李斯 孫雅楠

(唐山市工人醫(yī)院 1心內(nèi)四科，河北 唐山 063000；2內(nèi)分泌二科)

2型糖尿病(T2DM)占糖尿病發(fā)病率的90%～95%，它會顯著增加慢性并發(fā)癥的發(fā)病率及死亡率〔1〕，良好的血糖控制將會延緩并發(fā)癥的發(fā)生。冠狀動脈性心臟病是T2DM最主要的大血管并發(fā)癥，T2DM患者的動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制相對復(fù)雜，其中包括年齡、性別等因素及一些基因的影響〔2〕。目前研究顯示，動脈硬化發(fā)病機(jī)制包括脂質(zhì)代謝紊亂、內(nèi)皮功能障礙、慢性炎癥和氧化還原平衡失衡〔3～5〕等，其中，脂代謝紊亂是T2DM患者動脈粥樣硬化的關(guān)鍵致病因素。

microRNAs(miRs)是一類非編碼的，長度為19～23個核苷酸〔6〕的短鏈小RNA分子。miRs通過轉(zhuǎn)錄后方式與靶基因3′端非編碼區(qū)通過不完全堿基配對原則，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)〔7〕，并調(diào)整多種細(xì)胞功能。現(xiàn)在已經(jīng)確定miRs在高等真核生物基因組中約占預(yù)測基因的1%，而高達(dá)30%的蛋白質(zhì)編碼基因可能受miRs調(diào)控〔8〕。此外，有研究證明miRs是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育與凋亡過程，T2DM的發(fā)生是一個復(fù)雜的動態(tài)過程受各種miRs的影響〔9〕。研究顯示〔10〕T2DM患者血漿miR-9-3p表達(dá)水平顯著升高，但miR-9-3p與血脂代謝的關(guān)系未予報告。眾所周知，以肝臟為主要器官的能量代謝，是最常涉及的糖脂代謝紊亂的器官，HepG2細(xì)胞系常作為研究對象，被用來檢測細(xì)胞脂質(zhì)代謝功能。本研究探討miR-9-3p對HepG2細(xì)胞增殖的影響及其對HepG2細(xì)胞總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)調(diào)控作用，檢測其對細(xì)胞Sirt-1蛋白表達(dá)的影響，探尋miR-9-3p對細(xì)胞調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞實驗分組及方法 HepG2細(xì)胞系由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心提供。實驗分為3組：正常對照組；HepG2細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染miR-9-3p-mimic為miR-9-3p mimic組；HepG2細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染miR-9-3p inhibitor為anti-miR-9-3p組。細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇后的HepG2細(xì)胞的試管加入適量含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成105/ml濃度移至培養(yǎng)瓶中，置于37%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞生長鋪滿瓶壁即可傳代。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-9-3p mimic及miR-9-3p inhibitor轉(zhuǎn)染：將配制好的miR-9-3p mimic、miR-9-3p inhibitor轉(zhuǎn)染復(fù)合物各250 μl，分別加入到培養(yǎng)好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培養(yǎng)基750 μl/孔，加入到各孔中，前后輕柔搖動細(xì)胞板至混合均勻。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37℃、5.0%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染6 h后吸取1 ml普通DMEM培養(yǎng)基(含有20%胎牛血清、無抗生素)，加入各孔。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別于24、48、72 h用MTT法測定細(xì)胞增殖，將HepG2細(xì)胞種植在96孔板中，密度為每孔3×104。 隨后，在96孔板的每孔中加入10 μl MTT溶液(濃度為15 mg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，并在37℃下黑暗中孵育2 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量吸光度，結(jié)果以對照的百分比表示。

