木尼熱·阿布都克力木， 周麗楠， 郭遠(yuǎn)強， 木合塔爾·吐爾洪*

(1.喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆喀什 844006)(2.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300350)

多糖是由10個以上單糖分子通過糖苷鍵聚合而成的一類生物大分子。作為蛋白質(zhì)和核酸之外的第3類生物大分子，多糖廣泛存在于動植物等生物有機體中，既是能量的來源和物質(zhì)循環(huán)的中心，也是維持細(xì)胞形態(tài)和構(gòu)架的重要骨架和支撐單元[1]。20世紀(jì)60年代起，人們進(jìn)一步認(rèn)識到，多糖直接參與細(xì)胞的分化、增殖等幾乎所有生命活動，有廣泛的生物活性[2]，如抗腫瘤[3]、抗病毒[4]等。因其具有廣泛的活性、低毒、較好的生物相容性等特點，多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[2,5]。

毛茛科(Ranunculaceae)翠雀屬(DelphiniumL.)植物，均為草本植物，分布于北溫帶地區(qū)。我國約有114種，除臺灣和廣東海南以外在其他各省區(qū)均有分布，新疆地區(qū)約有30種[6]。該屬部分植物是傳統(tǒng)中藥的來源，具有多種功效[7]?；瘜W(xué)研究顯示該屬植物中含有豐富的生物堿，此外，還從該屬植物中分離鑒定出一些三萜、黃酮、水溶性多糖類成分，這些成分大都具有顯著的生理活性[8]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對該屬植物化學(xué)成分研究，多集中于生物堿類成分的分離鑒定，有關(guān)水溶性多糖成分的研究鮮有報道。帕米爾翠雀花(DelphiniumlacosteiDanguy)，是高原植物，主要產(chǎn)于帕米爾高原、塔什庫爾干，生長在海拔4300米以上的山坡。已有學(xué)者對翠雀屬植物的化學(xué)成分進(jìn)行研究報道，但有關(guān)帕米爾翠雀花的研究尚未見報道。鑒于翠雀屬植物的藥用價值，為探索帕米爾翠雀花的藥用潛力，本文對帕米爾翠雀花含有的多糖類成分及活性進(jìn)行研究。經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)對照品分析，其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5種單糖組成；在體病毒活性測試顯示DL90具有顯著的抗煙草花葉病毒(TMV)活性。該研究可為新疆高原植物帕米爾翠雀花的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

UV-755B型紫外-可見分光光度計，上海佑科儀器有限公司；Bruker Tensor 37型傅立葉變換紅外光譜儀，Bruker公司；1260分析型高效液相色譜儀，附UV3000紫外檢測器(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；Sorvall LYNX 6000型高速落地離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-2型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)，購于國藥化學(xué)試劑有限公司；單糖對照品甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)購于成都德斯特公司；三氟乙酸(TFA)購于阿拉丁試劑公司。正丁醇等化學(xué)試劑(分析純)，購于天津渤化化學(xué)試劑有限公司。

帕米爾翠雀花(DelphiniumlacosteiDanguy)，2020年9月采自新疆喀什地區(qū)，塔什庫爾干縣，經(jīng)喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院艾沙江博士鑒定，標(biāo)本(No.20200903)存放于喀什大學(xué)特色藥食用植物化學(xué)自治區(qū)重點實驗室。

1.2 帕米爾翠雀花多糖的提取及樣品DL90的制備

采用熱水提取與乙醇沉淀相結(jié)合的方法[9]。1 kg帕米爾翠雀花干燥藥材，冷水浸泡過夜，藥材與水的比例為1∶10(w/v)。浸泡結(jié)束后，80 ℃下提取3次，每次提取時間為3 h。合并提取液，濃縮，離心，得上清液。將無水乙醇加入上清液，直至溶液中乙醇的含量為90%，低溫過夜后，5 000 r/min離心15 min，得沉淀即為醇沉提取物。

