張峰 楊軍 董天崴 王爽

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

原發(fā)性高血壓是遺傳和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。我國(guó)18歲以上高血壓患病率達(dá)27.9%〔1〕，近幾年呈明顯上升趨勢(shì)，且高血壓患病率和年齡呈明顯正相關(guān)，我國(guó)高血壓患病率和流行性存在地區(qū)、城鄉(xiāng)、民族差別。北方高于南方，華北和東北屬于高發(fā)區(qū)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)高寒地區(qū)是高血壓發(fā)病的高發(fā)地帶〔2〕，而黑龍江省地區(qū)氣候寒冷、晝夜溫差大，冬長(zhǎng)夏短，屬于寒冷地區(qū)，因此是研究高血壓基因變異的理想人群。北方高寒地區(qū)人群有特殊的飲食習(xí)慣，高鹽、低葉酸飲食為其特征性，故該地區(qū)人群具有顯著代表性。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸及同型半胱氨酸(Hcy)代謝反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，其突變可引起該酶活性及功能下降，引起血清Hcy水平升高，高血壓合并高Hcy血癥(Hcy≥10 μmol/L)〔3〕，其與高血壓發(fā)病正相關(guān)，明顯增加腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于高血壓患者群體MTHFR-A1298C基因分布頻率的地區(qū)及民族差異目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)黑龍江省寒地原發(fā)性高血壓病患者進(jìn)行MTHFR-A1298C基因多態(tài)性檢測(cè)，分析寒冷地區(qū)高血壓人群基因分布特點(diǎn)及基因多態(tài)性與血清Hcy水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年1月至2019年12月黑龍江省東部地區(qū)的高血壓病普查被檢人員及佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診和病房就診的高血壓病患者，按照2018年中國(guó)高血壓防治指南原發(fā)性高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除標(biāo)準(zhǔn)：① 高血壓發(fā)病年齡<30歲；②非漢族人群；③長(zhǎng)期口服避孕藥、葉酸片者；④繼發(fā)性高血壓者。篩選出符合條件的原發(fā)性高血壓患者482例為高血壓組，隨機(jī)選取黑龍江省東部地區(qū)在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢的健康者100例為健康對(duì)照組。

1.2基線資料采集 所有入組者記錄年齡、性別、居住地、居住時(shí)間、病史、吸煙史及直系親屬家族史，測(cè)定血Hcy、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、血清三酰甘油(TG)、血清總膽固醇(TC)、血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等一般資料。兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

1.3實(shí)驗(yàn)方法 (1)檢測(cè)MTHFR-A1298C基因多態(tài)性：兩組應(yīng)用原位雜交熒光染色技術(shù)進(jìn)行MTHFR-A1298C基因檢測(cè)。根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果分為野生純合子基因型(A/A)，突變雜合子基因型(A/C)，突變純合子基因型(C/C)。采集靜脈血2 ml于EDTA-K2真空采血管中，并將其保存在4℃冰箱中冷藏備用。繼而提取白細(xì)胞、裂解保存及加樣。在濃縮白細(xì)胞的EP管中加入50 μl核酸純化試劑(耀金保)充分混勻至透明、淺綠或淺綠略顯紅色。并取1.5 μl混有純化試劑的白細(xì)胞加入藥劑基因型試劑(測(cè)序試劑盒)中應(yīng)用TL-988A熒光檢測(cè)儀進(jìn)行基因型檢測(cè)。檢測(cè)條件：給予95℃預(yù)變性5 min、95℃變性30 s、65℃復(fù)性末點(diǎn)檢測(cè)75 s，50個(gè)循環(huán)。(2)用循環(huán)酶法測(cè)定血清Hcy水平，并根據(jù)2018年中國(guó)高血壓防治指南將Hcy≥10 μmol/L定義為高Hcy血癥，將滿足高血壓伴Hcy≥10 μmol/L為高Hcy組，高血壓伴Hcy<10 μmol/L列入正常Hcy組。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組實(shí)際基因型頻率及等位基因分布頻率比較 高血壓組實(shí)際基因頻率：AA型291例(60.37%)，AC型156例(32.37%)，CC型35例(7.26%)，A、C等位基因頻率分別為76.56%、23.44%。健康對(duì)照組實(shí)際基因頻率AA型65例(65.00%)，AC型27例(27.00%)，CC型8例(8.00%)，A、C等位基因頻率分別為78.50%、21.50%。兩組間實(shí)際基因型分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.11，P=0.574)。兩組間等位基因分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.35，P=0.553)。

