李 偉

（河南省鄲城縣農業(yè)農村局，河南 鄲城 477150）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染引起的豬的一種急性、出血性傳染，導致很高的發(fā)病率和致死率，是世界動物衛(wèi)生組織（WHO）法定報告的動物疫病。ASFV基因組是雙鏈DNA病毒，基因組約為170～190 kbp，編碼150～200 種蛋白質[1]。1921年在肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)ASF疫情，迄今已有100年的流行歷史，遍及歐洲、美洲和亞洲，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失[2]。然而，由于ASFV復雜的免疫保護和免疫逃避機制，迄今為止還沒有安全、有效的疫苗問世。隨著分子生物學技術和免疫學技術的發(fā)展，ASF疫苗的研究取得重要進展，先后有滅活疫苗、重組亞單位疫苗、弱毒疫苗等不同技術路線研制的疫苗，均獲得一定的免疫保護。本文基于弱毒疫苗顯示的很強免疫保護能力的特點，對近年來ASF弱毒疫苗的研究進展進行綜述，以期為ASF的研發(fā)提供參考。

1 ASFV自然分離株弱毒疫苗

科研人員從軟蜱和慢性感染ASFV的豬中分離到一些自然弱毒的ASFV毒株，例如OUR T88/3 和NH/P68[3-4]，這兩株自然分離弱毒ASFV毒株對同源毒株的免疫保護率在66%～100%不等，其保護率與攻毒毒株的特性、免疫劑量和免疫途徑等不同因素有關。從完全保護的免疫數據分析，發(fā)現(xiàn)免疫后抗體水平和細胞毒性CD8+T 細胞在免疫保護中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，自然分離弱毒株NH/P68（基因型I）能夠100%保護強毒株L60（基因型I）的攻擊，而且還能夠抵抗Arm/07（基因型Ⅱ）的異源毒株的攻擊，但是該毒株免疫后的缺點是能夠引起一定的副反應。使用弱毒株OUR T88/3 疫苗進行初始免疫，再用OUR T88/1 毒株加強免疫,對Benin 97/1和Uganda 1965強毒株攻擊豬的免疫保護率分別為85.7%～100%，首次證明該疫苗具有交叉保護作用，可以抵抗非同源ASFV 毒株的攻擊[5]。但是，自然分離的弱毒株疫苗免疫后引起許多不良反應，例如，在用NH/P68 毒株免疫后，約25%～47% 的豬出現(xiàn)慢性感染的癥狀，接種OUR T88/3 的豬出現(xiàn)發(fā)燒和關節(jié)腫脹等癥狀[6]。Gallardo 等人[7]報道了一種（non-HAD）ASFV 基因型Ⅱ毒株，該毒株系2017 年拉脫維亞野豬中分離的病毒，命名為Lv/17/WB/Rie1。該毒株的基因組序列的特征在于EP402R基因存在單核苷酸缺失，導致該蛋白功能喪失。實驗感染豬臨床癥狀不明顯，有的甚至無癥狀，表現(xiàn)為間歇性病毒血癥和高抗體反應。兩個月后，當這些動物暴露于感染了強毒株基因型ⅡASFV的其他動物時，這些動物沒有受到病毒的感染而獲得完全保護。雖然實驗動物數量不多，但上述結果表明，Lv17/WB/Rie1毒株的疫苗具有成為減毒活疫苗的潛力。

