陳鏡樓 劉敏 容楠

(江漢大學(xué) 1附屬醫(yī)院，湖北 武漢 430056；2醫(yī)學(xué)院)

良性前列腺增生(BPH)是一種衰老相關(guān)性的慢性疾病，在41～50歲男性群體中的累積發(fā)病率已超過(guò)50%，并在此后每10年增加約10%〔1〕。前列腺腺體由腺上皮和腺基質(zhì)(基質(zhì)成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等)組成。前列腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞的相互作用被認(rèn)為對(duì)維持前列腺發(fā)育和正常生理功能起重要作用〔2〕。香煙是由經(jīng)濟(jì)作物煙草(Nicotianatabacum)加工而成的商業(yè)產(chǎn)品。我國(guó)是香煙的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。香煙燃燒將產(chǎn)生超過(guò)4 700種物質(zhì)，對(duì)人體產(chǎn)生不良作用〔3〕。研究表明，香煙暴露將破壞前列腺的結(jié)構(gòu)，因此也是BPH的重要誘因〔4〕。前期研究發(fā)現(xiàn)香煙暴露促進(jìn)前列腺的膠原沉積和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化〔5〕。本文探討香煙暴露下的前列腺基質(zhì)細(xì)胞對(duì)上皮細(xì)胞的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與細(xì)胞 紅金龍牌香煙(煙堿、焦油、一氧化碳含量分別為0.6、8和11 mg/支)購(gòu)于武漢煙草(集團(tuán))有限公司。一抗Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)購(gòu)于武漢貝茵萊生物科技有限公司，鈣黏蛋白E(E-cad)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，蝸牛同源物(SNAI)1、鋅指E盒結(jié)合同源框(ZEB)1和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司。外泌體提取試劑盒購(gòu)于廣州吉賽生物科技有限公司。人前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1和人前列腺肌成纖維基質(zhì)細(xì)胞株WPMY-1由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供。細(xì)胞培養(yǎng)基和重組人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2主要儀器 MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃)，Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能)，Centrifuge5424R型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)，NanoDrop ND-1000儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)，2100型Bioanalyzer儀(美國(guó)Agilent Technologies)。

1.3實(shí)驗(yàn)流程

1.3.1共培養(yǎng)體系建立 新鮮的10%香煙煙霧提取物(CS)是通過(guò)將1支香煙燃燒的煙霧注入10 ml的培養(yǎng)基中，并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾制得〔6〕。WPMY-1細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中培養(yǎng)。RWPE-1細(xì)胞于角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清(K-SFM)培養(yǎng)基(含5 ng/ml的EGF和0.01%慶大霉素)中培養(yǎng)〔7〕。共培養(yǎng)體系采用1∶1比例的K-SFM和DMEM培養(yǎng)基〔8〕。根據(jù)我們的研究基礎(chǔ)〔5〕，WPMY-1細(xì)胞用5%CS孵育48 h后接種于共培養(yǎng)體系上室，RWPE-1細(xì)胞接種于下室。于此后的24、48和72 h收集RWPE-1細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)存活率。時(shí)間梯度(24～72 h)的選擇是基于WPMY-1在共培養(yǎng)4 d后活力下降的報(bào)道〔8〕。

1.3.2分組 NC-WPMY-1組：空白WPMY-1細(xì)胞；CS-WPMY-1組：5%CS暴露48 h的WPMY-1細(xì)胞；NC-WPMY-1-exo組：空白WPMY-1細(xì)胞來(lái)源的外泌體；CS-WPMY-1-exo組：5%CS暴露48 h的WPMY-1細(xì)胞來(lái)源的外泌體。

1.3.3WPMY-1細(xì)胞來(lái)源外泌體孵育RWPE-1細(xì)胞 WPMY-1細(xì)胞用5%CS孵育48 h后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，采用外泌體提取試劑盒收集50 ml細(xì)胞上清液中的外泌體?？瞻讓?duì)照WPMY-1細(xì)胞采用無(wú)CS的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集外泌體。通過(guò)Western印跡檢測(cè)CD63和腫瘤易感基因(TSG)101蛋白的表達(dá)對(duì)分離的外泌體進(jìn)行鑒定。用外泌體孵育RWPE-1細(xì)胞24、48和72 h后收集RWPE-1細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)存活率。

