關(guān)致穎， 潘建章,2， 方 群*,2,3

(1.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310058；2.浙江大學(xué)杭州國(guó)際科創(chuàng)中心,浙江杭州 311200；3.浙江大學(xué)激發(fā)態(tài)材料浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310007)

1 引言

細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，生物體內(nèi)組成不同、功能各異的多種細(xì)胞中時(shí)刻進(jìn)行著復(fù)雜的生命活動(dòng)[1]。蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)功能的直接執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學(xué)層面的差異標(biāo)志著細(xì)胞功能的差異[2]。基因表達(dá)過程從DNA、mRNA到蛋白質(zhì)，存在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后水平三個(gè)層次的調(diào)控，這使得組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性大大降低。蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾(Post-Translation Modification,PTM)等過程均不能從其基因編碼序列中預(yù)測(cè)，只能從功能蛋白的層面展開分析。因此，從蛋白質(zhì)組學(xué)層面展開深入研究具有重大意義。

質(zhì)譜(Mass Spectrometry,MS)作為一種靈敏度和分辨率極高的分析方法，可在無(wú)標(biāo)記的情況下直接測(cè)定樣品離子的質(zhì)量數(shù)與電荷數(shù)之比(質(zhì)荷比，m/z)。20世紀(jì)80年代末,基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)[3]和電噴霧電離(Electron Spray Ionization,ESI)[4]兩種軟電離技術(shù)的誕生推動(dòng)了生物質(zhì)譜的快速發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽等生物大分子快速、精確的測(cè)定[5]?；谫|(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法主要有自上而下(Top-down)[6 - 8]和自下而上(Bottom-up)[9 - 13]兩種策略。自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)分析能夠?qū)?fù)雜的生物樣品提供足夠的鑒定深度和廣度，已成為主流的蛋白質(zhì)組學(xué)方法之一，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的鑒定及其PTM分析中。在以液相色譜-質(zhì)譜(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)分析系統(tǒng)為基礎(chǔ)的自下而上鳥槍法(Shotgun)蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，蛋白質(zhì)需要在進(jìn)入LC-MS分析系統(tǒng)前被蛋白酶消化成分子量更小的肽段。常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)前處理操作主要包括以下步驟：首先，使用細(xì)胞裂解劑破碎細(xì)胞膜，釋放其中的蛋白質(zhì)；其次，加入還原劑，使蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂并形成半胱氨酸殘基；之后加入烷基化試劑將半胱氨酸殘基烷基化使其無(wú)法再次形成二硫鍵，從而破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，將其展開為長(zhǎng)鏈，使切割位點(diǎn)充分暴露。上述每個(gè)步驟的時(shí)間通常都不到1 h。第四步是加入胰蛋白酶，將蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈消化成肽段，這一過程通常要求37 ℃下過夜反應(yīng)，反應(yīng)后加入甲酸調(diào)節(jié)體系酸堿度并終止反應(yīng)。樣品經(jīng)脫鹽處理后，送入LC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分離和檢測(cè)，單個(gè)樣品的分離檢測(cè)時(shí)間通常在2 h以內(nèi)。顯然，在整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)分析過程中，過夜的胰蛋白酶消化是最關(guān)鍵也是最耗時(shí)的一步，耗時(shí)數(shù)小時(shí)以上的酶解反應(yīng)制約了蛋白質(zhì)組學(xué)前處理操作的通量和效率。酶解反應(yīng)的完全性和專一性對(duì)于蛋白質(zhì)及其序列的鑒定起到?jīng)Q定性的作用，酶解程度受到酶的種類和活性、反應(yīng)體系酸堿度(pH值)、溫度、時(shí)間等因素影響。探索能夠顯著加快胰酶消化速度的方法能夠顯著提高蛋白組學(xué)分析的效率，以應(yīng)對(duì)大規(guī)模、高通量的分析需求。以下，本文將從引入額外能量、縮小反應(yīng)體系體積、改變酶試劑形態(tài)三種策略來(lái)介紹近年來(lái)蛋白質(zhì)快速酶解研究工作的進(jìn)展。

2 引入額外能量的快速酶解策略

蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)效率取決于酶分子的活性、蛋白質(zhì)切割位點(diǎn)的暴露程度、兩種分子間發(fā)生碰撞及相互作用的幾率等因素。向蛋白質(zhì)酶解體系提供額外的能量，能夠向體系提供充足的反應(yīng)溫度，提升酶分子的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子中各類化學(xué)鍵的振動(dòng)，幫助蛋白質(zhì)分子暴露切割位點(diǎn)并與活躍的酶分子相結(jié)合，從而顯著加快蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)的進(jìn)程。

