郭麗寧，常 蕊，楊 杰，李 惠

(陜西省榆林市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 榆林 719000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是最常見婦科惡性腫瘤疾病，且近年受宮腔操作及肥胖率、糖尿病發(fā)病率增加等因素影響，此疾病發(fā)病率逐年升高[1]。目前手術(shù)、放化療等是臨床治療EC主要手段，但不同患者獲益不盡相同，原位癌EC復發(fā)率約20%，Ⅰ期、Ⅱ期EC經(jīng)全切術(shù)后復發(fā)率可達50%以上[2]，而探明EC復發(fā)機制指導臨床積極完善干預方案是當前研究熱點之一。三重基序蛋白14(tripartite motif 14，TRIM 14)是近年新發(fā)現(xiàn)與感染免疫及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白，多項研究證實，其在腫瘤組織內(nèi)異常表達，參與惡性細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管新生等生物學行為的調(diào)節(jié)過程[3-4]。微小RNA(microRNA，miR)-335定位在7q32染色體上，其表達豐度與胃癌、肺癌等多種腫瘤有關(guān)[5-6]。卵巢腺癌擴增長非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA OVAAL)最早發(fā)現(xiàn)于卵巢癌組織，近年相關(guān)研究顯示，其在EC組織內(nèi)高表達[7]，但其與EC臨床特征及預后復發(fā)間關(guān)系如何尚無定論。本研究旨在探討lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM 14在EC中表達及與臨床特征間關(guān)系，為臨床完善EC復發(fā)預警機制及治療方案提供參考。報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2019年1月—2020年12月我院EC患者86例作為癌組織組，同期EP患者86例作為EP組織組。納入標準：①符合EC、EP診斷標準[8-9]；②首次確診，入組前未經(jīng)相關(guān)治療；③EC為原發(fā)腫瘤；④無免疫抑制藥物應用史；⑤知情研究內(nèi)容，簽署同意書。排除標準：①合并其他腫瘤疾病者；②有傳染性疾病者；③合并其他婦科疾病者；④哺乳及妊娠期女性。病例組年齡36～68歲，平均(54.16±6.44)歲；體重指數(shù)18～26，平均22.91±1.33；絕經(jīng)64例，未絕經(jīng)22例；慢性病史：高血壓31例，糖尿病16例，高脂血癥28例。對照組年齡35～67歲，平均(53.84±6.23)歲；體重指數(shù)18～26，平均22.72±1.34；絕經(jīng)66例，未絕經(jīng)20例；慢性病史：高血壓33例，糖尿病14例，高脂血癥29例。兩組年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)情況、慢性病史基礎(chǔ)資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2檢測方法 術(shù)中留取EC癌組織、癌旁組織、EP組織，液氮冷凍，研磨，收集細胞加TRIzol裂解液，提取總RNA，測RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板，設置反應復孔(3個)，兩步法進行實時熒光定量PCR反應，分析循環(huán)閾值，2-△△Ct法獲得最終數(shù)據(jù)。TRIM 14引物序列：上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；lncRNA OVAAL引物序列：上游引物：5′-ACTCAGGCA-TTTTGGGGGAG-3′，下游引物：5′-ATGGCCAC-TTGATGGGTCTG-3′；miR-335引物序列：上游引物：5′-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3′,下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3′。北京索萊寶科技有限公司提供實時熒光定量PCR試劑盒。

1.3觀察指標 ①EC癌組織、癌旁組織及EP組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達。②對比不同臨床特征患者癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達。③比較是否復發(fā)患者癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達。④比較是否復發(fā)患者基礎(chǔ)資料。⑤分析EC患者術(shù)后復發(fā)的影響因素。⑥分析lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達對1年EC復發(fā)風險的預測價值。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料多組間比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗，不同特征、是否復發(fā)患者間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。對單因素分析中P<0.05的因素進行多重共線性檢驗，方差膨脹因子(variance inflation factor，VIF)<5時認為不存在多重共線性，納入Logistic多因素相關(guān)性分析。采用MedCalc 11.4繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達對EC復發(fā)風險的預測價值，獲取曲線下面積(areas under the curve，AUC)。Delong非參數(shù)法比較不同AUC差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組織組lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達的比較 癌組織組、癌旁組織組、EP組織組中l(wèi)ncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。癌組織組lncRNA OVAAL、TRIM14表達高于癌旁組織組、EP組織組，miR-335表達低于癌旁組織組、EP組織組(P<0.05)，EP組織組lncRNA OVAAL、TRIM14表達高于癌旁組織組，miR-335表達低于癌旁組織組(P<0.05)。見表1。