1.4細(xì)胞實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 轉(zhuǎn)染實驗結(jié)束后于培養(yǎng)箱中取出6孔板細(xì)胞，吸取1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)加入每孔，清洗1次；吸取1 ml Trizol或RNAiso分別加入每孔，6孔板水平靜置片刻，剝離細(xì)胞，使細(xì)胞脫落；吸取含有細(xì)胞的裂解液輕柔轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，反復(fù)輕柔吹吸直至裂解液中無明顯的細(xì)胞沉淀，于室溫下靜置5 min；吸取200 μl氯仿加入勻漿裂解液中，扣緊離心管蓋，劇烈震蕩離心管15 s，觀察溶液直至充分乳化后，再于室溫下靜置5 min待用，4℃條件下12 000 r/min離心15 min；待離心完成，輕柔取出離心管，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；吸取與上清液等體積的異丙醇加入離心管，上下輕柔顛倒離心管直至混合物充分混勻，于室溫下靜置10 min；4℃條件下，12 000 r/min離心10 min，離心結(jié)束后，小心吸取并棄去上清，吸取75%的乙醇1 ml緩慢沿管壁加入離心管，輕柔上下顛倒洗滌離心管管壁，置于離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，取出離心管，小心吸取乙醇并棄去。于室溫下干燥5 min，使乙醇完全揮發(fā)；吸取70～80 μl去RNA酶(DEPC)處理水加入離心管溶解沉淀，待miR沉淀完全溶解后，將離心管置于-80℃冰箱保存。miR-9-3p及內(nèi)參miR-423-5p經(jīng)cDNA的合成，RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增檢測表達(dá)水平。

1.5細(xì)胞內(nèi)TG、TC測量 檢測HepG2細(xì)胞TG和TC的濃度采用TC檢測試劑盒和TG檢測試劑盒(BioVision，Inc.，Milpitas，CA，USA)根據(jù)說明書，基于磷酸甘油氧化酶/過氧化物酶反應(yīng)，HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)板中培養(yǎng)，至80%細(xì)胞呈匯合狀態(tài)時加入1 ml低溫PBS沖洗3次，之后加入試劑盒試劑和蒸餾水在37℃下混合6 min，冷卻后通過細(xì)胞裂解，測定吸收劑的密度，計算TG及TC含量。

1.6Western印跡

1.6.1細(xì)胞總蛋白的提取 細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后應(yīng)用PBS清洗3次后應(yīng)用RIPA裂解獲得細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度，之后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳過后取目的蛋白條帶恒流200 mA，轉(zhuǎn)膜1 h。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用TBST水洗完后，放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗體與一抗稀釋液，將封閉好的膜放入配好的一抗稀釋液，4℃搖床過夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗與二抗稀釋液，將膜放入配好的二抗稀釋液，常溫?fù)u床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實驗結(jié)果。

1.6.2考馬斯亮藍(lán)法測蛋白濃度 應(yīng)用分光光度計測定并計算每管蛋白的吸光度值，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取3 μl待測蛋白液，加入100 μl考馬斯亮藍(lán)顯色液，用分光光度計測定并計算出吸光度值，計算出待測蛋白的濃度。

1.6.3電泳分離蛋白分子，轉(zhuǎn)膜，將膜放入封閉液中，在搖床上封閉1 h。加一抗，4℃搖床過夜。加二抗，常溫?fù)u床上搖3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加顯色液在凝膠成像系統(tǒng)顯色，并記錄實驗結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組HepG2細(xì)胞中miR-9-3p表達(dá)水平比較 miR-9-3p mimic組HepG2細(xì)胞中miR-9-3p 表達(dá)水平(19.19±0.50)顯著高于正常對照組(0.95±0.10，P<0.05)；anti-miR-9-3p組HepG2細(xì)胞中miR-9-3p 表達(dá)水平(0.13±0.03)顯著低于正常對照組(P<0.05)。

2.2miR-9-3p mimic及anti-miR-9-3p對HepG2細(xì)胞增殖的影響 HepG2細(xì)胞經(jīng)miR-9-3p mimic及miR-9-3p inhibitor轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h，與正常對照組相比，miR-9-3p mimic組顯著增加HepG2細(xì)胞增殖，anti-miR-9-3p組顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖(均P<0.05)。見表1。

表1 miR-9-3p mimic及對HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.3各組TG、TC表達(dá)水平比較 與正常對照組相比，miR-9-3p mimic組顯著增加HepG2細(xì)胞TG及TC表達(dá)；anti-miR-9-3p組顯著抑制HepG2細(xì)胞TG及TC表達(dá)(P<0.05)。見表2。

表2 miR-9-3p mimic轉(zhuǎn)染及miR-9-3p inhibitor轉(zhuǎn)染對HepG2細(xì)胞TG、TC表達(dá)水平的影響

2.4各組Sirt-1蛋白表達(dá)水平比較 與正常對照組(0.623±0.044)相比，miR-9-3p mimic組顯著降低HepG2細(xì)胞Sirt-1蛋白表達(dá)(0.174±0.013)，anti-miR-9-3p組顯著增加HepG2細(xì)胞Sirt-1蛋白表達(dá)(1.250±0.069，均P<0.05)。見圖1。

