蔣欣語 李笑雨 郭錫漢，2 唐唯，2 吳雪，2

(1云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650504；2生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心)

腫瘤和心腦血管疾病是危害中老年人健康主要的兩類疾病。在腫瘤和心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的過程中，常常伴隨著血管新生和血管通透性變化。不成熟的新生微血管通透性增加，是促進(jìn)腫瘤和心腦血管疾病發(fā)展的重要因素。同型半胱氨酸(Hcy)是近年來學(xué)術(shù)界所關(guān)注的一個心血管疾病重要的危險因素。Hcy是蛋氨酸脫甲基作用的代謝產(chǎn)物之一，在健康人體內(nèi)通常保持低濃度。研究顯示，心肌梗死、腦卒中、心力衰竭和閉塞性外周動脈疾病患者的血漿Hcy水平顯著增高〔1，2〕。動物實驗和體外的動脈粥樣硬化、血液凝結(jié)實驗都證明持續(xù)高水平Hcy濃度會促進(jìn)內(nèi)皮層的損傷，增強(qiáng)血小板黏附。飲食誘導(dǎo)的高Hcy血癥模式動物會出現(xiàn)由血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致的頸動脈內(nèi)膜增生〔3〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過Hcy處理后發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)單核細(xì)胞黏附的細(xì)胞因子表達(dá)顯著上調(diào)〔4〕，同時伴隨內(nèi)皮功能紊亂〔5〕。這些現(xiàn)象都與血管內(nèi)皮層通透性的改變相關(guān)，而高濃度Hcy如何影響血管內(nèi)皮層通透性變化尚未可知。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為模型，檢驗在Hcy刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化及維持血管穩(wěn)定效應(yīng)的正促血管生成素(Ang)-1和凋亡抑制基因Survivin表達(dá)的改變，探討高濃度Hcy引起血管內(nèi)皮通透性變化的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1主要材料和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC購于中科院昆明動物研究所細(xì)胞庫。優(yōu)等胎牛血清購于美國HyClone公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司，Hcy購于美國Sigma公司，Transwell購于美國Corning公司，抗體Ang-1、Survivin、GAPDH購于英國Abcam公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG二抗(IgG-HRP)購于美國Santa Cruz公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸 (BCA)蛋白檢測試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃，飽和濕度和5% CO2的培養(yǎng)箱中(Thermo Fisher)。每隔2 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至80%～90%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例傳代。

1.3內(nèi)皮細(xì)胞層的通透性檢測 將生長狀態(tài)良好的HUVEC消化制為細(xì)胞密度為6×104個/ml的細(xì)胞懸液。0.5 g/L的明膠孵育Transwell(上層容量200 μl，下層容量650 μl)上層1 h，接種細(xì)胞于Transwell(直徑6.5 mm，孔徑尺寸0.4 μm，孔徑密度108/cm2)上層(1.5×104個細(xì)胞/孔)。待細(xì)胞融合形成完整的細(xì)胞單層，分組進(jìn)行藥物處理。實驗組加入Hcy終濃度分別為5、25、50 μmol/L的培養(yǎng)基，對照組不加Hcy溶液，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，孵育24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗Transwell上下層3次，加入牛血清白蛋白溶液(0.2 mg/ml)孵育1 h，收集Transwell下層溶液，加入考馬斯亮藍(lán)用酶標(biāo)儀檢測溶液的OD值(波長490 nm)。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置7個濃度(0.000、0.022、0.066、0.110、0.154、0.198、0.220 mg/ml)，加入考馬斯亮藍(lán)用酶標(biāo)儀檢測出相應(yīng)的OD值(波長490 nm)，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。得到OD值與蛋白濃度換算公式y(tǒng)=0.5783x+0.1817(R2=0.990 6)。

