Heliothis virescens）的組合Vip3A和Cry1A（Cry1Ca），針對(duì)南方黏蟲(chóng)（Spodoptera eridania）的組合Vip3A和Cry1Ia[14-15,35]等。

此外，通過(guò)基因工程構(gòu)建含vip3和cry的嵌合vip3A基因，對(duì)Vip3A和Cry蛋白部分進(jìn)行編碼，以獲得具有新穎或改良特性的新蛋白（表2）[15]。目前，嵌合體主要是通過(guò)融合vip3Aa和vip3Ac基因或vip3Aa和cry基因使新表達(dá)的蛋白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)域或序列進(jìn)行交換產(chǎn)生的，可提高殺蟲(chóng)活性或增加殺蟲(chóng)圖譜數(shù)。如由Vip3Ac1 N-端的600 個(gè)氨基酸和Vip3Aa1 C-端的189個(gè)氨基酸組成的嵌合體Vip3AcAa，獲得了對(duì)玉米螟（O.nubilalis）的毒力，并增加了對(duì)草地貪夜蛾（S.frugiperda）、美洲棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa zea）和家蠶（Bombyx mori）的毒性。相比之下，Vip3AaAc（具有Vip3Aa1 的N-端和Vip3Ac1 的C-端）的毒性低于其原始蛋白Vip3Aa1 或Vip3Ac1，甚至完全喪失了對(duì)家蠶（B.mori）的毒性[44]。融合Vip3Aa14和Cry1Ac 的嵌合體雖然保留了Cry1Ac 對(duì)棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）和小菜蛾（P.xylostella）的毒性，但對(duì)斜紋夜蛾（S.litura）部分失去了Vip3Aa的毒性，推測(cè)其原因可能是Vip3A 折疊不正確[45]。融合了Vip3Aa7和Cry9Ca 的嵌合體Vip3Aa7 卻顯示出相對(duì)于Cry9Ca更加高效的毒力，潛在的原因可能是Vip3Aa增加了Cry9Ca的溶解度[46]。在另一個(gè)Vip3Aa7嵌合體中，Cry1C啟動(dòng)子的融合使嵌合體蛋白的表達(dá)量顯著增加了約9倍，但是這種表達(dá)了Vip3Aa7（N-端刪除39個(gè)氨基酸）和Cry1C的C-端的融合蛋白卻表現(xiàn)出相對(duì)于原始Vip3Aa較差的殺蟲(chóng)活性，其原因可能是蛋白質(zhì)的溶解度較低或折疊不當(dāng)[47]。

表2 基因工程改造的Vip3A及其毒力變化Table 2 Genetic engineered Vip3A and their insecticidal activity changes

4 靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的抗性監(jiān)測(cè)與治理

4.1 抗性監(jiān)測(cè)

Bt作物的商業(yè)化種植不可避免地會(huì)使靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Bt殺蟲(chóng)蛋白的敏感性下降，最終引起靶標(biāo)害蟲(chóng)在基因水平上的變異而產(chǎn)生遺傳抗性[5,9,50-52]。目前，靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Vip3產(chǎn)生抗性的田間案例已有一些報(bào)道，如：澳大利亞田間棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）和斑實(shí)夜蛾（Helicoverpa punctigera）對(duì)Vip3Aa 的抗性等位基因頻率高于Cry2Ab[52]；美國(guó)得克薩斯州美洲棉鈴蟲(chóng)（H.zea）對(duì)Vip3Aa 的抗性等位基因頻率為0.65%（95%置信限，0.140%～0.157%）[53]；巴西草地貪夜蛾（S.frugiperda）對(duì)Vip3Aa 的抗性等位基因頻率約為0.09%[54]，在美國(guó)路易斯安那州（Louisiana）和佛羅里達(dá)州（Florida）約為0.48%[55-56]。此外，2016—2020年，對(duì)美國(guó)阿肯色州（Arkansas）、路易斯安那州（Louisiana）、密西西比州（Mississippi）、田納西州（Tennessee）和 得 克 薩 斯 州（Texas）轉(zhuǎn) 基 因（含vip3Aa）玉米種植區(qū)美洲棉鈴蟲(chóng)（H.zea）的抗性監(jiān)測(cè)表明，2019年其對(duì)Vip3Aa的抗性達(dá)到13倍[57-58]。

