高華健，林 珊，魯竹青，王天一，王乙連，褚劍鋒，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)陳可冀學(xué)術(shù)思想傳承工作室，福建 福州 350122）

高血壓是以體循環(huán)動(dòng)脈壓升高為主要表現(xiàn)的一種常見(jiàn)疾?。?］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone systerm，RASS）的激活與高血壓關(guān)系密切［2］，其中血管緊張素Ⅱ（angio?tensin Ⅱ，Ang Ⅱ）可以收縮血管引起血壓上升，在持續(xù)的高血壓以及Ang Ⅱ的共同作用下，會(huì)引起心臟損傷，使心臟炎癥因子升高，升高的炎癥因子又會(huì)加重心臟損傷，引起心肌肥厚，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)［3-4］。雖然以天麻鉤藤藥對(duì)作為君藥的方劑如天麻鉤藤飲等常用于治療頭痛、眩暈和高血壓，但單獨(dú)研究天麻鉤藤藥對(duì)治療高血壓心臟損傷的實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要探討天麻鉤藤藥對(duì)高血壓小鼠心臟損傷的影響及機(jī)制，為臨床應(yīng)用該藥對(duì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16周齡的SPF級(jí)C57BL/6小鼠18只，雄性，體質(zhì)量（25±30）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0016，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。飼養(yǎng)在室溫22～25℃、相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境中，每天光照/黑暗各12 h，自由進(jìn)食、飲水。動(dòng)物處理方法符合中華人民共和國(guó)科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材 天麻、鉤藤均購(gòu)自安國(guó)市一方藥業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 伊紅（貨號(hào)：G1100）、蘇木素（貨號(hào)：G1140）、Masson三色染色試劑盒（貨號(hào)：G1340）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；AngⅡ（貨號(hào)：120183）、IL-6抗體（貨號(hào)：208113）、TNF-α抗體（貨號(hào)：41504）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：KIT-9720）；植入式膠囊微滲透壓泵（美國(guó)ALZET公司，貨號(hào)：2004）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CODA無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓測(cè)量?jī)x（美國(guó)Kent Scientific公司）；彩色多普勒超聲診斷儀（加拿大Visual Sonics公司）；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica有限公司）；生物組織包埋機(jī)（湖北孝感亞光有限公司）；光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica有限公司，型號(hào)：DM4000B）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物模型建立 18只雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和藥對(duì)組，每組6只。模型組和藥對(duì)組在小鼠肩胛背部植入含有Ang Ⅱ的膠囊微滲透壓泵，以500 ng/（kg·min）持續(xù)釋放Ang Ⅱ，持續(xù)28 d［5-9］；對(duì)照組在小鼠肩胛背部皮下植入不含Ang Ⅱ的膠囊微滲透壓泵，同期泵入生理鹽水。

2.2 造模成功判定 分別于造模前1天，造模第7、14、21、28天測(cè)量血壓，當(dāng)血壓較造模前1天血壓明顯上升且收縮壓≥140 mm Hg及舒張壓≥90 mm Hg時(shí)判定造模成功［10-12］。本實(shí)驗(yàn)造模組造模后第7天血壓已大幅升高，第14天均已進(jìn)入高血壓狀態(tài)。

2.3 天麻鉤藤藥液制備 取天麻10 g、鉤藤10 g加入200 mL蒸餾水中煎煮30 min，過(guò)濾并收集藥液，再加入蒸餾水煎煮1次后將2次藥液合并，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除多余水分，將藥液體積濃縮至20 mL，此濃度下1 mL藥液生藥含量視為1 g，濃度為1 g/mL，最后放入高壓鍋中高壓滅菌，分裝凍存于-80 ℃冰箱。使用時(shí)取出，在室溫下解凍稀釋后用于灌胃。

2.4 動(dòng)物分組與給藥 造模第1天開(kāi)始給藥，根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中“人和動(dòng)物按體表面積折算等效表劑量比率表”計(jì)算［13］，以人體劑量20 g/d換算，藥對(duì)組根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化調(diào)整母藥液濃度，以天麻鉤藤生藥量2.6 g/（kg·d）配置天麻鉤藤藥液，每次灌胃0.2 mL，對(duì)照組和模型組用等體積的生理鹽水灌胃，每日上午10點(diǎn)灌胃1次，持續(xù)4周。

2.5 動(dòng)物取材 造模第28天后腹腔注射2%異氟烷麻醉小鼠后，去頭處死小鼠，開(kāi)胸取出心臟組織，置于冰上，剔除大血管及結(jié)締組織，去除心房和心尖，只保留心室部分。將心臟組織浸入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片。

2.6 觀察指標(biāo)

2.6.1 血壓 造模前1天及造模后第7、14、21、28天分別測(cè)量1次血壓，使用CODA無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓計(jì)測(cè)量小鼠血壓，每次預(yù)測(cè)試5次血壓，然后正式測(cè)量15次血壓。收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓均取平均值。

2.6.2 動(dòng)物超聲檢測(cè)心臟功能 取材當(dāng)天用異氟烷麻醉小鼠后，去除胸部毛發(fā)，采用彩色多普勒超聲診斷儀觀察3組小鼠心臟超聲影像，并分析左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）、室間隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）。通過(guò)公式計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）。

2.6.3 HE染色法觀察心臟左心室組織的病理學(xué)表現(xiàn) 用切片機(jī)切取4 μm心臟左心室組織置于載玻片上，放入60 ℃烤箱中烘烤1 h后，進(jìn)行脫蠟和水化操作，然后用蘇木素染色1 min，鹽酸酒精分化1 s，用伊紅染色5 s，風(fēng)干后用中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