紅外光是波長(zhǎng)在770 nm到1 mm之間的電磁波，紅外激光可用于許多生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)和疾病的治療，其中發(fā)射波長(zhǎng)約為800 nm的近紅外激光應(yīng)用尤為廣泛[14 - 18]。這種近紅外激光即使在高功率和長(zhǎng)時(shí)間照射下也可以很容易地穿透水且?guī)缀鯖]有能量損失，相較于其它激光輻射而言，對(duì)生物組織造成不可逆損傷的概率明顯降低。如果激光功率足夠高，它能夠加速熱量積累并提高生物過程中的組織溫度。除了光熱效應(yīng)外，高能近紅外輻射還可以激發(fā)組織內(nèi)有機(jī)成分化學(xué)鍵的振動(dòng)，提高分子水平的反應(yīng)活性。對(duì)于蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)而言，近紅外激光的熱效應(yīng)能夠幫助胰酶維持在適宜的反應(yīng)溫度且不損傷蛋白質(zhì)和胰酶的活性，對(duì)蛋白質(zhì)分子中的N-H、C-O、C-N鍵振動(dòng)的促進(jìn)作用有可能幫助蛋白質(zhì)暴露更多的胰蛋白酶切割位點(diǎn)，從而有效提升酶解反應(yīng)的效率。

2008年，Wang等[19]首次將紅外光用于提升胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)的效率。他們將蛋白質(zhì)∶胰蛋白酶=40∶1(w/w)的混合溶液置于密封透明的離心管中，在250 W紅外燈照射下進(jìn)行酶解反應(yīng)，通過熱電偶溫度計(jì)維持溶液溫度在37 ℃。結(jié)果顯示，該方法可將牛血清白蛋白(Albumin from Bovine Serum,BSA)和肌紅蛋白(Myoglobin,MYO)的消化時(shí)間縮短到5 min，通過MALDI-TOF MS鑒定序列覆蓋率分別為69%(BSA)和90%(MYO)，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法38%(BSA)和69%(MYO)的消化結(jié)果。2010年，Yao等[20]使用功率為5 W、波長(zhǎng)為808 nm的光纖耦合二極管紅外激光照射蛋白質(zhì)和胰酶的混合溶液來(lái)加速酶解反應(yīng)的進(jìn)程。如圖1a，紅外激光器照射在密封的透明離心管或不銹鋼 MALDI 靶板上，輻照度約為25.5 W/cm2。結(jié)果顯示，使用紅外激光照射能夠?qū)㈦x心管內(nèi)的肌紅蛋白酶解反應(yīng)縮短到幾十秒，且所得序列覆蓋度略高于過夜酶解12 h的樣品。對(duì)于MALDI靶板上的樣品，紅外激光照射可將酶解過程縮短至5 s，所得蛋白質(zhì)序列覆蓋度和離心管內(nèi)溶液樣品基本相同。實(shí)驗(yàn)顯示紅外激光對(duì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解效率也有提升作用，但不如離心管內(nèi)溶液反應(yīng)的效果，可能是由于808 nm的紅外激光更容易穿透含水量高的樣品。文章使用該方法進(jìn)行大鼠腦提取物的前處理，酶解時(shí)間為1 min，用LC-MS/MS鑒定，得到728條肽段和134個(gè)蛋白質(zhì)。為探究激光熱效應(yīng)對(duì)反應(yīng)的實(shí)際作用，他們將離心管置于冰水浴中并照射激光，以控制溶液在反應(yīng)過程中的溫度。結(jié)果顯示，冰水浴中樣品所得的BSA序列覆蓋度(26%)低于不加冰水浴的結(jié)果(42%)，說(shuō)明紅外激光的熱效應(yīng)是促進(jìn)蛋白質(zhì)酶解的一個(gè)重要因素，但與此同時(shí)也存在其他作用機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，2011年Zhang等[21]將紅外激光與固定化酶反應(yīng)器(Immobilization Enzyme Reactor,IMER)聯(lián)用來(lái)提高蛋白質(zhì)酶解的效率。激光輔助IMER蛋白酶解系統(tǒng)如圖1b所示，IMER通過胰蛋白酶丙烯?；驮凰嗑酆蟽刹椒磻?yīng)整體固定在毛細(xì)管中，長(zhǎng)度約為1 cm。實(shí)驗(yàn)使用發(fā)射波長(zhǎng)為808 nm、功率為5 W的光纖耦合二極管紅外激光器，光纖透鏡和IMER之間的距離固定為10 cm。通過注射泵將蛋白質(zhì)溶液注入固定有IMER的毛細(xì)管，蛋白質(zhì)消化過程可在60 s內(nèi)完成，使用MALDI-TOF MS鑒定得到BSA的序列覆蓋率為33%，細(xì)胞色素c(Cytochrome c,Cyt-c)的序列覆蓋率為73%，β-酪蛋白(Beta-Casein,β-casein)的序列覆蓋率為22%，與常規(guī)溶液中反應(yīng)14 h所得蛋白質(zhì)序列覆蓋度基本相同，顯著高于僅使用IMER的效果。蛋白質(zhì)N-末端的靶向分析有助于闡明成熟蛋白質(zhì)N-末端的起始位點(diǎn)和翻譯后修飾。Li等[22]將紅外激光輔助蛋白質(zhì)酶解的方法用于蛋白質(zhì)的N-末端分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種蛋白酶解方法所得的4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的肽段數(shù)量和序列覆蓋率基本相同，而紅外激光輔助酶解的方法可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)中N-末端肽的釋放。與傳統(tǒng)的過夜消化相比，激光輔助消化的方法從小鼠肝臟中識(shí)別出的N-末端肽數(shù)量提高了28.3%，消化時(shí)間成本從過夜縮短到40 s。