經(jīng)過(guò)9 代室內(nèi)篩選，東方黏蟲(chóng)（M.separata）對(duì)Vip3Aa 可產(chǎn)生超過(guò)3 200 倍（相對(duì)于敏感品系，下同）的抗性[59]。類似的，收集于美國(guó)得克薩斯州田間的美洲棉鈴蟲(chóng)（H.zea）經(jīng)過(guò)幾代室內(nèi)篩選，對(duì)Vip3Aa 可以迅速產(chǎn)生588 倍以上的抗性[53]；經(jīng)過(guò)12代室內(nèi)篩選的煙夜蛾（Heliothis virescens），其抗性品系的Vip3Aa抗性可達(dá)到2 040倍[60-61]；收集于巴西田間的草地貪夜蛾（S.frugiperda），在室內(nèi)篩選過(guò)程中其Vip3Aa 抗性也可以迅速增加到3 200 倍以上[62]。此外，在斜紋夜蛾（S.litura）、棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）和斑實(shí)夜蛾（H.punctigera）室內(nèi)篩選實(shí)驗(yàn)中，都獲得了對(duì)Vip3Aa 產(chǎn)生抗性的品系，這些Vip3Aa 抗性品系均對(duì)Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F 等Cry1 蛋白無(wú)顯著的交互抗性[52,63]。此外，在Cry 蛋白抗性品系中，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)Vip3Aa的交互抗性。但是Vip3Aa或Vip3Aa/Cry2Ab 抗性棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）品系對(duì)Vip3Ca 會(huì)產(chǎn)生極高的交互抗性[64-65]。Vip3Aa 抗性煙夜蛾（Heliothis virescens）和棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）品系的F2代正交和回交結(jié)果表明，Vip3Aa抗性屬于常染色體上的隱性多基因遺傳[52,62]。此外，對(duì)Vip3Aa 抗性、敏感性草地貪夜蛾（S.frugiperda）以及其雜交品系的存活率、蛹質(zhì)量、性比、發(fā)育時(shí)間、繁殖力、凈繁殖率和內(nèi)稟增長(zhǎng)率等生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)顯著差異[66]。

靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Vip3 產(chǎn)生抗性的生化機(jī)制尚不清楚。對(duì)Vip3Aa抗性斜紋夜蛾（S.litura）品系的中腸酶研究發(fā)現(xiàn)，雖然其缺少了大約2種酪蛋白降解帶，并且顯著降低了部分蛋白酶的水解活性，但是Vip3Aa 最終的水解產(chǎn)物并沒(méi)有受到顯著影響[63]。來(lái)自Vip3Aa 抗性煙夜蛾（Heliothis virescens）品系的堿性磷酸酶活性顯著降低，并且進(jìn)一步確認(rèn)是由HvmALP1基因下調(diào)引起的[61]。不同于田間靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Cry蛋白產(chǎn)生抗性主要由中腸細(xì)胞膜受體結(jié)合力下降引起，草地貪夜蛾（S.frugiperda）、東方黏蟲(chóng)（M.separa）、棉 鈴 蟲(chóng)（H.armigera）、煙 夜 蛾（Heliothis virescens）等在Vip3Aa抗性和敏感性的特異性受體（BBMV）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合力方面沒(méi)有明顯變化[59,61,63,67]。因此，Vip3Aa 抗性產(chǎn)生可能位于殺蟲(chóng)機(jī)制中的結(jié)合前過(guò)程（如蛋白酶消化或激活、穿過(guò)圍食膜過(guò)程等）或結(jié)合后過(guò)程（如穿孔形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、線粒體破壞等）。

4.2 靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的抗性治理

靶標(biāo)昆蟲(chóng)對(duì)Bt作物的抗性治理（insect resistance management,IRM）屬于有害生物綜合治理（IPM）策略的重要組成部分[4]，最近10年，部分田間靶標(biāo)害蟲(chóng)抗性（如Cry蛋白）進(jìn)化案例[5,9,68]得到了廣泛的關(guān)注。在Cry蛋白抗性治理中使用的部分策略同樣也適應(yīng)于Vip3Aa轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物[4,9,68-69]。