2 ASFV傳代弱毒疫苗

ASFV通過敏感細胞傳代培養(yǎng)可以降低病毒致病性，常用細胞有豬肺泡巨噬細胞、Vero細胞和COS-1細胞系。在1960年，Manso等通過使用豬骨髓細胞對ASFV進行傳代致弱，發(fā)現(xiàn)豬在接種減毒株后能夠抵抗強毒株的攻擊。但是之后，在西班牙和葡萄牙，使用減毒株進行的田間試驗造成了災難性的后果，免疫動物出現(xiàn)肺炎、流產和死亡等嚴重的副反應。Tabar’es等[8]比較了ASFV在豬白細胞傳代（毒株E70 L6）和在Vero細胞傳代（毒株E70MS14）后病毒基因組酶切圖譜變化情況，結果顯示，在適應Vero細胞生長之前，ASFV毒株E70 L6的DNA大小為l73 kb，傳代適應后DNA僅為156 kb，缺失了17 kb。Krug等人將ASFV-G 毒株在Vero 細胞中進行傳代培養(yǎng)，傳到第110代時毒力完全喪失，病毒的復制能力增強，但是，豬接種該疫苗后未獲得相應的免疫保護[9]。通過毒株序列測定，表明該毒株基因組末端出現(xiàn)了大片段的基因缺失和突變，這種突變可能是其適應Vero細胞的原因，但它改變了ASFV-G/V的抗原性，未能誘導保護性免疫反應。