微波是波長(zhǎng)在0.01～1 m、頻率在0.3～30 GHz之間的電磁輻射。作為常見的熱源之一[23]，微波加熱的原理是促進(jìn)物質(zhì)內(nèi)部極性分子的高頻往復(fù)運(yùn)動(dòng)，它無(wú)需熱傳導(dǎo)過程即可使物質(zhì)內(nèi)外均勻地受熱升溫，這使得其加熱效率遠(yuǎn)高于常規(guī)熱源。將微波加熱運(yùn)用于化學(xué)反應(yīng)當(dāng)中，可以有效地提升反應(yīng)的產(chǎn)率和效率[24 - 32]。對(duì)于蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)而言，選擇適當(dāng)?shù)奈⒉üβ始凹訜釙r(shí)長(zhǎng)，可以顯著加速酶解反應(yīng)的進(jìn)程。

2002年，Pramanik等[33]使用最大功率為300 W、具有溫控功能的單束微波發(fā)生器產(chǎn)生微波，實(shí)現(xiàn)了微波輔助的溶液內(nèi)蛋白質(zhì)快速酶解。實(shí)驗(yàn)使用胰蛋白酶∶蛋白質(zhì)=1∶25(w/w)的比例處理細(xì)胞色素c、泛素、溶菌酶、肌紅蛋白和干擾素-2b，反應(yīng)溫度設(shè)定在37 ℃，微波照射10 min，使用 MALDI-TOF MS或ESI MS技術(shù)進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)方法所需的數(shù)小時(shí)相比，微波輔助可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成蛋白質(zhì)的消化。為了研究微波照射加速蛋白質(zhì)酶解的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)在不同的微波溫度設(shè)置下進(jìn)行干擾素-2b的酶解，并在不同時(shí)間點(diǎn)采集反應(yīng)樣品，結(jié)果顯示，溶液溫度快速升高到60 ℃以上將大大增強(qiáng)酶解反應(yīng)效率。為進(jìn)一步驗(yàn)證快速升溫是否對(duì)酶解反應(yīng)的加速有重要作用，在沒有微波照射的情況下將反應(yīng)混合物放入預(yù)熱至60 ℃的加熱塊中，所測(cè)得的酶解情況與微波實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果相似，說(shuō)明反應(yīng)溫度的快速升高是微波加速酶解反應(yīng)的重要原因之一。Lin等[34]研究了在不同種類溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行微波輻射加速蛋白質(zhì)酶解的反應(yīng)情況。有機(jī)溶劑具有促進(jìn)蛋白質(zhì)變性的作用，在傳統(tǒng)酶解實(shí)驗(yàn)中，加入甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑雖然能促進(jìn)蛋白底物的變性，但同時(shí)會(huì)使胰蛋白酶失去活性。使用600 W微波爐產(chǎn)生微波輻射，將肌紅蛋白、細(xì)胞色素c、溶菌酶和泛素作為底物，胰酶∶蛋白質(zhì)比例為1∶25(w/w)，反應(yīng)時(shí)間為10 min。