王玲 霍艷慧 張敏 楊馥宇 黃超

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000；2遵化市人民醫(yī)院；3秦皇島市第一醫(yī)院)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)可造成機(jī)體損傷，其中神經(jīng)系統(tǒng)作為主要的靶器官之一〔1〕。OSAHS發(fā)病機(jī)制為長(zhǎng)期慢性間歇性缺氧，缺氧后可引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)而造成神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能的下降〔2〕。活化胱天蛋白酶(Caspase)-9是線粒體凋亡通路的主要凋亡蛋白，激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔3〕。間歇性缺氧除引起細(xì)胞凋亡外，可造成機(jī)體氧化應(yīng)激，是OSAHS機(jī)體損傷的另一個(gè)重要的病理機(jī)制〔4〕。超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)是評(píng)估機(jī)體氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)〔5〕。二氫楊梅素(DHM)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡減輕機(jī)體氧化應(yīng)激等多種機(jī)制，但在間歇低氧中尚無(wú)相關(guān)的試驗(yàn)研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察間歇低氧后及DHM干預(yù)后大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞Caspase-9蛋白的表達(dá)、細(xì)胞的凋亡、SOD活性及MDA含量等的變化，探討DHM對(duì)間歇低氧大鼠神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要儀器、試劑 Caspase-9兔抗鼠多克隆抗體、PV6001試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒由北京博爾西公司提供，TUNEL、 SOD及MDA試劑盒由上海奇源生物公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年Wistar雄性大鼠96只〔動(dòng)物許可證：SCXK(津)2009-0001〕，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照(UC)組、5%間歇低氧(IH)組、DHM組，每組又分別分為2 w、4 w、6 w、8 w 4個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠。

1.3動(dòng)物模型的制作 5%IH組大鼠低氧箱內(nèi)首先注入30 s的氮?dú)猓魉倏刂圃?0 L/min，使氧濃度降至5%，再注入40 s的空氣，流速同上，使氧濃度升至21%，在注入50 s的空氣，流速降至10 L/min，使氧濃度維持在21%，以上述120 s為周期進(jìn)行循環(huán)。UC組大鼠實(shí)驗(yàn)箱持續(xù)給予空氣注入，使試驗(yàn)箱內(nèi)的氧濃度為21%，空氣流速壓力控制在0.8 MPa。DHM組實(shí)驗(yàn)大鼠按250 mg/(kg·d)給予DHM灌胃(每日晨起7∶00)，灌胃半小時(shí)后與5%IH組大鼠一起放入低氧箱內(nèi)，3組大鼠每日實(shí)驗(yàn)時(shí)間均為8 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后置于相同的飼養(yǎng)環(huán)境。

1.4大鼠皮層組織SOD活性及MDA含量的測(cè)定 取大鼠皮層組織，進(jìn)行勻漿、離心后取上清液，整個(gè)過(guò)程需要在冰浴條件下。應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法對(duì)SOD活性進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用硫代巴比妥酸法對(duì)MDA 含量進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)試劑盒操作要求進(jìn)行。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Caspase-9蛋白的表達(dá) 固定后的腦組織經(jīng)透明、切片等步驟進(jìn)行制片。切片依次進(jìn)行脫蠟、脫水、H2O2孵育、高壓修復(fù)、滴加Caspase-9抗體(1∶500稀釋)，4℃過(guò)夜，滴加二抗等，進(jìn)行DAB 顯色，顯色結(jié)束后再次進(jìn)行脫水、透明等，最后進(jìn)行封片，于顯微鏡下攝影。

1.6細(xì)胞凋亡的測(cè)定 TUNEL法：切片進(jìn)行脫蠟后，依次置于新鮮的H2O2溶液中10 min(室溫，濃度為3%)，TBS漂洗3次，蛋白酶K工作液20 min(37℃)進(jìn)行反應(yīng)，TBS漂洗3次，TUNEL工作液滴20 μl 70 min(濕盒中，37℃)進(jìn)行反應(yīng)，TBS漂洗3次，封閉液30 min(37℃)進(jìn)行封閉，20 μl POD-轉(zhuǎn)化液30 min(濕盒中，37℃)進(jìn)行反應(yīng)，TBS漂洗3次，DAB顯色、封片等，最后于顯微鏡下攝影。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組皮層組織SOD活性及MDA含量的比較 與UC組比較，5%IH組及DHY組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MDA含量增加、SOD活性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與5%IH組比較，DHY組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MDA含量下降，SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組皮層組織SOD、MDA含量的表達(dá)

