譚帥 雷香麗 王九松 唐齊林

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 1腫瘤內(nèi)科，湖南 衡陽 421002；2腎內(nèi)科；3手足外科)

老年期是腎癌發(fā)病高峰〔1〕。手術(shù)是治愈腎癌的唯一方法，但30%左右的患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)〔2〕。腎癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床病理指標(biāo)無法完全反映其病理生理行為，因此探索早期診斷并評估患者預(yù)后的敏感標(biāo)志物，對治療方案的制定和改善患者預(yù)后具有重要意義。程序性細(xì)胞死亡是哺乳動(dòng)物長期進(jìn)化過程中形成的細(xì)胞自殺機(jī)制，能夠有效清除癌變細(xì)胞，維持正常內(nèi)環(huán)境平衡〔3〕。Beclin-1基因是參與自噬過程的特異性基因，調(diào)控細(xì)胞的自噬過程〔4〕。YKL-40蛋白與哺乳動(dòng)物的胞外基質(zhì)重構(gòu)、新生血管形成、細(xì)胞增殖密切相關(guān)〔5〕；與乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)〔6,7〕。Beclin-1及YKL-40蛋白在老年腎癌患者中的表達(dá)及作用特點(diǎn)的研究十分少見，本研究旨在探討老年腎癌患者腎癌組織、癌旁正常腎組織中Beclin-1及YKL-40蛋白表達(dá)特點(diǎn)和意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2013年1月至2017年12月南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院收治的老年腎癌患者184例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①行腎癌根治術(shù)或腎部分切除術(shù)治療；②術(shù)后病理檢查證實(shí)為腎癌；③完成3年隨訪，資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②未完成隨訪。其中男106例，女78例；年齡60～75歲，平均(66.27±5.03)歲；腫瘤分期：T1期24例，T2期42例，T3期71例，T4期47例；腫瘤直徑：≤4 cm 78例，>4 cm 106例；腫瘤分級：G1級21例，G2級48例，G3級115例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：陽性45例，陰性139例；手術(shù)方式：腹腔鏡136例；開放手術(shù)48例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 二甲苯、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、過氧化氫溶液均購于北京諾博萊德科技有限公司；鼠抗人Beclin-1單克隆抗體，鼠抗人YKL-40單克隆抗體，免疫組化檢測試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑均購于上海雅吉生物有限公司。

1.3標(biāo)本采集與處理 手術(shù)切除腎標(biāo)本后立即使用手術(shù)刀剖開腎組織，生理鹽水反復(fù)沖洗，選取合適位置切取腎癌組織和癌旁正常腎組織。使用10%甲醛固定，制作石蠟包塊，0.4 μmol/L連續(xù)切片，用于免疫組化染色。

1.4免疫組化檢測 取石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液浸泡后，加熱誘導(dǎo)修復(fù)抗原，待冷卻至室溫；加入3%過氧化氫孵育約10 min，使內(nèi)源性過氧化物酶失活；滴加鼠抗人Beclin-1單克隆抗體(1∶500倍稀釋)，鼠抗人YKL-40單克隆抗體(1∶300倍稀釋)，4℃冷藏過夜；磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，滴加二抗(1∶2 000倍稀釋)，室溫下孵育30 min，磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗；加入DAB顯色試劑室溫下靜置20 min，蘇木精重染5 min，脫水、透明后中性樹膠封存。光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞/視野。根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分：無顯色、淡黃色、黃色、棕黃色或褐色分別計(jì)0～3分。根據(jù)陽性細(xì)胞比例計(jì)分：<10%、10%～30%、31%～60%、>60%分別計(jì)0～3分。計(jì)算以上兩項(xiàng)評分乘積，≤3分為陰性表達(dá)，>3分為陽性表達(dá)。

1.5隨訪觀察 術(shù)后采取電話、家訪、門診復(fù)查等方式對老年腎癌患者進(jìn)行3年隨訪，記錄總生存期，即手術(shù)當(dāng)日至死亡日期或隨訪截止日期。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier曲線分析及多因素Cox回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1Beclin-1及YKL-40在腎癌及癌旁組織中的表達(dá) 老年腎癌患者腎癌組織中Beclin-1陽性率〔51例(27.72%)〕低于癌旁組織〔142例(77.17%)〕，YKL-40陽性率〔140例(76.09%)〕高于癌旁組織〔35例(19.02%)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2Beclin-1、YKL-40表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 腎癌組織中Beclin-1、YKL-40表達(dá)情況在不同腫瘤分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況腎癌患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、表2。

表1 Beclin-1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

表2 YKL-40表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3Beclin-1表達(dá)與老年腎癌患者生存期的關(guān)系 隨訪3年期間，184例腎癌患者生存89例(48.37%)，平均生存時(shí)間(20.58±6.15)個(gè)月。Kaplan-Meier曲線分析顯示，Beclin-1陰性表達(dá)的腎癌患者累積生存率明顯低于Beclin-1陽性表達(dá)者(χ2=15.928，P=0.000)。見圖1。