結(jié)果顯示，在微波作用下，乙腈、甲醇和氯仿中的胰酶酶解反應(yīng)消化效率和所得蛋白質(zhì)的序列覆蓋度均較常規(guī)酶解反應(yīng)有顯著提升。這些結(jié)果表明，微波輻射能夠在一定程度上提高蛋白質(zhì)酶解體系對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性，使得酶解效率進(jìn)一步提升。Sun等[35]使用850 W微波爐產(chǎn)生微波，將200 μL 1 mg/mL BSA溶液置于0.6 mL離心管中，加熱時(shí)在離心管旁放置1 000 mL水吸收多余能量，微波加熱時(shí)間為1 min。實(shí)驗(yàn)比較了不同的反應(yīng)條件的結(jié)果，說(shuō)明對(duì)于快速酶解反應(yīng)，蛋白質(zhì)還原步驟較為重要而烷基化步驟可以省略。對(duì)于凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)，將樣品放于1.5 mL離心管微波加熱5 min可得到比常規(guī)實(shí)驗(yàn)更好的消化效率。在使用BSA對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化后，他們將該系統(tǒng)應(yīng)用于人尿液提取蛋白和酵母裂解產(chǎn)物這兩種復(fù)雜樣品中，能夠分別在6 min 或25 min內(nèi)完成溶液中(人尿液提取蛋白)或凝膠中(酵母裂解物)的蛋白質(zhì)混合樣品前處理，獲得了與常規(guī)過夜酶解等效或更佳的反應(yīng)效果，顯示了微波輔助酶解技術(shù)在復(fù)雜生化樣品分析中的應(yīng)用潛力。Zhao等[36]開發(fā)了一種集成化的蛋白質(zhì)樣品制備方法imFASP，將原位過濾器輔助的樣品預(yù)處理方法和微波輔助的胰酶酶解方法結(jié)合，可在1 h內(nèi)高效地處理微克至納克級(jí)的復(fù)雜蛋白樣品。如圖1c所示，首先，將溶解在8 mol/L尿素中的蛋白質(zhì)上樣至截留分子量為10 kDa的過濾器上，然后進(jìn)行原位蛋白質(zhì)預(yù)濃縮、變性、還原、烷基化和微波輔助胰蛋白酶消化。與傳統(tǒng)溶液中樣品前處理的鑒定結(jié)果(1 952個(gè)蛋白質(zhì)和18 645個(gè)肽段)相比，imFASP方法從45 mg大腸桿菌蛋白質(zhì)提取物中鑒定到的結(jié)果(2 215個(gè)蛋白質(zhì)，23 012個(gè)肽段)更高，且樣品前處理通量提高了14倍。當(dāng)將大腸桿菌細(xì)胞裂解物的量降至50～500 ng的水平時(shí)，imFASP方法相對(duì)于傳統(tǒng)溶液過夜酶解的方法，對(duì)蛋白質(zhì)和肽的鑒定數(shù)分別提高了30%和44%，說(shuō)明imFASP方法在微量蛋白質(zhì)組樣品的分析方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，有望成為高效、高通量的微量蛋白質(zhì)組分析方法。

圖1 引入額外能量的蛋白質(zhì)快速酶解系統(tǒng)[20,21,36]Fig.1 Rapid enzymatic proteolysis systems based on introducing additional energy[20,21,36]