3 ASFV重組弱毒疫苗

隨著分子生物學技術發(fā)展，使用同源重組方法，可以定點敲除病毒毒力基因或免疫抑制性或免疫逃逸相關基因以降低病毒的毒力，可在短時間內獲得致弱毒株，該方法快速簡便，其難點在于重組病毒的純化，使其不含親本病毒。目前，發(fā)現(xiàn)與ASFV毒力相關的基因主要包括：TK、UK、9 GL和CD2v，與免疫逃逸相關基因主要有MGF和A238L，與免疫抑制相關基因有A276R。Abrams等[10]從OUR T88/3 弱毒株中成功敲除了DP71L 和DP96R 基因獲得重組病毒OURT88/3ΔDP2，用缺失病毒OUR T88/3ΔDP2 和親本病毒OUR T88/3 對6 頭豬進行免疫接種，并用強毒OUR T88/1 病毒進行攻擊，結果基因缺失毒株免疫組OUR T88/3ΔDP2獲得了66%的保護，而親本病毒OUR T88/3提供了100%的保護。該研究結果表明，弱毒株OUR T88/3中敲除DP71L和DP96R兩個基因后，免疫豬后用強毒株攻擊時，其保護作用減弱，提示這兩個基于與免疫保護相關。Gallardo等[11]將PAM細胞傳代的NH/P68免疫豬能抵抗Arm07毒株的攻擊，但構建的基因缺失株NH/P68△A276R不能抵抗Arm07毒株的攻擊。這也證實了A276R在ASFV的免疫保護中發(fā)揮著重要作用。O’Donnell等[12]從高加索地區(qū)和東歐流行的毒株中分離到一株強毒株Georgia 2007/1（ASFV-G），通過同源重組技術在原代豬肺巨噬細胞中構建了缺失9GL的重組病毒（ASFV-GΔ9GL），用104個HAD50的劑量肌肉注射，可誘導豬產生與親本毒株ASFV-G一樣的臨床癥狀，用較低劑量（102～103HAD50）的ASFV-G-Δ9GL 感染豬不能誘導產生臨床癥狀，當豬在感染后21或28天攻毒時，102HAD50的劑量組獲得部分保護，但103HAD50的劑量組在21天和28天攻毒均能獲得完全保護。該研究盡管通過同源重組技術獲得了致弱毒株，但是該弱毒株的免疫劑量和感染劑量不好控制，很難在臨床上使用。因此，在之前的基礎上，該研究團隊又構建了另一個基因UK（DP96R）缺失的毒株（ASFV-G-Δ9GL/ΔUK）[13]，以進一步致弱毒株，用該毒株高劑量（106HAD5）0肌肉注射豬不會引起發(fā)病，當接種104HAD50的劑量時可以保護豬免受強毒株ASFV-G的攻擊。Reis 等[14]通過敲除DP148R基因構建重組病毒BeninΔDP148R，該病毒在豬體內的毒力低于親本病毒，接種豬僅在免疫后顯示短暫的輕微臨床癥狀，用親本病毒攻擊后，所有通過肌內途徑免疫的豬都存活下來，通過鼻內途徑免疫的豬，除一只外，所有豬都存活下來。O’Donnell等[15]敲除Georgia 2007/1分離株（ASFV-G）的MGF505、MGF360-1R、MGF360-12L、MGF360 -13L、MGF360 -14L、MGF505 -2R 和MGF505-3R 6個基因，構建重組病毒ASFV-GΔMGF。在原代豬肺巨噬細胞中，ASFV-G-ΔMGF 的復制效率與親代病毒一樣高。豬肌肉注射后，ASFVG-ΔMGF在體內的復制效率完全減弱。用該弱毒疫苗免疫后，豬能抵抗親本毒株的攻擊。為了解決疫苗的安全問題，他們又構建了一個新的毒株ASFV-GΔ9G/ΔMGF[16]，與ASFV-G和ASFV-G-ΔMGF相比，ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF在原代豬肺巨噬細胞中的復制能力降低，當肌內接種豬時，ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF即使在106HAD50的高劑量下無致病性。用102～106HAD50劑量感染動物，在感染后的任何時間血液中均未檢測到病毒水平，也未檢測到抗ASFV的抗體，不能抵抗強毒親本ASFV-G毒株的攻擊。Reis等[17]從ASFV Benin97/1分離株缺失了（MGF360-10L，11L，12L，13L，14L）和MGF530/505（MGF530/505-1R，2R and 3R）和中斷基因（MGF360-9L and MGF530/505-4R），命名為BeninΔMGF。BeninΔMGF毒株在豬肺巨噬細胞中的復制與親本病毒Benin 97/1和天然弱毒分離株OURT88/3沒有太大區(qū)別。用BeninΔMGF對豬進行兩次免疫，然后用致死劑量的Benin 97/1進行攻擊，所有豬都獲得保護。他們用不同劑量、不同免疫途徑研究該疫苗的保護效力，結果表明，使用高劑量（104TCID5）0的肌肉注射途徑是最佳的免疫選擇。Monteagudo等人[18]以BA71毒株為骨架構建了缺失CD2v基因的重組病毒（BA71ΔCD2），該毒株在豬體內高度減毒，接種BA71ΔCD2 的豬，不僅可以抵抗親本BA71 的攻擊，而且保護豬免受異源毒株E75（兩種基因型I株）和Georgia 2007/1（ASFV 基因型Ⅱ株）的攻擊。這表明BA71株CD2v基因缺失后，對I型和II型ASFV均能提供完全保護，具有交叉保護作用。國內學者以我國流行的基因II 毒株ASFV HLJ/18為骨架構建了系列基因缺失重組毒株，其中HLJ/18-7GD是缺失7個基因的重組毒株（MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360 -13L、MGF360 -14L、MGF505 -2R、MGF505-3R 和CD2v 聯(lián)合缺失），目前，完成了該疫苗的安全性和免疫效力等試驗[19]，該疫苗能否進入市場還需嚴格的臨床試驗。國內還有研究表明，ASFV-SY18強毒株缺失CD2v 和UK基因后毒力顯著減弱，免疫豬后能夠抵抗親本強毒的攻擊，具有候選疫苗的潛力[20]。通過同源重組技術，還有許多敲除ASFV基因組其他位置基因的重組病毒的報道，但目前為止還沒商品化的疫苗問世。

4 展望

自肯尼亞于1921年首次報告ASF疫情以來已有100年的歷史，科學家對ASF疫苗的研究從未中斷，近幾十年來ASF疫苗的研究取得了長足的進步，尤其是分子生物學技術的發(fā)展，對病毒基礎研究的深入，病毒毒力基因的發(fā)現(xiàn)、參與免疫逃逸基因和具有保護性抗原的基因的挖掘，對將來研究弱毒疫苗、病毒活載體疫苗、亞單位疫苗具有很大的幫助，相信在不久的將來，安全、有效的ASF疫苗會進入市場，為畜牧業(yè)的健康發(fā)展提供服務。