1.3.4膠原沉積和EMT評(píng)價(jià) 通過(guò)Western印跡檢測(cè)膠原蛋白Col-Ⅰ、EMT上皮標(biāo)志物E-cad和間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA及EMT轉(zhuǎn)錄因子SNAI1和ZEB1的水平評(píng)價(jià)RWPE-1細(xì)胞膠原沉積和EMT情況。收集細(xì)胞，裂解后提取細(xì)胞總蛋白并定量。于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜。PBST洗滌后，用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)后將膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，通過(guò)TANONGIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3.5高通量測(cè)序提取外泌體總RNA 使用NanoDrop ND-1000儀測(cè)量RNA濃度，OD260/OD280值1.8～2.1為合格。高通量測(cè)序由上海云序生物科技有限公司提供。去除樣品中核糖體RNA后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。通過(guò)BioAnalyzer 2100 system對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)控和定量，采用illuminaHiseq 4000測(cè)序儀進(jìn)行150 bp雙端測(cè)序。使用hisat2軟件(v2.0.4)，將高質(zhì)量reads比對(duì)到人類參考基因組(UCSC HG19)上。然后，在gtf基因注釋文件指導(dǎo)下，使用cuffdiff軟件(v2.2.1)獲得轉(zhuǎn)錄本水平長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)和基因水平mRNA的每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀數(shù)的片段數(shù)(FPKM)值，作為L(zhǎng)ncRNAs和mRNAs的表達(dá)譜，并計(jì)算樣品間的倍數(shù)變化和P值以篩選差異表達(dá)LncRNAs和mRNAs。并進(jìn)行差異LncRNA和mRNA的基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組RWPE-1細(xì)胞存活率比較 與24 h相比，各組48、72 h RWPE-1細(xì)胞存活率均顯著上升(P<0.01)。CS-WPMY-1組48 h和72 h RWPE-1細(xì)胞的存活率顯著高于NC-WPMY-1組(P<0.01)，CS-WPMY-1-exo組RWPE-1細(xì)胞存活率顯著高于NC-WPMY-1-1exo組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2各組上皮細(xì)胞膠原沉積和EMT比較 相對(duì)于NC-WPMY-1組，CS-WPMY-1組顯著性增加RWPE-1細(xì)胞Col-Ⅰ和SNAI1的表達(dá)(P<0.01)，降低E-cad 的表達(dá)(P<0.05)。相對(duì)于NC-WPMY-1-exo組，CS-WPMY-1-exo組顯著性增加RWPE-1細(xì)胞Col-I、α-SMA、ZEB1和SNAI1的表達(dá)(P<0.05)，顯著降低E-cad 的表達(dá)(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)RWPE-1細(xì)胞Col-I、α-SMA、E-cad、ZEB1和SNAI1表達(dá)水平比較

2.3外泌體差異表達(dá)基因分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，同時(shí)滿足表達(dá)量倍數(shù)>2，P<0.05且至少一組FRKM≥0.1的為顯著性差異LncRNAs和mRNAs。圖1中熱圖顯示了顯著差異lncRNAs和mRNAs的層次聚類。相對(duì)于空白WPMY-1細(xì)胞來(lái)源的外泌體，CS暴露WPMY-1細(xì)胞來(lái)源的外泌體內(nèi)成分中有197個(gè)差異表達(dá)LncRNAs(158個(gè)上調(diào)，39個(gè)下調(diào))和2 564個(gè)差異表達(dá)mRNAs(2 482個(gè)上調(diào)，82個(gè)下調(diào))。同時(shí)，對(duì)差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs進(jìn)行散點(diǎn)圖和火山圖示意。

差異表達(dá)的LncRNAs(A)和mRNAs(B)的層次聚類，表達(dá)值通過(guò)色卡表示，紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)。差異表達(dá)的LncRNAs(C)和mRNAs(D)的散點(diǎn)圖，紅色點(diǎn)表示高表達(dá)，綠色點(diǎn)表示低表達(dá)，紫色點(diǎn)表示無(wú)明顯差異。差異表達(dá)的LncRNAs(E)和mRNAs(F)的火山圖，左側(cè)紅色點(diǎn)表示高表達(dá)，右側(cè)紅色點(diǎn)表示低表達(dá)，灰點(diǎn)代表無(wú)明顯差異圖1 CS暴露WPMY-1細(xì)胞外泌體孵育組和空白對(duì)照組差異表達(dá)的LncRNA和mRNA