超聲波作為一種波長(zhǎng)很短的機(jī)械波，也被用于加速蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)。2005年，Lopez-Ferrer等[37]首次使用高強(qiáng)度超聲探頭進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解。2007年，Rial-Otero等[38]報(bào)道了一種使用基于超聲反應(yīng)器的加速蛋白質(zhì)酶解動(dòng)力學(xué)的新方法。他們將兩種不同的超聲發(fā)生裝置——超聲反應(yīng)器和超聲探頭分別用于蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)中，建立了超聲波輔助蛋白質(zhì)酶消化(Ultrasonic-assisted Protein Enzymatic Digestion,USAPED)分析方法，通過MALDI-TOF MS鑒定蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜。作者優(yōu)化了胰蛋白酶/蛋白質(zhì)比例、超聲時(shí)間、超聲波振幅、蛋白質(zhì)底物濃度等一系列反應(yīng)條件。結(jié)果顯示，兩種超聲發(fā)生裝置最佳的胰蛋白酶/蛋白質(zhì)比例和能夠檢出的最低蛋白質(zhì)濃度基本相同，所用胰蛋白酶的量高于常規(guī)酶解反應(yīng)體系的用量。在同樣使用50%超聲振幅的情況下，超聲探頭消化蛋白質(zhì)所需的時(shí)間(60 s)比超聲反應(yīng)器(120 s)更短，但使用超聲反應(yīng)器獲得的MALDI-TOF MS譜圖更清晰，標(biāo)準(zhǔn)偏差更小。此外，超聲反應(yīng)器有六個(gè)樣品通道，樣品前處理的通量更高，更加適用于小體積樣品，而超聲探頭一次只能處理一個(gè)樣品，易造成微量樣品的攜出損失。

3 縮小反應(yīng)體系體積的快速酶解策略

微反應(yīng)體系具有不同于常規(guī)毫升至微升級(jí)體系的反應(yīng)特征和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在微米級(jí)反應(yīng)體系(如微液滴或微通道)中微尺度效應(yīng)凸顯，物質(zhì)傳質(zhì)傳熱加快，反應(yīng)的效率會(huì)得到顯著的提升。微米級(jí)的微液滴可以通過電噴霧、微流體、紙噴霧等多種方法產(chǎn)生[39 - 45]。微液滴體系被廣泛運(yùn)用于加速各種類型的單相或雙相有機(jī)反應(yīng)，這些反應(yīng)往往動(dòng)力學(xué)過程緩慢，在常規(guī)大體積反應(yīng)中需要加入特定的催化劑[46 - 49]。微液滴反應(yīng)過程結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)也被用于研究快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，推進(jìn)化學(xué)合成、納米材料合成等方面的研究[50 - 53]。微液滴內(nèi)反應(yīng)速率顯著提升的確切原因目前尚未完全明確，但通常推測(cè)是與微尺度體系內(nèi)的各種因素如液滴大小、表面電荷、溶劑組成、液滴蒸發(fā)等[54,55]有關(guān)。微液滴除了在有機(jī)合成方面發(fā)揮重要作用外，水性微滴能夠提供與生命體系兼容的環(huán)境，故其在促進(jìn)生化反應(yīng)方面也有很大潛力。

2020年，Zhong等[56]使用電噴霧質(zhì)譜噴霧過程中產(chǎn)生的微液滴來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解。如圖2a所示，在室溫下將10 μmol/L肌紅蛋白和5 μg/mL胰蛋白酶的5 mmol/L NH4HCO3溶液通過自主搭建的± 3 kV高壓噴霧裝置噴射形成直徑9 μm、體積3 pL左右的液滴，液滴噴霧口和質(zhì)譜口之間的距離約為2 cm，毛細(xì)管周圍使用干燥N2作為鞘氣，質(zhì)譜入口毛細(xì)管溫度始終保持在275 ℃，電壓保持在0 V，實(shí)驗(yàn)在不到1 ms的時(shí)間內(nèi)獲得100%的肌紅蛋白序列覆蓋率。將相同的溶液置于37 ℃反應(yīng)14 h，使用商品化電噴霧電離源產(chǎn)生直徑約為60 μm的大液滴進(jìn)行噴霧和質(zhì)譜分析，得到的肌紅蛋白序列覆蓋度為60%，說(shuō)明液滴尺寸對(duì)反應(yīng)效率有顯著的影響。他們還研究了微滴質(zhì)譜法中蛋白質(zhì)酶解適宜的pH范圍。當(dāng)pH小于4時(shí)，微滴質(zhì)譜法促進(jìn)酶解的程度會(huì)受到抑制，測(cè)得蛋白質(zhì)序列覆蓋度約為40%；當(dāng)pH高至11時(shí)，微滴質(zhì)譜法仍可完全消化合成肽。該方法被用于治療性抗體曲妥珠單抗(約148 kDa)的序列分析，得到輕鏈100%、重鏈85%的序列覆蓋率，證明了其在藥物開發(fā)中的應(yīng)用潛力。

