才昊 欒梅

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121000；2老年科)

阿爾茨海默病(AD)又稱為老年癡呆，常導(dǎo)致老年患者出現(xiàn)近期記憶缺失、思維不清及人格出現(xiàn)改變和空間定向困難等癥狀〔1〕。在臨床上主要特征為進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶能力及思維能力出現(xiàn)障礙或減退〔2〕。AD發(fā)病機(jī)制較為錯(cuò)綜復(fù)雜，影響到患者身心健康的同時(shí)，也會(huì)對(duì)身邊親屬造成嚴(yán)重身心障礙〔3〕。臨床上大多抗AD藥物作用譜窄且毒副作用較大，因此，通過建立AD，探討AD發(fā)病機(jī)制的同時(shí)更有助于探索新藥物進(jìn)行治療〔4〕。其中β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42誘導(dǎo)AD模型，該因子具有獨(dú)特的可溶性、高分子性、螺旋性等特點(diǎn)得到較多學(xué)者的認(rèn)可〔5〕。本文選擇Aβ1～42誘導(dǎo)的AD細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，探究miR-107調(diào)節(jié)NF-κB對(duì)其的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料 研究細(xì)胞：Aβ1～42(美國(guó)Sigma公司)，HT22細(xì)胞(ATCC公司)。主要試劑：兔抗大鼠miR-107抗體(BD公司)；核因子(NF)-κB試劑盒、兔抗小鼠核因子κB抑制因子(IκB)α抗體(Invitrogen公司)；兔抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(Gibco公司)；Aβ、APP試劑盒(Sigma公司)；蛋白酶K、磷酸鹽緩沖液(PBS，碧云天生物公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的HT22細(xì)胞在40℃的環(huán)境火浴處理，后充分將其搖晃，在2 ml的培養(yǎng)基內(nèi)將搖晃均勻的HT22細(xì)胞放置其中，培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基500 ml，包括10%PBS、1%雙抗(青鏈霉素)，后進(jìn)行2 000 r/min離心處理，進(jìn)行重懸處理后開始細(xì)胞傳代，將培養(yǎng)基放置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)24 h、換液后，在細(xì)胞融合率達(dá)90%，傳代。

1.2.2細(xì)胞處理及分組 將HT22細(xì)胞以藥物干預(yù)方式進(jìn)行Aβ1～42細(xì)胞損傷24 h，待Aβ1～42誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型建立成功后，換液，以Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1，將退火產(chǎn)物進(jìn)行100倍稀釋后對(duì)其進(jìn)行連接，在20℃水浴下過夜孵育，以大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在第2天，選擇使用單克隆菌落，于30 μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液內(nèi)進(jìn)行接種，經(jīng)過2 000 r/min離心處理后，在37℃下將其震混，孵育過夜后，提取少量質(zhì)粒，以SacⅠ酶切鑒定，分為AD組、下調(diào)miR-107組及上調(diào)miR-107組,重懸處理后分別加入4 μg生理鹽水、miR-107siRNA、pcDNA3.1-miR-107，電擊處理后室溫環(huán)境下進(jìn)行保存120 min，在各組細(xì)胞的6孔、96孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)取出后加入含800 μg/ml G418的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。

1.2.3miR-107及NF-κB基因表達(dá) miR-107基因序列根據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引入SacⅠ酶切位點(diǎn)，miR-107正向引物序列：5′-GCCGAATTCAAAGCGAGATTCCATCAGCA-3′，反向：5′-GCCGGATCCTGTCAACCCAGAACTCAAAGG-3′;NF-κBm-RNA正向引物序列：5′-AGCCAGTGGAACTCCATGGTAC-3′，反向：5′-GCTAGCCCTGCTAGCTGAAG-3′。以RT-PCR對(duì) miR-107及NF-κB mRNA進(jìn)行檢測(cè)，首先提取細(xì)胞總RNA，對(duì)其RNA純度、含量檢測(cè)，在逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，設(shè)計(jì)引物序列以2-△△Ct方法計(jì)算miR-107、NF-κB表達(dá)，PCR引物由Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)，為Invitrogen公司所合成。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測(cè) 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力。將各組細(xì)胞加入96孔板中，分別于24、48、72 h后再每孔中加入30 μl的MTT液，37℃下，進(jìn)行孵育4 h，棄培養(yǎng)液后，加入150 μl的DMSO，酶標(biāo)儀在498 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的OD值。