對沉淀中含有的蛋白質(zhì)，采用Sevage法除去[10]。除蛋白試劑為正丁醇和二氯甲烷的混合溶液(1∶4)。將獲得的沉淀溶解在水中，置入分液漏斗中，除蛋白試劑與沉淀溶解液按1∶4的比例混合，搖勻，靜置，直至出現(xiàn)明顯的分界線，下層變性蛋白棄去，留上層液體，重復(fù)3次。濃縮，除去正丁醇及二氯甲烷。用水透析48 h后，再次濃縮，凍干，即為帕米爾翠雀花多糖樣品，記為DL90。

1.3 DL90的單糖組成分析

確定單糖組成，通常采用PMP柱前衍生化法[11]。各對照單糖的混合溶液的衍生化：各稱取一定量9種對照標(biāo)準(zhǔn)品單糖，配制為2 mmol/L的溶液。取各標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，依次加入500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，500 μL 0.5 mol/L PMP溶液，70 ℃反應(yīng)30 min后，冷卻至25 ℃，加入0.3 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH=7，用等體積的氯仿萃取，取氯仿萃取后的水層，以0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC分析。

DL90的衍生化：準(zhǔn)確稱取5 mg帕米爾翠雀花多糖樣品DL90，加入TFA，120 ℃水解 6 h，將水解后的水解液與甲醇共濃縮，除去TFA，然后向旋干的水解液樣品中加入1 mL超純水使其溶解，進(jìn)行PMP衍生化，具體的操作步驟參考前面的方法，樣品衍生化后，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：kromasil 100-5-C18色譜柱(250 mm×4.5 mm，5 μm)； 0.1 mol/mL磷酸鹽緩沖液-乙腈(體積比83∶17)(pH=6.9)，流速0.8 mL/min；設(shè)定檢測波長250 nm；進(jìn)樣20 μL分析。

1.4 DL90抗煙草花葉病毒(TMV)活性研究

1.4.1 對感染TMV的保護(hù)活性取心葉煙幼株(8～10片葉)，去除頂端，留底部小葉4～5片。將DL90水溶液涂于左半葉上，空白對照涂于右半葉。在光照充足的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將TMV接種于整片煙葉上，30 min后，用清水洗滌葉片。培養(yǎng)3～4天后，記錄產(chǎn)生枯斑的數(shù)目[12]。

1.4.2 對感染TMV的治療作用取心葉煙幼株(8～10片葉)，去除頂端，留底部小葉4～5片。采用摩擦法，將TMV接種在整片煙葉上，30 min后，用清水洗滌葉片。待葉片晾干后，用毛筆在左半葉輕輕涂上DL90水溶液，右半葉涂上對應(yīng)空白溶劑。在光照充足的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4天，記錄產(chǎn)生枯斑的數(shù)量[13]。

1.4.3 對TMV的鈍化效果取心葉煙幼株(8～10片葉)，除頂端，留底部小葉4～5片。取一定體積的DL90樣品水溶液與等體積的含TMV溶液混合，鈍化30 min。采用摩擦法，將含有多糖DL90樣品的TMV接種在左半葉上，取一定體積的空白溶劑與TMV汁液等體積混合，采用同樣的方法將TMV接種到煙葉右半葉上，30 min后，用清水沖洗，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4天后，記錄產(chǎn)生枯斑的數(shù)目[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DL90中蛋白與核酸分析

取0.1 mg/mL多糖樣品DL90水溶液，在波長200～400 nm范圍內(nèi)測量樣品的紫外光譜。如圖1所示，根據(jù)其在260 nm(核酸的紫外吸收)、280 nm(蛋白的紫外吸收)處的吸收，判斷帕米爾翠雀花多糖樣品DL90含有蛋白與核酸[15]。

圖1 DL90的紫外光譜Fig.1 UV spectrum of DL90

2.2 DL90的紅外光譜分析

取2 mg干燥的帕米爾翠雀花多糖樣品DL90與KBr混合，壓片，測DL90的紅外光譜(4 000～400 cm-1)[16]。如圖2所示，在3360、2935、1627、1423、1053 cm-1有明顯的吸收峰，符合多糖的紅外吸收特征，DL90具有多糖的相應(yīng)吸收峰，表明制備獲得的樣品DL90主要含有多糖。

圖2 DL90的紅外光譜Fig.2 FT-IR spectrum of DL90

圖3 對照品和帕米爾翠雀花多糖樣品DL90單糖組成色譜圖Fig.3 Chromatograms of monosaccharide reference substances and monosaccharide composition of DL90 prepared from D.lacostei1：Man；2：Rha；3：GlcA；4：GalA；5：Glc；6：Gal；7：Xyl；8：Ara；9：Fuc.