4改變酶試劑形態(tài)的快速酶解策略

生物酶催化效率高、專一性強(qiáng),通常在常溫、常壓等生物適宜的條件下發(fā)揮催化作用[57]。然而，當(dāng)離開細(xì)胞及其特定環(huán)境,酶分子難以長(zhǎng)時(shí)間保持活性或進(jìn)行重復(fù)利用。固定化酶是指通過某種方法將酶固定于固體載體上或限制于一定區(qū)域內(nèi)，在保證其催化能力的基礎(chǔ)上提高酶試劑的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率[58,59]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、能源、環(huán)境等領(lǐng)域。固定化酶提供了一個(gè)局部高濃的酶環(huán)境，能夠有效加速蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。常見的固定化酶載體有玻璃、膜、聚合物、磁珠、凝膠、多孔硅膠、多孔整體式材料等，固定方法也多種多樣，如吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法等[60 - 62]。

Kosuke等[63]通過使用毛細(xì)管內(nèi)固定化酶的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)少量細(xì)胞的在線高效蛋白質(zhì)組樣品前處理(In-Line Sample Preparation For Efficient Cellular Proteomics,ISPEC)。ISPEC分析系統(tǒng)如圖2b，將2 μL HeLa細(xì)胞懸液滴到玻璃板上，將相同體積的裂解液滴在另一塊玻璃板的同一位置上，依次吸取空氣500 nL、裂解液2 μL、空氣500 nL、HeLa細(xì)胞懸液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液，空氣500 nL。使用帶有電荷耦合器件(Charge Coupled Device,CCD)相機(jī)的顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定收集在采樣毛細(xì)管中的細(xì)胞數(shù)量。之后，使用PicoClear聯(lián)結(jié)器將采樣毛細(xì)管連接到填充有固定化胰蛋白酶的反應(yīng)毛細(xì)管和色譜柱，用注射泵以5 μL/min的流速推動(dòng)水溶液進(jìn)入毛細(xì)管，使得毛細(xì)管中收集的細(xì)胞與裂解液混合而裂解，再將流速更改為1 μL/min，推動(dòng)溶液與固定化胰蛋白酶微球接觸使蛋白質(zhì)酶解，最終將酶解所得的肽段捕獲在液相色譜柱的入口端，整個(gè)酶解和進(jìn)樣過程約1 h。將所得的裝有樣品的毛細(xì)管色譜分析柱連接到液相泵上，使用含有5%乙腈和0.1%甲酸的水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行30 min的液相分離。為避免樣品間的交叉污染，每次分析均需更換固定化胰蛋白酶柱和色譜分析柱。使用經(jīng)過優(yōu)化的ISPEC方法和nano-LC-MS分析方法，他們分別從100個(gè)、10個(gè)和單個(gè)HeLa細(xì)胞中鑒定到了1351、351和60種蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)針對(duì)少量哺乳動(dòng)物細(xì)胞樣品展開方法設(shè)計(jì)和優(yōu)化，降低了樣品制備過程中的損失，提高了固定化胰蛋白酶消化的穩(wěn)定性和效率。

圖2 縮小反應(yīng)體系體積和使用固定化酶的蛋白質(zhì)快速酶解系統(tǒng)[56,63 - 65]Fig.2 Rapid enzymatic proteolysis systems based on reducing reaction system volume and using immobilized enzyme reactors[56,63 - 65]

Shen等[64]比較了采用固定化胰蛋白酶(Immobilized Trypsin,IM)和游離胰蛋白酶(Free Trypsin,FT)兩種方法的酶解結(jié)果，同時(shí)系統(tǒng)地分析了IM相對(duì)于FT的作用區(qū)別以及IM固定基質(zhì)的引入對(duì)蛋白質(zhì)裂解機(jī)理或選擇性的影響。如圖2c所示，分別使用了胺基官能化(IM-N)或羧基官能化(IM-C)的固定化酶磁珠以及FT來(lái)消化大腸桿菌蛋白質(zhì)組樣品。與FT相比，IM在其消化蛋白的過程中沒有特殊的選擇性，對(duì)于位置不同、功能不同、豐度不同的蛋白都可以較好地進(jìn)行鑒定。IM-N方法(用時(shí)15 min)和FT方法(用時(shí)12 h)都可以從小鼠腦蛋白質(zhì)組中鑒定出9000種蛋白質(zhì)。該工作建立了使用固定化酶進(jìn)行消化的高通量自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程：蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理(包括蛋白質(zhì)變性，還原和烷基化)用時(shí)40 min，IM-N消化用時(shí)15 min，肽段脫鹽和凍干用時(shí)1 h，毛細(xì)管區(qū)帶電泳質(zhì)譜(Capillary Zone Electrophoresis,CZE-MS/MS)分析時(shí)間為30 min，數(shù)據(jù)分析用時(shí)30 min，整個(gè)分析流程總時(shí)長(zhǎng)約3 h，從小鼠腦蛋白質(zhì)組中識(shí)別出1000多種蛋白質(zhì)和6000多種肽，具有良好的定性和定量重現(xiàn)性。