1.2.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 在常溫環(huán)境下，以20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行徹底清洗，之后加入100 μl平衡緩沖液，室溫環(huán)境中平衡10 min，之后滴入100 μl TdT酶反應(yīng)液，避光、室溫環(huán)境中孵育1 h，之后加入100 μl檸檬酸鈉(SSC)溶液，常溫環(huán)境中靜置20 min后進(jìn)行清洗3次，之后使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進(jìn)行復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min后再次進(jìn)行浸洗，封片觀察。DAPI復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，取每切片3個(gè)視野進(jìn)行觀察、計(jì)算細(xì)胞凋亡率，計(jì)算平均值。

1.2.6IκBα、Bcl-2及Bax表達(dá)檢測(cè) 使用Western印跡法檢測(cè)IκBα、Bcl-2及Bax表達(dá)。對(duì)標(biāo)本以PBS進(jìn)行沖洗后，行30 min裂解，后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。選擇20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加完成蛋白緩沖液后開始進(jìn)行10 min電泳，后將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，在常溫環(huán)境下進(jìn)行90 min封存。后結(jié)合一抗、稀釋，進(jìn)行1 d孵育，取出以TBST液沖洗，后結(jié)合二抗，保存60 min后開始清洗與顯色，對(duì)IκBα、Bcl-2及Bax檢測(cè)。

1.2.7Aβ、APP相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 免疫組化法檢測(cè)Aβ、APP相對(duì)表達(dá)量，以PBS作為陰性對(duì)照，當(dāng)細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色為CK19染色陽性信號(hào)。將組織蠟塊進(jìn)行石蠟切塊，將厚度切為4 μm，以常規(guī)脫蠟、脫水，進(jìn)行抗原修復(fù)，除去離子水孵化，并滴加Aβ、APP為一抗，在4℃置放12 h，進(jìn)行2次PBS清洗，同時(shí)滴加聚合酶輔助劑，在37℃下水浴，進(jìn)行持續(xù)孵化，時(shí)間為20 min；2次PBS清洗，并進(jìn)行滴加IgG多聚體。在37℃下水浴，進(jìn)行持續(xù)孵化，時(shí)間為30 min。后計(jì)算出Aβ、APP相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-107、NF-κB基因表達(dá)比較 與AD組相比，下調(diào)miR-107組miR-107表達(dá)明顯較低，NF-κB mRNA表達(dá)明顯較高(P<0.05)；與AD組、下調(diào)miR-107組相比，上調(diào)miR-107組miR-107表達(dá)明顯較高，NF-κB mRNA表達(dá)明顯較低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞miR-107、NF-κB基因表達(dá)比較

2.2IκBα、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較 與AD組相比，下調(diào)miR-107組IκBα、Bcl-2表達(dá)均明顯較低，Bax表達(dá)明顯較高(P<0.05)；與AD組、下調(diào)miR-107組相比，上調(diào)miR-107組IκBα、Bcl-2表達(dá)均明顯較高，Bax表達(dá)明顯較低(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組IκBα、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

表2 各組間IκBα、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較

2.3各組細(xì)胞增殖率、凋亡率比較 24、48、72 h時(shí)，與AD組相比，下調(diào)miR-107組細(xì)胞增殖率較低，凋亡率明顯較高(P<0.05)；24、48、72 h時(shí)，與AD組、下調(diào)miR-107組相比，上調(diào)miR-107組細(xì)胞增殖率明顯較高，凋亡率明顯較低(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組細(xì)胞凋亡(HE染色，×200)

2.4Aβ、APP相對(duì)表達(dá)量比較 與AD組相比，下調(diào)miR-107組Aβ、APP相對(duì)表達(dá)量均較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與AD組、下調(diào)miR-107組相比，上調(diào)miR-107組Aβ、APP相對(duì)表達(dá)量均較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組細(xì)胞增殖率、凋亡率、Aβ、APP相關(guān)表達(dá)比較

圖3 各組組織學(xué)觀察(免疫組化，×400)