表1 對比不同組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達Table 1 Comparison of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 expressions in different tissues

2.2癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14在不同臨床特征組間的表達 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達在患者年齡、體重指數(shù)、絕經(jīng)、病灶直徑組間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在FIGO分期、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、病理類型組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達在不同臨床特征關(guān)組之間的比較 Table 2 Comparison of the expression of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 in cancer tissues in groups with different clinical characteristics

表2 (續(xù))

2.3是否復發(fā)患者間lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達 86例患者隨訪1年，失訪3例，有效隨訪83例，復發(fā)17例，復發(fā)率為20.48%。復發(fā)患者癌組織lncRNA OVAAL、TRIM14表達高于未復發(fā)患者，miR-335表達低于未復發(fā)患者(P<0.05)。見表3。

表3 對比是否復發(fā)患者間lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達Table 3 Comparison of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 expressions between patients with or without recurrence

2.4EC復發(fā)的單因素分析 是否復發(fā)患者FIGO分期、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、淋巴結(jié)清掃范圍比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 EC復發(fā)的單因素分析Table 4 Univariate analysis of EC recurrence (例數(shù)，%)

2.5EC復發(fā)的多因素分析 以術(shù)后是否復發(fā)作為因變量，以2.3及2.4中差異有統(tǒng)計學意義的項目作為自變量，經(jīng)多重共線性檢驗不存在共線性可能(VIF<5)，具體賦值見表5。納入Logistic回歸模型，結(jié)果顯示，校正FIGO分期、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、淋巴結(jié)清掃范圍后，lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達為EC復發(fā)的影響因素(P<0.05)。見表6。

表5 賦值Table 5 Assignment

2.6lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14對EC復發(fā)的預測價值 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14預測EC復發(fā)的AUC分別為0.851、0.875、0.848。三者聯(lián)合預測EC復發(fā)的AUC為0.915最大。見表7、圖1。

圖1 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14對EC復發(fā)的預測價值

表6 EC復發(fā)的多因素分析Table 6 Multivariate analysis of EC recurrence

表7 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14對EC復發(fā)的預測價值Table 7 Predictive value of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 for EC recurrence

3 討 論

EC病因病機尚未完全明確，目前認為可能與雌激素刺激、抑癌基因失活有關(guān)[10]。盡管近年隨診斷技術(shù)進步，EC早期診斷率顯著升高，使得此類患者5年生存率得以提高，但如何根據(jù)腫瘤生物學特性合理制定治療方案進一步提升患者獲益仍是困擾臨床一大難題。