Atacan等[65]使用熱溶劑法制備了Fe3O4磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)，并開發(fā)了一種新方法將胰蛋白酶共價(jià)固定在單寧修飾的MNP上，表征了所得納米粒子的形貌、結(jié)構(gòu)和磁性。Fe3O4納米粒子具有優(yōu)良的藥物相容性和超順磁性，非常適用于固定化酶的研究，但裸露的Fe3O4納米粒子通常穩(wěn)定性和分散性較差，因此需要開發(fā)表面修飾方法來(lái)獲得穩(wěn)定且更具生物相容性的Fe3O4納米粒子。單寧酸是一種天然的多酚分子，廣泛存在于多種植物中，葡萄糖作為中心核通過酯鍵與十個(gè)沒食子酸基團(tuán)相連，其大量羥基結(jié)構(gòu)易與生物聚合物相互作用，故可用作固定化酶結(jié)構(gòu)的結(jié)合涂層。實(shí)驗(yàn)利用多酚的pH依賴性氧化反應(yīng)，通過升高pH在單寧修飾納米顆粒上生成醌基，利用席夫堿反應(yīng)或Michael加成反應(yīng)將胰蛋白酶共價(jià)固定在單寧修飾的Fe3O4MNPs上(圖2d)。室溫下，F(xiàn)e3O4MNPs的飽和磁化值為60.18 emu/g，而單寧修飾的Fe3O4MNPs和固定有胰酶的單寧修飾Fe3O4MNPs的飽和磁化值分別為57.82 emu/g和55.16 emu/g，這表明單寧涂層和胰蛋白酶固定良好。他們使用BSA作為樣品來(lái)表征固定化酶效果，分別在1 min、5 min和15 min內(nèi)進(jìn)行了BSA的酶解，并且在微波輔助下將酶解過程縮短到15 s，使用MALDI-TOF MS鑒定到39個(gè)特征肽段，在1 min的消化時(shí)間下獲得了84%的蛋白質(zhì)序列覆蓋率。

2020年，Wei等[66]基于玻璃芯片研制了一種集成了固定化酶反應(yīng)器(IMER)的一體化蛋白質(zhì)預(yù)處理微流控系統(tǒng)。玻璃芯片由三個(gè)入口通道和兩組蛇形通道組成，可使蛋白質(zhì)溶液、還原劑和烷基化試劑同時(shí)注入芯片通道，保證反應(yīng)液在線高效混合和充分反應(yīng)。IMER通過硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備，經(jīng)檢測(cè)2個(gè)月內(nèi)IMER酶活性降低13.8%，體現(xiàn)了IMER系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)利用的能力。在此基礎(chǔ)上，該研究組[67]于2021年發(fā)展了通過微流控芯片集成反相色譜、IMER和分子印跡整體柱的樣品處理系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)在線蛋白質(zhì)分離、變性、消化和多肽富集。該微流控系統(tǒng)完整處理一組樣品的時(shí)間(約9.6 h)短于傳統(tǒng)方法(約13.3 h)。2022年，該研究組[68]報(bào)道了基于微流控系統(tǒng)的分子印跡聚合物(MIP)和IMER相結(jié)合的富集策略，提高了質(zhì)譜鑒定N-肉豆蔻?；牡乃?，從MCF-7細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)混合物中鑒定出1 296個(gè)蛋白質(zhì)和5 670個(gè)肽段，包括71個(gè)肉豆蔻?；鞍缀?8個(gè)肉豆蔻?；?。