3 討 論

AD在所有老癡呆患者中約占有60%，嚴(yán)重影響到患者的正常生活，同時(shí)也給家庭帶來負(fù)擔(dān)〔6〕。AD病因素較為復(fù)雜，盡管目前關(guān)于該病的預(yù)防及治療藥物研究較多，但未有特別有效的治療方法〔7〕。相關(guān)研究顯示，AD存在不可逆性及隱匿性的特點(diǎn)〔8〕。隨著對(duì)AD的不斷研究，以Aβ誘導(dǎo)AD模型的研究得到較多學(xué)者認(rèn)可，其中以Aβ1～42寡聚體進(jìn)展較為顯著。同時(shí)關(guān)于miRNA功能的研究也漸漸得到人們的關(guān)注，目前，已被證實(shí)miRNA能夠通過和靶基因互補(bǔ)結(jié)合，從而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后的水平進(jìn)行調(diào)控，在較為生命活動(dòng)及疾病進(jìn)展中均有參與〔9〕。其中miR-107靶基因生物學(xué)過程均在核質(zhì)及核內(nèi)體中發(fā)生，其中包括泛素化過程及大腦皮層發(fā)育〔10〕。

miRNA為真核生物中一類單鏈小分子RNA，在哺乳動(dòng)物的基因中存在較為廣泛的調(diào)節(jié)作用，能夠在多個(gè)層面調(diào)節(jié)基因的活動(dòng)〔11〕。相關(guān)研究顯示，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)層面均有著調(diào)節(jié)作用，與Aβ1～42表達(dá)的異常具有密切聯(lián)系〔12〕。miR-107在腦內(nèi)組織中廣存在，早期AD發(fā)病過程中，其在顳葉皮層灰質(zhì)區(qū)表達(dá)活性出現(xiàn)明顯降低。miR-107能夠通過對(duì)NF-κB通路進(jìn)行抑制，進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。相關(guān)研究顯示，在鄰近大腦組織中神經(jīng)元血小板的計(jì)數(shù)及神經(jīng)元纖維纏結(jié)數(shù)出現(xiàn)增加，這與miR-107表達(dá)水平降低具有密切聯(lián)系〔13〕。本研究結(jié)果說明，miR-107參與AD中，且能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，與上述一致。

細(xì)胞死亡方式主要分別為壞死及凋亡，其中細(xì)胞凋亡也稱之為程序性細(xì)胞死亡，為正常發(fā)育及組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物學(xué)過程〔14〕。由于AD為進(jìn)行性的神經(jīng)退變性疾病。其中海馬神經(jīng)元突觸出現(xiàn)改變以及海馬神經(jīng)元凋亡，能夠造成患者出現(xiàn)記憶下降及認(rèn)知功能障礙〔15〕。相關(guān)研究顯示，在AD患者的腦部組織存在較多的凋亡神經(jīng)元，說明AD患者可能是以細(xì)胞凋亡方式，造成神經(jīng)元丟失，從而造成認(rèn)知功能減退〔16〕。本研究結(jié)果說明，上調(diào)miR-107表達(dá)調(diào)節(jié)NF-κB，能夠減輕細(xì)胞的凋亡。

NF-κB家族成員廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛存在〔17〕。NF-κB為轉(zhuǎn)錄因子，在較多基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中均有參與，在機(jī)體生理、病理狀態(tài)中具有重要的發(fā)揮作用，和較多的神經(jīng)退行性疾病具有密切相關(guān)〔18〕。IκBα、Bcl-2及Bax均為NF-κB下游因子，通過下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)及上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，有助于提高細(xì)胞的抗凋亡效應(yīng)〔19〕。本研究結(jié)果說明，通過上調(diào)miR-107表達(dá)調(diào)節(jié)NF-κB有助于提高細(xì)胞抗凋亡效應(yīng)。

AD較為典型的病理特征為細(xì)胞外β淀粉樣斑塊沉積及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)。Aβ斑由APP裂解出現(xiàn)的Aβ聚合形成，其過度磷酸化，進(jìn)而造成神經(jīng)元纖維纏結(jié)〔20〕。病理狀態(tài)下APP在β與γ分泌酶先后作用下形成Aβ，其中Aβ1～42毒性較為強(qiáng)。神經(jīng)元出現(xiàn)死亡是導(dǎo)致AD出現(xiàn)的重要機(jī)制〔21〕。隨著神經(jīng)毒性作用的增強(qiáng)，進(jìn)而使得突觸損傷及線粒體功能障礙的出現(xiàn)。本研究結(jié)果說明通過上調(diào)miR-107表達(dá)調(diào)節(jié)NF-κB有助于減輕神經(jīng)元纖維纏結(jié)情況。

綜上，在Aβ1～42誘導(dǎo)的AD細(xì)胞，通過上調(diào)miR-107調(diào)節(jié)NF-κB能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，提高細(xì)胞的抗凋亡效應(yīng)，有助于減輕神經(jīng)元纖維纏結(jié)情況。