miRNA是長度18～24個核苷酸的內(nèi)源性RNA，其高度保守性，且能調(diào)控機體基因表達。研究證實，miRNA與細胞增殖、分化、凋亡、代謝等各種病理生理過程的調(diào)控有關(guān)，且參與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程。miR-335是近年新發(fā)現(xiàn)在胃癌、乳腺癌、膽囊癌等腫瘤組織內(nèi)，尤其是各種生殖系統(tǒng)腫瘤中呈低表達的一種miRNA，且國內(nèi)也有研究指出，EC患者外周血miR-335水平降低，但其在EC組織內(nèi)表達及與EC臨床特征間關(guān)系如何仍無定論[11-14]。lncRNA一向被認為是基因轉(zhuǎn)錄生成的副產(chǎn)物，無實際生物活性，但近年隨研究深入發(fā)現(xiàn)，其存在多重調(diào)控功能，參與轉(zhuǎn)錄、修飾等多個過程的編碼蛋白基因調(diào)控過程，且與細胞發(fā)育、細胞代謝等過程密切相關(guān)。lncRNA OVAAL是lncRNA家族新發(fā)現(xiàn)成員，學者研究證實，在子宮內(nèi)膜漿液性乳頭狀癌患者外周血內(nèi)lncRNA OVAAL水平顯著升高[15]。本研究推測，miR-335、lncRNA OVAAL可能在EC發(fā)生發(fā)展中分別發(fā)揮抑癌基因、促癌基因作用。檢測發(fā)現(xiàn)，癌組織miR-335表達顯著降低，lncRNA OVAAL表達顯著升高，且二者在EP組織中亦存在一定程度異常表達，此特征符合上述miR-335、lncRNA OVAAL生物學行為特性的推測，亦符合EP存在惡變風險的特征，提示miR-335低表達、lncRNA OVAAL高表達可能在一定程度上促進EC的發(fā)生發(fā)展。繼續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-335、lncRNA OVAAL表達與EC病理類型、FIGO分期、組織學分級、肌層浸潤深度、血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與是否絕經(jīng)、病灶直徑、年齡、體重指數(shù)等無關(guān)，反映二者表達不易受個體因素影響，或可作為EC生物學行為的補充為臨床評估EC病理特征及明確其復發(fā)機制提供重要信息。但EC發(fā)生發(fā)展及預后轉(zhuǎn)歸涉及因素、病理生理機制眾多，而miR-335、lncRNA OVAAL對EC復發(fā)的影響是否存在獨立性仍未明確。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，校正混雜因素后，miR-335、lncRNA OVAAL仍進入方程，客觀說明miR-335、lncRNA OVAAL是EC復發(fā)的獨立因素。分析主要原因是正常情況下，miRNA的表達嚴格遵守組織及時序特異性，而病理狀態(tài)下miRNA異常表達，如：miR-335可通過誘導細胞發(fā)生形態(tài)改變而降低細胞運動活性，限制細胞轉(zhuǎn)移，而其表達降低時可正調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄因子SOX4胞外鈣黏蛋白C表達繼而利于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及侵襲[16]；lncRNA OVAAL可強制腫瘤基因擴增，與腫瘤細胞常見致癌基因DNA拷貝數(shù)變異現(xiàn)象一致，能誘導轉(zhuǎn)錄活化，促使細胞無序增殖，而EC的惡性行為可能僅是miR-335、lncRNA OVAAL異常表達后的一種直觀呈現(xiàn)[17]。因此，miR-335、lncRNA OVAAL可從分子層面為臨床評估EC復發(fā)風險提供更客觀的依據(jù)。

TRIM 14是TRIMs家族重要成員，其主要特征是包括一系列保守結(jié)構(gòu)域，參與細胞增殖及凋亡、免疫及炎癥等眾多細胞生理病理過程[18]。有研究顯示，下調(diào)TRIM 14表達能促使細胞凋亡，遏制乳腺癌細胞增殖，但其沉默可顯著強化肺癌細胞增殖活性。上述研究反映，不同腫瘤內(nèi)TRIM 14表達不一，既充當癌因子又具有抑癌因子活性[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織TRIM14高表達，且與FIGO分期、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復發(fā)有關(guān)，提示TRIM14可能在EC中發(fā)揮促癌基因作用。此外，有學者研究顯示，TRIM 14高表達的EC患者5年總生存期較短[21]，從側(cè)面印證本研究結(jié)論。繼續(xù)多因素Logstic回歸分析發(fā)現(xiàn)，TRIM 14高表達同樣是EC復發(fā)的獨立危險因素。結(jié)合現(xiàn)有研究分析TRIM 14可能是通過特殊結(jié)構(gòu)域-PRYSPRY實現(xiàn)E3泛素化酶作用而激活NF-κB通路繼而影響腫瘤細胞的增值、浸潤及轉(zhuǎn)移等活性而增加EC復發(fā)風險[22]。ROC分析顯示，lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14聯(lián)合預測EC復發(fā)的AUC值達0.915，具有較高預測價值。

綜上所述，EC患者癌組織lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表達與FIGO分期、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、病理類型等特征有關(guān)，三者聯(lián)合可有效提升術(shù)后復發(fā)預測效能。從lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM 14生物學特性分析不難發(fā)現(xiàn)，三者在EC發(fā)生發(fā)展中可能存在某種交互關(guān)系，盡管本研究經(jīng)多重共線性檢驗，三者間無共線性關(guān)系，但受于樣本來源單一及樣本量小等因素影響，仍不排除結(jié)果間互相干擾影響結(jié)論的客觀性，仍需后期繼續(xù)探討。