2.3 DL90的糖含量及蛋白含量測定

采用苯酚-硫酸顯色方法測定DL90中的糖含量[17]。準(zhǔn)確稱取葡萄糖50 mg，去離子水溶解，100 mL容量瓶定容，分別取40、100、160、200、400、600 μL于EP管中，加去離子水至1 mL，混勻，取400 μL置于試管中，加苯酚200 μL、濃硫酸1 mL，混勻后，測定每組的吸光度值(490 nm)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取5 mg 帕米爾翠雀花多糖樣品DL90，定容于100 mL容量瓶，加入苯酚及濃硫酸，490 nm波長下測樣品的吸光度值，計算帕米爾翠雀花多糖DL90中糖(碳水化合物)含量。

DL90中的蛋白質(zhì)含量，根據(jù)文獻(xiàn)報道的考馬斯亮藍(lán)法測定[18]。稱取牛血清白蛋白10 mg，溶解并定容于10 mL容量瓶中，分別取10、20、30、40、50、60、80和100 μL于干凈試管中，分別加水至1 mL，混勻，向各試管中加入現(xiàn)配的考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL，混勻后，測每組樣品的吸光度值(595 nm)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取50 mg DL90凍干粉末，溶解并定容于10 mL容量瓶，加入考馬斯亮藍(lán)溶液后，測定波長595 nm吸光度，計算帕米爾翠雀花多糖樣品DL90中的蛋白含量。

測定結(jié)果顯示，DL90中糖含量和蛋白質(zhì)含量分別為59.5%和4.6%，多糖是DL90的主要成分，與DL90的紫外光譜分析結(jié)果一致。

2.4 DL90的單糖組成與比例

經(jīng)柱前衍生化，HPLC分析，如圖3所示，帕米爾翠雀花多糖樣品DL90含有5種單糖：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，這5種單糖的比例為1.35∶1.26∶1.61∶2.89∶1.00，未檢出酸性糖，表明制備獲得的帕米爾翠雀花多糖樣品DL90是中性雜多糖。

2.5 DL90抗TMV活性

DL90抗TMV活性，利用半葉枯斑法進(jìn)行測定。利巴韋林及寧南霉素作為對照，測試結(jié)果如圖4所示。當(dāng)濃度為500 mg/mL時，帕米爾翠雀花多糖樣品DL90對感染TMV的保護(hù)作用、治療作用和鈍化效果分別為38.2%、36.9%和40.4%，均比對照藥劑寧南霉素低，但與對照藥劑利巴韋林接近。當(dāng)濃度降為100 mg/mL時，抗TMV活性也隨之降低。活性測試顯示，帕米爾翠雀花多糖樣品DL90具有一定的抗煙草花葉病毒活性，DL90由5種單糖構(gòu)成，其中半乳糖比例最高，推測其活性可能與其由多種單糖組成有關(guān)；此外，多糖的特性，如生物相容性、與細(xì)胞表面受體結(jié)合等，阻止病毒的黏附和復(fù)制過程，發(fā)揮抗病毒活性，具體的抗病毒活性與機制有待于進(jìn)一步研究。

圖4 DL90的抗煙草花葉病毒活性A:對感染TMV的保護(hù)作用；B:治療作用；C:鈍化作用Fig.4 The anti-TMV activities of DL90A:Protective effects on TMV infection;B:Therapeutic effects;C:Passivation effects.

3 結(jié)論

本文采用熱水提取、乙醇沉淀等步驟，制備得到帕米爾翠雀花多糖樣品DL90。DL90主要含有多糖，紅外光譜呈現(xiàn)明顯的多糖特征吸收峰，糖含量為59.5%。單糖組成分析表明，DL90由5種單糖組成，半乳糖含量最高。半葉枯斑實驗測證實，DL90對感染TMV的保護(hù)效果、治療效果和鈍化效果與對照藥劑利巴韋林接近。該研究為帕米爾翠雀花多糖的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了參考。