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn) 根據(jù)入組患者M(jìn)THFR-A1298C基因型多態(tài)性，進(jìn)行Hardy-Weiberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，高血壓組理論基因型頻率：AA型58.51%(282.02/482)，AC型35.89%(172.99/482)，CC型5.60(26.99/482)〕；健康對(duì)照組理論基因頻率：AA型61.62(61.62/100)，AC型33.76%(33.76/100)，CC型4.62%(4.62/100)；兩組實(shí)際基因型頻率及等位基因頻率與理論基因頻率組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.097，0.135)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，達(dá)到遺傳平衡，具有代表性。

2.3黑龍江省高血壓患者與已報(bào)道的我國(guó)其他地區(qū)高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C基因型及等位基因分布頻率比較 與我國(guó)其他學(xué)者已報(bào)道的中國(guó)不同地區(qū)高血壓患者〔4～6〕MTHFR-A1298C基因型頻率及等位基因分布頻率比較，黑龍江地區(qū)與新疆高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C基因型頻率〔AA型23.87%(37/155)，AC型25.81%(40/155)，CC型50.32%(78/155)〕及等位基因分布頻率(A、C等位基因頻率49.03%、50.97%)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P=0.000),與廣西高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C基因型頻率〔AA型66.21%(96/145)，AC型22.07%(32/145)，CC型11.72%(17/145)〕有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.027)，等位基因分布頻率(77.24、22.76%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.809)。黑龍江地區(qū)與云南地區(qū)高血壓患者基因型頻率〔AA型65.88%(112/170)，AC型28.24%(48/170)，CC型5.88%(10/170)；P=0.439〕及等位基因分布頻率(80.00%，20.00%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.191)。

2.4黑龍江省漢族高血壓患者與我國(guó)其他民族〔7～9〕高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C(A>C)基因型及等位基因分布頻率比較 黑龍江省漢族與銀川〔9〕高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C基因型頻率〔AA型66.88%(515/770)，AC型31.43%(242/770)，CC型1.69%(13/770)〕及等位基因分布頻率(A等位基因頻率82.60%、17.40%)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P=0.000),與新疆哈薩克族〔7〕高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C等位基因頻率(A、C等位基因頻率82.05%、17.95%)對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.027)，基因型分布頻率〔AA型67.69%(132/195)，AC型28.72%(56/195)，CC型3.59%(7/195)〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.091)。黑龍江省漢族與青海藏族〔8〕高血壓患者對(duì)比基因型頻率〔AA型56.67%(34/60)，AC型38.33%(23/60)，CC型5.00%(3/60)；P=0.581〕及等位基因分布頻率(75.83%、24.17%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.860)。

2.5MTHFR-A1298C基因型與血清Hcy水平的關(guān)系 高Hcy組381例，其中AA型239例(62.73%)，AC型123例(32.28%)，CC型19例(4.99%)，A、C等位基因頻率分別為78.87%，21.13%。Hcy正常組101例，其中AA型52例(51.49%)，AC型33例(32.67%)，CC型16例(15.84%)，A、C等位基因頻率分別為67.82%，32.18%。高Hcy組和正常Hcy組間，3種基因型分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，兩組間應(yīng)用χ2分割法重新估計(jì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行兩兩比較，兩組間AA型與AC基因型頻率分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.399)；AC與CC、AA與CC型基因型分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.003，P=0.001)；A與C等位基因基因頻率在組間分布也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。