2.2各組皮層神經(jīng)細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)比較 與UC組比較，5%IH組及DHY組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase-9蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與5%IH組比較，DHY組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase-9蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 8 w各組皮層神經(jīng)細(xì)胞Caspase-9蛋白的表達(dá)(免疫組化，×400)

2.3各組皮層神經(jīng)元凋亡的變化 UC組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞較少；與UC組比較，5%IH組及DHY組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與5%IH組比較，DHY組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組皮層神經(jīng)元凋亡指數(shù)及神經(jīng)細(xì)胞Caspase-9蛋白的表達(dá)

圖2 8 w各組皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況(免疫組化，×400)

3 討 論

OSAHS是呼吸科睡眠障礙性疾病，隨著人們生活水平的提高，肥胖、血糖升高等問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，導(dǎo)致OSAHS的患病率明顯升高。OSAHS危害性巨大，長(zhǎng)期的慢性間歇性缺氧可造成多系統(tǒng)損害，如心血管系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等，甚至危及生命，嚴(yán)重影響患者的生活及工作。研究已經(jīng)證實(shí)，OSAHS可引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷，影響認(rèn)知功能等〔6〕。OSAHS引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機(jī)制眾多，其中細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激是重要的兩種致病機(jī)制〔7〕。

細(xì)胞凋亡是主動(dòng)性細(xì)胞死亡過(guò)程，機(jī)制復(fù)雜多樣，主要由線粒體凋亡通路、死亡受體通路等進(jìn)行調(diào)控，其中線粒體凋亡通路為調(diào)控凋亡主要的通路，有多種凋亡因子參與，如Bax、Bcl-2、P53、細(xì)胞色素C、Apaf-1、Caspase-9等〔8〕。Caspase-9是線粒體凋亡通路中的重要成員，可激活Caspase-3，引起Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，間歇低氧損傷后，可使凋亡蛋白Caspase-9表達(dá)增加，進(jìn)而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡〔9〕。OSAHS患者反復(fù)的發(fā)生上氣道梗阻引起間歇性缺氧，可引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激可使機(jī)體氧化與抗氧化失衡，抗氧化物質(zhì)增多，產(chǎn)生大量的自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一系列的負(fù)面作用。屬于金屬酶的SOD可及時(shí)清除機(jī)體過(guò)量的自由基，使細(xì)胞免受自由基的毒害與攻擊，發(fā)揮保護(hù)作用，因此，SOD活性可評(píng)估機(jī)體對(duì)氧自由基清除的能力。MDA是胞脂中不飽和脂肪酸被自由基氧化后所產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，脂質(zhì)過(guò)氧化是機(jī)體氧化損傷的重要原因，因此測(cè)定MDA的含量可反映自由基對(duì)機(jī)體的損傷嚴(yán)重程度〔10〕。本研究結(jié)果顯示，5%IH組可引起神經(jīng)細(xì)胞MDA含量、Caspase-9蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，SOD活性降低，說(shuō)明間歇低氧損傷可引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及氧化應(yīng)激。

DHM廣泛存在于葡萄科屬植物中，藤茶中含量較多，屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗腫瘤等多種作用〔11〕。研究證實(shí)，DHM可通過(guò)影響線粒體凋亡通路Caspase-9等的表達(dá)進(jìn)而對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控〔12〕。同樣發(fā)現(xiàn)DHM通過(guò)抗氧化及抗凋亡機(jī)制對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷發(fā)揮明顯保護(hù)作用〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)給予DHM干預(yù)后，可使神經(jīng)細(xì)胞MDA含量、Caspase-9蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，SOD活性增加，說(shuō)明DHM可改善間歇低氧損傷后細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)及抑制細(xì)胞凋亡。