4.2.1 高劑量-庇護(hù)所策略

在抗性演化模型中，允許在作物中表達(dá)中等濃度Bt（如Vip3Aa）、保留部分比例的易感品系、不斷稀釋抗性等位基因等，以達(dá)到延長(zhǎng)Bt作物使用壽命或抗性治理的目的。但是這種方法以犧牲部分防治效果或經(jīng)濟(jì)效益為代價(jià)，在實(shí)際操作中并不被普遍采用。以高劑量毒素表達(dá)量盡可能殺滅雜合或部分純合抗性昆蟲(chóng)、降低種群中抗性等位基因頻率并使經(jīng)濟(jì)損失低于閾值[9,51]的策略（高劑量策略）被廣泛應(yīng)用。但是考慮到田間主要靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Vip3Aa抗性等位基因具有較高的頻率[58]，以及室內(nèi)能夠快速篩選出抗性品系，因此，在更多情況下，田間Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的高劑量策略會(huì)配合庇護(hù)所（高劑量-庇護(hù)所）共同使用[4]。

庇護(hù)所模型已經(jīng)得到部分田間驗(yàn)證，其核心是通過(guò)種植非Bt 作物或適合寄主的天然野生植物來(lái)保存大量易感目標(biāo)害蟲(chóng)，并通過(guò)與來(lái)自Bt作物的害蟲(chóng)（攜帶高頻率抗性等位基因）交配，達(dá)到降低抗性等位基因頻率的目的。在田間轉(zhuǎn)基因棉花和玉米種植過(guò)程中，國(guó)內(nèi)外廣泛采用將Bt作物和非Bt作物一起混種或者提供一定區(qū)域的無(wú)Bt 毒素作物種植區(qū)（庇護(hù)所）[69-70]。高劑量-庇護(hù)所策略的聯(lián)合使用可以更容易地稀釋種群潛在易感個(gè)體抗性等位基因的頻率，或使生長(zhǎng)于庇護(hù)所內(nèi)的敏感種群以更少抗性適合度代價(jià)成為種群中的優(yōu)勢(shì)群體，但這可能受到害蟲(chóng)取食偏好行為的影響[69-71]。2014—2015、2016—2018、2019 年，美國(guó)對(duì)Vip3Aa 轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米混種的監(jiān)測(cè)結(jié)果揭示，2 種玉米的籽粒受到美洲棉鈴蟲(chóng)（H.zea）的損傷情況以及成蟲(chóng)出現(xiàn)的時(shí)間無(wú)明顯差異，但轉(zhuǎn)基因玉米能顯著降低美洲棉鈴蟲(chóng)（H.zea）的存活率[70]。在目前所開(kāi)發(fā)的Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物中，高劑量-庇護(hù)所策略不會(huì)受到取食行為的影響，同時(shí)，室內(nèi)篩選表明Vip3Aa抗性種群為隱性遺傳。因此，此策略是目前Vip3類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物較為常用的種植策略之一。合適的庇護(hù)所需結(jié)合昆蟲(chóng)的生物學(xué)特性、農(nóng)藝學(xué)、灌溉等因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。例如，選擇庇護(hù)所位置時(shí)必須預(yù)測(cè)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的活動(dòng)區(qū)間，成蟲(chóng)相對(duì)于幼蟲(chóng)有更大的活動(dòng)范圍，所以可以分開(kāi)設(shè)置成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)2種不同類型的庇護(hù)所[71]。