圖1 各組Sirt-1蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

miRs是一類非編碼的小RNA，它們通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用〔8〕。研究表明miRs通過調(diào)控靶向基因表達(dá)，調(diào)整細(xì)胞周期、影響細(xì)胞分化等作用在細(xì)胞增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用〔11，12〕。因此，miRs在參與細(xì)胞一些生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，目前研究顯示，miRs在胰島素信號傳導(dǎo)和胰島素分泌中發(fā)揮重要的作用，但真正機(jī)制尚未完全闡明〔13〕。既往基于HepG2細(xì)胞系研究表明miR-145過表達(dá)能夠抑制葡萄糖攝取，降低蛋白激酶B與胰島素受體底物-1結(jié)合，誘導(dǎo)胰島素抵抗〔14〕。另一項研究顯示，miR-375基因敲除小鼠胰島β細(xì)胞的分泌功能顯著降低，并導(dǎo)致胰島素抵抗和血糖升高〔15〕，而過度表達(dá)miR-29a和miR-29b可能抑制胰島素誘導(dǎo)的胰島素葡萄糖攝取〔16〕。研究顯示，miR不僅直接調(diào)節(jié)胰島素分泌，調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育和胰島細(xì)胞分化，同時也間接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝〔17〕。因此，本研究進(jìn)一步探索了miR-9-3p是否參與HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程。

人類miR-9基因位于15號染色體上，包括miR-9-3p和miR-9-5p，其中miR-9-3p是一類腦源性，在神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，在果蠅和脊椎動物等不同物種間穩(wěn)定表達(dá)，表現(xiàn)出100%的相似性〔18〕。miR-9研究表明，其對缺氧缺血性腦損傷后的髓鞘修復(fù)發(fā)揮重要作用〔19〕。還有研究表明，miR-9-3p在胰島β細(xì)胞中的表達(dá)參與葡萄糖代謝過程中胰島素分泌的生理過程。研究表明，miR-9-3p的過度表達(dá)增加了胰島素細(xì)胞顆粒素的蛋白表達(dá)水平，并降低了胰島β細(xì)胞的分泌功能〔20，21〕。有研究還證實，血漿中miR-9-3p可能參與膽固醇代謝和血管生成，并調(diào)節(jié)心肌的生物功能〔22〕。但miR-9-3p是否參與HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝有待闡明。本研究結(jié)果表明，miR-9-3p可能是一種潛在的脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)。

為了研究miR-9-3p對HepG2細(xì)胞增殖的可能機(jī)制及對脂質(zhì)調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，本研究進(jìn)一步評價miR-9-3p對HepG2細(xì)胞Sirt-1蛋白的表達(dá)影響。目前報道表明，Sirt-1依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+去乙?；福c細(xì)胞衰老、增殖及能量代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)〔23〕。Sirt-1功能研究報道，Sirt-1不僅發(fā)揮抗氧化、抗凋亡和抗炎作用，并能抑制糖對細(xì)胞的發(fā)育不良影響，改善肝臟、肌肉和脂肪組織的胰島素敏感性〔24～26〕。此外，激活和上調(diào)Sirt-1可能減退年齡相關(guān)疾病如神經(jīng)退行性疾病，同樣的，在胰島素抵抗受試者其Sirt-1表達(dá)下調(diào)〔27〕。在肝組織中，Sirt-1能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝平衡。Lovis等〔28〕發(fā)現(xiàn)肝臟中的Sirt-1基因敲除，降低胰島素敏感性并上調(diào)游離脂肪酸和膽固醇。此外，Adlakha等〔29〕發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中miR-128通過靶向Sirt-1的表達(dá)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。這些發(fā)現(xiàn)表明Sirt-1的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。因此，刺激Sirt-1表達(dá)上調(diào)可能是調(diào)節(jié)血脂疾病的可能途徑之一。

綜上，抑制miR-9-3p表達(dá)具有抑制HepG2細(xì)胞增殖，降低HepG2細(xì)胞TC和TG含量，增加HepG2細(xì)胞Sirt1蛋白表達(dá)的作用。可能有助于幫助理解miR-9-3p在T2DM相關(guān)動脈硬化并發(fā)癥發(fā)生中的可能作用，并且miR-9-3p可能作為一種新型的治療目標(biāo)，用于治療T2DM患者脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)中。