2.4YKL-40表達(dá)與老年腎癌患者生存期的關(guān)系 YKL-40陽性表達(dá)的腎癌患者累積生存率明顯低于YKL-40陰性表達(dá)的患者(χ2=18.016，P=0.000)。見圖1。

圖1 Beclin-1、YKL-40表達(dá)與老年腎癌患者生存情況的Kaplan-Meier曲線分析

2.5老年腎癌患者生存情況的單因素和多因素Cox回歸分析 單因素分析顯示，腫瘤分期〔HR(95%CI)：2.54(1.26～5.40)，P=0.002〕、腫瘤分級〔HR(95%CI)：2.21(1.14～5.08)，P=0.003〕、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔HR(95%CI)：1.79(1.06～4.24)，P=0.008〕、Beclin-1〔HR(95%CI)：2.76(1.79～5.16)，P=0.01〕及YKL-40表達(dá)〔HR(95%CI)：2.92(1.34～5.72)，P=0.000〕與老年腎癌患者生存情況有關(guān)，而性別、年齡、腫瘤直徑、手術(shù)方式與老年腎癌患者生存情況無關(guān)〔HR(95%CI)：0.95(0.56～0.98)、0.82(0.60～0.94)、0.85(0.53～0.95)、0.77(0.42～0.89)、P=0.235、0.381、0.193、0.217〕。進(jìn)一步行多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Beclin-1及YKL-40表達(dá)〔HR(95%CI)：1.95(1.26～5.40)、1.72(1.14～5.08)、1.50(1.06～4.24)、2.16(1.23～4.81)、2.38(1.31～5.46)，P=0.005、0.008、0.010、0.003、0.002〕是老年腎癌患者生存情況的獨(dú)立影響因素。

3 討 論

腎癌的發(fā)病率約占泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位，其發(fā)病機(jī)制仍未明確，現(xiàn)有研究認(rèn)為機(jī)體免疫功能與腎癌發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)〔8〕。隨著年齡的增長免疫功能異常發(fā)生率明顯增加，同時(shí)老年人群基礎(chǔ)疾病多，共同造成腎癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。目前臨床中常用的病理指標(biāo)無法全面反映腎癌的病理生理特征〔9〕。因此，探索準(zhǔn)確、敏感的腎癌標(biāo)志物，對病情診斷、預(yù)后評估、治療方案的合理制定具有重要意義。自噬現(xiàn)象是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡方式之一，具有高度保守性，參與腫瘤的發(fā)展過程〔10，11〕。Beclin-1基因是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，可通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)其他的酵母ATG蛋白，定位于自噬前體結(jié)構(gòu)中，調(diào)節(jié)自噬活性〔11～13〕。Beclin-1基因在腎癌患者中表達(dá)情況及作用特點(diǎn)的研究國內(nèi)外仍十分少見。惡性腫瘤在維持自身生物學(xué)特征的同時(shí)還存在多種共性特點(diǎn)，自噬現(xiàn)象也在其中發(fā)揮重要作用〔14〕。本研究結(jié)果提示Beclin-1可能作為抑癌基因在老年腎癌患者中發(fā)揮作用，其低表達(dá)的患者術(shù)后生存時(shí)間較長。YKL-40屬于哺乳動(dòng)物18糖基水解酶家族，與糖基水解酶類似〔15〕。相關(guān)研究顯示，YKL-40是潛在的腫瘤標(biāo)志物，能夠用于惡性腫瘤的病情評估〔16〕；小細(xì)胞肺癌患者血清YKL-40水平升高提示腫瘤惡性程度高、分期晚、預(yù)后差〔17〕；治療前YKL-40水平低的結(jié)直腸癌患者中位生存時(shí)間明顯長于治療期YKL-40水平高的患者，可推測YKL-40可作為預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)〔18〕。本研究結(jié)果提示，老年腎癌患者組織中YKL-40表達(dá)與病理特征相關(guān)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，可用于評估術(shù)后生存時(shí)間。多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Beclin-1及YKL-40表達(dá)是老年腎癌患者生存情況的獨(dú)立影響因素。隨著腫瘤分期、分級增加反映患者病變越嚴(yán)重，生存時(shí)間越短；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要轉(zhuǎn)移方式，術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移是老年腎癌患者主要死因之一〔19〕。Beclin-1和YKL-40表達(dá)是患者生存情況的獨(dú)立影響因素，進(jìn)一步證實(shí)了組織中Beclin-1和YKL-40表達(dá)可作為評估老年腎癌患者預(yù)后的標(biāo)志物，具有潛在應(yīng)用價(jià)值。