3 討 論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織資料顯示，在所有死亡危險(xiǎn)因素中，高血壓居首位，約占全球總死亡率的13%〔10〕。高血壓發(fā)病率與年齡、地域呈明顯相關(guān)性。我國(guó)黑龍江地區(qū)位于我國(guó)東北部，是中國(guó)最北、緯度最高、經(jīng)度最東的省份，最冷月平均溫度≤-10℃，屬于寒冷地區(qū)的代表省份，獨(dú)特的氣候造成了該地區(qū)特有的疾病發(fā)生概率及用藥療效。既往研究〔2〕報(bào)道溫差較大時(shí)可引起患者血壓顯著升高，東北患病率>除去東北其他地區(qū)的北方患病率>南方患病率。近年以基因?qū)虻膫€(gè)體化精準(zhǔn)治療為基礎(chǔ)，引導(dǎo)了一個(gè)新的醫(yī)學(xué)時(shí)代。其本質(zhì)就是通過(guò)檢測(cè)基因組、蛋白組等技術(shù)找到疾病靶點(diǎn)，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)精準(zhǔn)治療，減少副作用及醫(yī)療資源的浪費(fèi)。然而基因的分布頻率存在地域及種族差異，不能盲目引用相應(yīng)數(shù)據(jù)，需要我國(guó)學(xué)者根據(jù)我國(guó)不同地區(qū)差異的特點(diǎn)，分析出我國(guó)本地區(qū)基因分布的特點(diǎn)。MTHFR是葉酸及Hcy代謝反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，高Hcy通過(guò)抑制內(nèi)源性硫化氫的生成活化血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，作用于血管緊張素受體,導(dǎo)致血壓升高及血管管壁增生等一系列病理過(guò)程〔11，12〕，MTHFR具有多個(gè)基因位點(diǎn)。MTHFR-C677T和MTHFR-A1298C是目前研究最多且臨床意義較大的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。目前MTHFR-C677T基因多態(tài)性與H型高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病和血脂水平的關(guān)系已被廣泛研究，明確血清Hcy水平的顯著升高與攜帶突變等位基因T的純合子個(gè)體有密切關(guān)系。也有研究顯示〔9〕單純MTHFR-A1298C基因多態(tài)性與高血壓發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)，當(dāng)MTHFR-C677T與A1298C復(fù)合基因突變對(duì)Hcy代謝影響較大。一項(xiàng)納入我國(guó)10個(gè)地區(qū)共15 357名漢族人群MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C、MTRR-A66G基因多態(tài)性分析，研究得出其基因多態(tài)性在漢族人群分布中具有明顯地域差異，北方人群基因變異率明顯高于南方〔13〕。

本研究結(jié)果提示，高寒地區(qū)攜帶MTHFR-A1298C基因型高血壓患者與健康者的各基因型及等位基因分布頻率差異不大，考慮高寒地區(qū)原發(fā)性高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C基因無(wú)明顯變異。本研究表明，地域差異可影響MTHFR-A1298C基因的變異，原發(fā)性高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C基因的變異率及等位基因分布頻率受地域、氣候、生活環(huán)境的影響。另外，提示高血壓人群中MTHFR-A1298C基因型頻率及等位基因頻率不僅存在地域性差異，亦存在民族間差異。

血清Hcy濃度的升高受多種因素影響，在不考慮飲食、環(huán)境等外部因素情況下，由其關(guān)鍵酶MTHFR基因突變引起該酶活性及功能下降，Hcy水平升高可能是發(fā)病的主要原因之一。對(duì)MTHFR-A1298C的研究不僅是單純?yōu)榱擞行Э刂蒲獕核剑彩菍?duì)心腦血管疾病的進(jìn)一步認(rèn)知。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTHFR-A1298C基因多態(tài)性與血清Hcy水平具有相關(guān)性。故高血壓患者可根據(jù)MTHFR-A1298C基因多態(tài)性合理化調(diào)整葉酸補(bǔ)充量，降低血清Hcy水平，同時(shí)降低心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，黑龍江省寒地高血壓患者M(jìn)THFR-A1298C基因多態(tài)性存在地域及民族差異，其基因多態(tài)性與血清Hcy水平明顯相關(guān)。但對(duì)基因方面的研究還需進(jìn)一步探索，今后在更多未知基因及MTHFR-A1298C、C677T復(fù)合突變的研究中可以進(jìn)一步探討。