5 總結(jié)與展望

隨著人們?cè)谏镝t(yī)學(xué)領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)和研究不斷深入，少量細(xì)胞乃至單個(gè)細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)組學(xué)研究引起了廣泛關(guān)注[69 - 71]。基于鳥槍法的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)前處理流程較為復(fù)雜且耗時(shí)，如何顯著提升蛋白質(zhì)酶解速率是一大挑戰(zhàn)。紅外光輔助酶解策略通常用于離心管內(nèi)數(shù)十微升體積的樣品，蛋白質(zhì)底物濃度較高，可將蛋白質(zhì)酶解時(shí)間縮短至30 s～5 min。紅外激光輔助的酶解系統(tǒng)裝置簡(jiǎn)單，操作方便，易于集成，但它要求反應(yīng)器為敞開式或者基于紅外透過特性，方便光線照射到樣品溶液。紅外激光器的性質(zhì)決定了它更適合于流動(dòng)式的反應(yīng)體系，對(duì)于大規(guī)模批式樣品，紅外激光器產(chǎn)生的激光難以同時(shí)均勻作用于每個(gè)反應(yīng)單元，因此需要組裝運(yùn)動(dòng)元件控制其在不同反應(yīng)單元上方移動(dòng)和定位，或采用多個(gè)紅外激光器構(gòu)建反應(yīng)器陣列。已報(bào)道的微波輔助酶解策略同樣用于離心管內(nèi)數(shù)十微升體積的樣品，可將蛋白質(zhì)酶解時(shí)間縮短至30 s～10 min。使用微波爐產(chǎn)生微波的方法非常適用于批量樣品同時(shí)反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單高效，但是微波爐本身難以集成到自動(dòng)化微量樣品前處理模塊中。另外，高功率的紅外激光和微波在操作中都具有一定的危險(xiǎn)性。超聲輔助酶解策略適用于數(shù)十微升樣品，反應(yīng)時(shí)間通常在1～20 min，操作簡(jiǎn)單，但超聲波引起的振動(dòng)對(duì)液體造成的擾動(dòng)較大，不適用于微液滴原位反應(yīng)體系。另一種基于微尺度效應(yīng)的快速酶解策略利用電噴霧產(chǎn)生的皮升級(jí)微液滴將酶解反應(yīng)加速到毫秒級(jí)，產(chǎn)物直接噴入質(zhì)譜，裝置簡(jiǎn)單，反應(yīng)效率極高，但是僅適用于底物較為純凈單一的反應(yīng)，目前尚難以推廣到樣品組成復(fù)雜、前處理操作繁瑣、需要經(jīng)液相色譜分離的蛋白質(zhì)組分析體系中?；诠潭ɑ阜磻?yīng)器的快速酶解策略是微體系反應(yīng)中最常用的快速酶解策略，樣品體積通常在百納升至百微升，酶解反應(yīng)時(shí)間在2 s～2 h，它的作用效果穩(wěn)定，能一定程度上減少酶自切反應(yīng)的發(fā)生，可靈活放置于各類微反應(yīng)器中，尤其適合流動(dòng)反應(yīng)體系。然而，固定化酶制備步驟相對(duì)繁瑣，對(duì)酶試劑的消耗較大，易向體系引入吸附殘留、交叉污染等問題。

促進(jìn)蛋白質(zhì)快速酶解的目的是加快蛋白組學(xué)樣品前處理的反應(yīng)進(jìn)程，以實(shí)現(xiàn)更大規(guī)模、更高通量的蛋白組學(xué)分析研究。在未來(lái)的研究中，如何對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)快速酶解策略進(jìn)行選擇和組合，實(shí)現(xiàn)集成化、自動(dòng)化的蛋白組學(xué)快速樣品前處理，是蛋白組學(xué)分析系統(tǒng)實(shí)用化進(jìn)程中應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注的問題。此外，隨著研究者們對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)不斷加深，以及相關(guān)分析技術(shù)和儀器的不斷發(fā)展，針對(duì)少量細(xì)胞乃至單個(gè)細(xì)胞的蛋白組學(xué)研究已成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。目前文獻(xiàn)報(bào)道的快速酶解策略多以常規(guī)量的某一種或數(shù)種蛋白質(zhì)作為底物，以蛋白質(zhì)序列覆蓋度作為表征酶解效果的主要依據(jù)，這種方法的局限性是無(wú)法定量地反映體系中的所有蛋白質(zhì)是否都被充分地酶解。當(dāng)樣品中的蛋白質(zhì)含量極低時(shí)，可能存在蛋白質(zhì)酶解不充分、響應(yīng)低于檢出限以至于影響蛋白質(zhì)鑒定的問題。因此，對(duì)于少量和單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析水平的微量樣品而言，在常規(guī)蛋白組學(xué)分析中所采用的加速酶解方案是否依然適用，仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)和驗(yàn)證。