1.4Western印跡檢測 接種生長狀態(tài)良好的HUVEC于6孔板中，在37℃，飽和濕度和5%CO2的條件下，使用RPMI1640培養(yǎng)基和10%的胎牛血清培養(yǎng)至細(xì)胞融合形成完整的細(xì)胞單層。實驗組加入Hcy終濃度分別為5、25、50 μmol/L的培養(yǎng)基，對照組不加Hcy溶液正常培養(yǎng)，孵育24 h。棄培養(yǎng)基后PBS清洗3次，6孔板置于冰上，加入裂解液200 μl，吹打后收集裂解液離心，12 000 r/min，4℃，2 min。取少量上清液測樣本蛋白濃度，每個樣本中取20 μg蛋白上樣至蛋白電泳凝膠中，常規(guī)電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%的脫脂奶粉25℃封閉4 h，Ang-1(1∶500)、Survivin(1∶5 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體孵育過夜。二抗37℃孵育1 h，TBST清洗后室溫下用顯色劑顯色。將顯色后的膜在暗室用膠片顯影、定影。膠片干燥后利用圖像分析系統(tǒng)對各電泳條帶亮度進(jìn)行掃描，Ang-1和Survivin的表達(dá)量分別用Ang-1陽性著色面積(IOD值)/內(nèi)參GAPDH 陽性著色面積(IOD值)和Survivin陽性著色面積(IOD值)/內(nèi)參 GAPDH 陽性著色面積(IOD值)來計算。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度Hcy處理下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞層的通透性檢測 與對照組相比，Hcy 5 μmol/L組的下層蛋白濃度并無顯著性差異(P>0.05)；Hcy 25 μmol/L組下層蛋白溶液濃度顯著高于對照組，Hcy 50 μmol/L組下層蛋白溶液濃度顯著高于對照組、Hcy 5、25 μmol/L組(均P<0.05)。見表1。

2.2不同Hcy濃度下HUVEC中Ang-1和Survivin的表達(dá) 與對照組相比，Hcy 5、25 μmol/L組細(xì)胞Ang-1和Survivin表達(dá)量均無顯著性差異(P>0.05)。而Hcy 50 μmol/L組Ang-1表達(dá)量顯著低于對照組和Hcy 5、25 μmol/L組，Survivin表達(dá)較對照組和Hcy 5 μmol/L組顯著下降(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 各組Transwell下層蛋白濃度及HUVEC中Ang-1、Survivin表達(dá)比較

1～4：對照組、Hcy 5 μmol/L組、Hcy 25 μmol/L組、Hcy 50 μmol/L組；圖2同圖1 不同濃度Hcy處理下HUVEC中Ang-1的表達(dá)

圖2 不同濃度Hcy處理下HUVEC中Survivin的表達(dá)

3 討 論

血管內(nèi)皮通透性增強(qiáng)分為兩種，一種是內(nèi)皮細(xì)胞表面形成微型孔狀結(jié)構(gòu)或微小窩狀結(jié)構(gòu)促進(jìn)小分子通過〔6〕，另一種是內(nèi)皮細(xì)胞之間連接被破壞后形成的縫隙使較大分子滲透〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，高水平Hcy濃度將會增強(qiáng)腦部微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，使血腦屏障的作用減弱，為發(fā)生腦卒中帶來更大的概率〔8〕。這一現(xiàn)象在動物實驗中得到證實，在高Hcy血癥小鼠模型上發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管發(fā)生變化和重塑，出現(xiàn)局部缺血，心血管形成和血腦屏障不力等情況〔9〕。本研究結(jié)果說明，內(nèi)皮細(xì)胞層的通透性與Ang-1和Survivin的表達(dá)負(fù)相關(guān)，它們可能通過協(xié)同作用維持了血管內(nèi)皮層的完整性。

Ang-1是一種促血管生長的細(xì)胞因子，在組織修復(fù)及血管發(fā)生方面起了一定作用。目前研究發(fā)現(xiàn)Ang-1有以下3種功能：通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)，抑制血管內(nèi)皮的凋亡〔10〕；促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞出芽、遷移和成熟，Ang-1通過活化局部的黏附激酶和纖維蛋白溶解酶分泌來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的出芽〔11〕；抗感染、維持血管穩(wěn)定和抗血管滲漏，經(jīng)Ang-1基因治療的小鼠可拮抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘發(fā)的血管滲漏，還可阻止炎癥引起的中性粒細(xì)胞遷移出內(nèi)皮細(xì)胞層〔12〕。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，高表達(dá)的Survivin可以通過線粒體相關(guān)途徑拮抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔13〕，而PI3K/AKT信號通路在線粒體保護(hù)及能量代謝中扮演著重要角色〔14〕。提示Hcy增強(qiáng)血管通透性可能通過抑制Ang-1表達(dá)下調(diào)survivin表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致胞間間隙增大，破壞細(xì)胞層完整性和穩(wěn)定性，作用機(jī)制與PI3K/AKT信號通路和線粒體途徑有關(guān)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究確定。

綜上，高水平Hcy增加了內(nèi)皮細(xì)胞層的通透性，并且在Hcy濃度為50 μmol/L的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞的Ang-1和Survivin表達(dá)顯著下調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)將為高Hcy血癥所引起的腫瘤和心腦血管疾病提供新的治療靶點。