4.2.2 不同作用機(jī)制抗蟲(chóng)基因疊加策略

隨著B(niǎo)t作物的發(fā)展，為了延緩害蟲(chóng)抗性的演變并擴(kuò)大害蟲(chóng)控制的范圍，全球多地的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物已經(jīng)從單毒素轉(zhuǎn)向多毒素Bt作物[10,51]。多毒素疊加Bt作物，或被稱作第2代和第3代轉(zhuǎn)基因作物，能產(chǎn)生2 種或多種針對(duì)同一害蟲(chóng)的不同毒素（也被稱作“金字塔”策略），具有更強(qiáng)的昆蟲(chóng)保護(hù)特性并提高IRM 價(jià)值，已受到學(xué)者及企業(yè)的關(guān)注。目前，多數(shù)Bt作物主要采用在同一品種內(nèi)組合或嵌入cry和vip3Aa多種基因或采用RNA 干擾技術(shù)等不同的防治方式[4,9-10,13]。多基因策略可以顯著延緩作物發(fā)展出單基因抗性，同時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、田間作物的種植數(shù)據(jù)等已經(jīng)證實(shí)這一策略的價(jià)值。比較交替使用不同轉(zhuǎn)Bt單基因作物和疊加相同的基因于同一品種（“金字塔”策略）發(fā)現(xiàn)，后者具有更好的效果[4,9-10,13,71]。此外，通過(guò)在植物體內(nèi)特殊時(shí)期（如在部分昆蟲(chóng)危害的發(fā)生盛期）或特異性組織內(nèi)（如在取食組織刺激誘導(dǎo)下啟動(dòng)特異性啟動(dòng)子）表達(dá)Vip3A毒素來(lái)提高其表達(dá)量等措施也可進(jìn)一步延緩作物抗性的產(chǎn)生。

田間多采取綜合措施治理抗性，如在Bt作物的種植過(guò)程中，多基因疊加策略往往結(jié)合5%～20%的庇護(hù)所。這不但可以降低對(duì)庇護(hù)所的數(shù)量要求（相對(duì)于單基因作物），還可以更加有效地控制害蟲(chóng)數(shù)量，從而減少農(nóng)藥等的使用次數(shù)。IPM 包含許多重要的防治技術(shù)，如天敵的釋放、信息素/燈誘殺、害蟲(chóng)對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑抗性的監(jiān)測(cè)和管理等，都可對(duì)Vip3Aa抗性治理發(fā)揮重要的作用[4]。如在澳大利亞，通過(guò)處理土壤等種植措施減少Bt 棉花上越冬棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）蛹的數(shù)量，有利于降低靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Bt棉花抗性的發(fā)展速度。利用靶標(biāo)害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）的產(chǎn)卵趨性，在庇護(hù)所種植木豆（Cajanus cajanL.）作為“陷阱”誘惑雌蛾產(chǎn)卵，不但可以減少棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）在Bt 棉花上的產(chǎn)卵量，還可在庇護(hù)所保持較高的敏感種群數(shù)量，稀釋抗性基因。

5 展望

近年來(lái)，對(duì)Vip3 的3D 結(jié)構(gòu)解析有助于進(jìn)一步明確其殺蟲(chóng)機(jī)制，但對(duì)其結(jié)構(gòu)域Ⅳ～Ⅴ功能的探索仍然缺乏關(guān)鍵性證據(jù)。此外，活化蛋白到達(dá)中腸的過(guò)程（穿過(guò)圍食膜）、中腸特異性受體的鑒定、致死通道的激活等許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍需深入研究，靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物或蛋白的抗性機(jī)制和Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的殺蟲(chóng)圖譜亦需要進(jìn)一步明確。鑒于市場(chǎng)上Vip3 類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物多采用vip3Aa及其亞家族基因，這種單一基因的利用不可避免地加大了害蟲(chóng)的抗性風(fēng)險(xiǎn)，因此，挖掘利用新型高效殺蟲(chóng)vip3基因十分必要。以高劑量或多基因-庇護(hù)所為代表的抗性治理策略雖然已在田間得到應(yīng)用，但新的抗性監(jiān)測(cè)與治理技術(shù)如抗性基因的精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)方法和綜合治理技術(shù)等仍然需要配套和完善。我國(guó)作為農(nóng)作物生產(chǎn)大國(guó)，目前僅有cry基因抗蟲(chóng)棉商業(yè)化種植，Vip3類轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物的研發(fā)與應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于美國(guó)等國(guó)家，應(yīng)進(jìn)一步加快產(chǎn)品研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化步伐，利用生物技術(shù)推動(dòng)害蟲(chóng)綠色防治的發(fā)展，保障國(guó)家糧食安全。