2.6.4 免疫組化法檢測(cè)心臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平 將心臟組織切片置于60 ℃烤箱中烘烤1 h后，先進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化操作；然后放入100 ℃的抗原修復(fù)液中浸泡10 min后，在室溫條件下冷卻，隨后打開(kāi)免疫組化試劑盒（其中含有過(guò)氧化氫酶、封閉液、羊抗小鼠/兔IgG聚合物、鏈霉素等試劑），先滴加過(guò)氧化氫酶反應(yīng)10 min，再用封閉液封閉1 h；然后滴加1抗（抗體稀釋比例TNF-α為1∶100，IL-6為1∶50），并置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日滴加羊抗小鼠/兔IgG聚合物反應(yīng)1 h，滴加鏈霉素反應(yīng)10 min；然后進(jìn)行DAB染色，再用蘇木素染核，最后在自來(lái)水中返藍(lán)，風(fēng)干并用中性樹(shù)膠封片；最后在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，每個(gè)組織切片拍攝6個(gè)400倍光學(xué)顯微鏡下的視野，采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性率分析，蛋白表達(dá)水平采用陽(yáng)性率表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié) 果

4.1 3組小鼠血壓比較 造模前3組收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；造模第7天開(kāi)始，模型組、藥對(duì)組與對(duì)照組比較收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓明顯升高（P均＜0.05）；造模第28天藥對(duì)組與模型組比較，收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓明顯降低（P均＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 3組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血壓比較

4.2 3組小鼠LVEF、LVFS比較 與對(duì)照組小鼠比較，模型組LVEF、LVFS均降低（P均＜0.05），與模型組比較，藥對(duì)組LVEF、LVFS均升高（P均＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 3組小鼠超聲心動(dòng)圖和LVEF、LVFS比較

4.3 3組小鼠心臟左心室組織病理學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組小鼠左心室心肌無(wú)壞死變性；模型組小鼠可見(jiàn)心肌變性和壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（如圖中箭頭標(biāo)記位置）；藥對(duì)組小鼠較模型組改善明顯，心肌細(xì)胞排列未見(jiàn)變性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖3。

圖3 3組小鼠左心室組織病理HE染色圖（×400）

4.4 3組小鼠心臟組織TNFα、IL-6蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組心臟組織中TNF α蛋白表達(dá)水平升高；與模型組比較，藥對(duì)組心臟組織中TNF α蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），見(jiàn)圖4。免疫組化檢測(cè)心臟組織中IL-6顯示：與對(duì)照組比較，模型組心臟組織中IL-6蛋白表達(dá)水平明顯升高；與模型組比較，藥對(duì)組心臟組織中IL-6蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），見(jiàn)圖5。蛋白表達(dá)水平用陽(yáng)性率表示。

圖4 3組小鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平比較圖（×400）

圖5 3組小鼠IL-6蛋白表達(dá)水平比較圖（×400）

5 討 論

天麻鉤藤藥對(duì)具有平抑肝陽(yáng)、熄風(fēng)止痙的功效，是天麻鉤藤飲、清眩降壓湯等方劑的君藥。RAAS系統(tǒng)過(guò)度激活可影響血壓水平［14］，AngⅡ具有強(qiáng)烈的血管收縮效應(yīng)［15］，導(dǎo)致血壓上升。此前已有研究表明天麻素可以舒張椎基底動(dòng)脈，改善供血不足，具有舒張血管的能力［16］，而鉤藤堿和異構(gòu)藤堿則可以通過(guò)阻滯鈣離子通道的方式舒張血管降低血壓［17］，含有這些單體成分的天麻鉤藤藥對(duì)也可能是通過(guò)舒張血管發(fā)揮降低血壓的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為：一方面高血壓病可以誘發(fā)心臟炎癥，引起心臟損傷；另一方面由于心血管系統(tǒng)壓力負(fù)荷的增加，引起心肌肥厚，導(dǎo)致心室重構(gòu)［18］，影響心臟的射血功能，心臟LVEF和LVFS指標(biāo)會(huì)降低。高血壓病早期心臟炎癥因子TNF-α和IL-6可明顯增加［19］，高血壓可刺激TNF-α的合成［20］，而TNF-α可引起心肌肥大和細(xì)胞凋亡［21］。此外，高血壓還可導(dǎo)致心肌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖以及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致心臟損傷從而影響心臟的射血功能［22-23］。本課題成功構(gòu)建了AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型，通過(guò)該模型觀察天麻鉤藤藥對(duì)的降壓效果以及改善高血壓小鼠心臟損傷和射血功能的作用。研究結(jié)果顯示：藥對(duì)組小鼠心臟組織中TNF-α和IL-6水平與模型組小鼠比較明顯降低，提示藥對(duì)可以減輕高血壓引起的炎癥反應(yīng)；HE染色結(jié)果提示藥對(duì)組小鼠心臟損傷明顯減輕，心臟超聲結(jié)果提示藥對(duì)組LVEF和LVFS相對(duì)于模型組明顯升高，提示藥對(duì)可以改善高血壓小鼠的心臟射血功能。

綜上所述，天麻鉤藤藥對(duì)作為臨床應(yīng)用廣泛的一種平肝潛陽(yáng)的中藥配伍，可以使高血壓小鼠的血壓降低，減輕心臟損傷，改善高血壓小鼠心臟射血功能，為臨床實(shí)踐應(yīng)用天麻鉤藤藥對(duì)防治高血壓病提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。