2.4GO和KEGG分析 表2顯示差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs的前10位GO分析結(jié)果。其中差異表達(dá)LncRNAs的GO功能主要富集于細(xì)胞成分中的細(xì)胞連接(GO：0030054)，生物過(guò)程中的細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)(GO：0071363)、對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)(GO：0070848)和細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)(GO：0045454)及分子功能中的成纖維生長(zhǎng)因子結(jié)合(GO：0017134)等。差異表達(dá)mRNAs的GO功能主要富集于生物過(guò)程中的有絲分裂細(xì)胞周期(GO：0000278)、有絲分裂細(xì)胞周期過(guò)程(GO：1903047)、細(xì)胞周期(GO：0007049)和細(xì)胞周期過(guò)程(GO：0022402)等。由此可見(jiàn)，差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增殖、細(xì)胞連接、纖維化等生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如表3所示，差異表達(dá)的LncRNAs富集于參與黏附連接(hsa04520)通路，主要涉及調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞連接等。此外，差異表達(dá)LncRNAs和mRNAs的前10位通路之中共同包括細(xì)胞周期(hsa04110)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期。

表2 差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs的GO分析

表3 差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs的KEGG通路分析

3 討 論

前列腺增生是泌尿外科和男科學(xué)常見(jiàn)的衰老相關(guān)疾病，與吸煙具有相關(guān)性〔9〕。我們前期研究發(fā)現(xiàn)香煙暴露是BPH的誘因之一，將促進(jìn)前列腺EMT和纖維化〔5〕。然而，香煙暴露誘導(dǎo)前列腺上皮表型改變的具體作用機(jī)制尚不清楚。研究顯示，上皮細(xì)胞增殖和纖維組織過(guò)度生長(zhǎng)是BPH進(jìn)展的重要病理現(xiàn)象〔10〕。器官纖維化以成纖維細(xì)胞活化、膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑等為特征。前列腺纖維化與前列腺衰老和功能障礙有關(guān)〔11〕。ECM成分和比例的變化通常指示前列腺疾病的發(fā)生。例如，當(dāng)前列腺上皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，活化的成纖維細(xì)胞刺激α-SMA和Col-I的表達(dá)，導(dǎo)致ECM成分變化和膠原沉積〔12〕。上皮標(biāo)志物E-cad的生成減少和間質(zhì)標(biāo)記物α-SMA的過(guò)度產(chǎn)生被認(rèn)為是纖維化相關(guān)EMT的特征〔13〕。EMT是細(xì)胞從上皮表型向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的生物過(guò)程，在很大程度上被轉(zhuǎn)錄因子SNAI和ZEB等激活，并隨后促進(jìn)器官纖維化的發(fā)生〔12〕。由此可見(jiàn)，前列腺上皮與間質(zhì)/間質(zhì)的相互作用是維持前列腺發(fā)育和正常功能的重要機(jī)制。因此，WPMY-1和RWPE-1細(xì)胞系被廣泛應(yīng)用于前列腺疾病上皮-基質(zhì)相互作用機(jī)制的研究中〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn)CS暴露的前列腺基質(zhì)細(xì)胞和其來(lái)源的外泌體能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，膠原沉積和EMT，研究結(jié)果提示，CS具有干預(yù)前列腺上皮-基質(zhì)細(xì)胞相互作用的效應(yīng)。

細(xì)胞向細(xì)胞外環(huán)境分泌多種內(nèi)源性囊泡。其中，外泌體是一類直徑為30～150 nm的囊泡，廣泛分布于包括前列腺液在內(nèi)的幾乎所有體液中，可攜帶各種生物功能分子(包括RNA和蛋白質(zhì)等)并將其轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞〔15〕。外泌體的功能特點(diǎn)使其在體內(nèi)細(xì)胞間信息交流中扮演重要角色。特別是在BPH缺氧微環(huán)境中，細(xì)胞會(huì)釋放更多的外泌體來(lái)促進(jìn)EMT發(fā)生〔8〕。本研究證實(shí)，CS暴露在一定程度上是通過(guò)刺激前列腺基質(zhì)細(xì)胞分泌外泌體，并傳遞到上皮細(xì)胞從而完成前列腺上皮-基質(zhì)相互作用，促進(jìn)上皮細(xì)胞EMT和膠原沉積的。

LncRNAs是一類長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸以上的非編碼RNA，已被證實(shí)參與調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移〔16〕。然而，過(guò)去對(duì)LncRNAs的研究往往聚焦于前列腺癌差異表達(dá)基因的分析〔17〕。對(duì)于LncRNAs在前列腺良性疾病(BPH等)中的作用仍有待探查。本研究通過(guò)RNA測(cè)序構(gòu)建CS暴露前列腺基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體中的LncRNAs和mRNAs差異表達(dá)譜。綜上所述前列腺基質(zhì)細(xì)胞在上皮細(xì)胞表型改變中起著重要作用。外泌體可能是前列腺上皮-基質(zhì)相互作用的媒介。外泌體差異表達(dá)LncRNAs和mRNAs在香煙暴露刺激的前列腺增生和纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。