方麗，葉琪明，郭方其，謝昀燁，吳超，武軍，王漢榮*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院a 植物保護(hù)與微生物研究所，b園藝研究所，浙江 杭州 310021)

非洲菊為菊科大丁草屬多年生草本植物，又稱扶郎花、太陽花、燈盞花等，其色澤艷麗，花型優(yōu)美，花色多樣，花期長，不易衰敗，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，是深受大眾歡迎的鮮切、盆栽和庭院觀賞植物[1]。菌核病是非洲菊生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的土傳病害，造成死苗缺株，長勢衰弱，每年導(dǎo)致產(chǎn)量損失率為10%～30%,嚴(yán)重影響花農(nóng)和花企的經(jīng)濟(jì)效益和生產(chǎn)積極性。而種植抗性品種是預(yù)防非洲菊菌核病發(fā)生的最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。然而尚未有關(guān)于非洲菊菌核病的品種抗性的系統(tǒng)研究，包括接種方法、抗性評價等相關(guān)報道。為了促進(jìn)非洲菊抗病性育種的發(fā)展，本文對目前侵染非洲菊的菌核病菌進(jìn)行鑒定，以非洲菊的主栽和新引進(jìn)品種為對象，建立對菌核病的抗性水平和評價方法，并對21個品種進(jìn)行抗性鑒定，為非洲菊的抗菌核性育種研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離純化

供試的非洲菊菌核病菌為浙江省嘉興地區(qū)海寧種植基地的優(yōu)勢菌株，通過組織分離方法[2]，從自然發(fā)病的非洲菊病株中分離純化獲得，致病力強(qiáng)。人工接種后，經(jīng)相同方法分離獲得菌種。

1.2 病原菌的分子鑒定

將菌核病菌移至新的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后，刮取菌絲，用Invitrogen 的HyPure真菌基因組DNA提取試劑盒Genenode提取菌核病菌的基因組DNA。采用16S rDNA基因(ITS5/ITS4 GGAAGTAAAAGTCGTAAGG//TCCTCCGCTTA TTGATATGC)[3]，擴(kuò)增相應(yīng)基因序列。引物合成及測序工作由北京擎科生物科技有限公司杭州分公司完成。利用軟件MEGA7.0將分離到的菌株與已發(fā)表的菌核病菌菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株間的遺傳關(guān)系。

1.3 接種方法

將菌核病菌接種于新的PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃霉菌培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)4 d后，沿菌落邊緣用打孔器打出直徑為5 mm的菌塊。將菌塊置于非洲菊植株的葉柄底部，每株1個菌絲塊，每個品種接種30株左右。用透明塑料膜保濕培養(yǎng)48 h，接種后每天觀察并記錄植株發(fā)病情況。

1.4 供試品種(系)及抗性鑒定方法

2021年春季，供試非洲菊品種包括世紀(jì)紅、水粉和桃紅3個常規(guī)種植品種，以及理想、太陽風(fēng)暴、綠球50、拉絲6號、金桂50、拉絲1號、拉絲8號、拉絲4號、粉佳人、大雪桔、亮粉、美滿、香檳、粉拉絲、福娃、黑杰克、安娜柯萊托和安迪奶油18個新引進(jìn)的品種。非洲菊種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桑園基地大棚內(nèi)的箱式框內(nèi)。選取苗齡為3個月左右成株，用菌絲塊方法(同上)接種菌核病。2021年11月3日接種，前后1個月內(nèi)不使用任何殺菌劑，其他栽培管理如常。設(shè)置清水對照。

1.5 非洲菊菌核病病級分級標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)非洲菊菌核病發(fā)生發(fā)展規(guī)律的調(diào)查分析，參考油菜菌核病和白菜菌核病[4-5]的抗性分級和評價標(biāo)準(zhǔn)，采用植株發(fā)病情況與菌絲菌核形成情況相結(jié)合確定分級標(biāo)準(zhǔn)。0級為全株無?。?級為部分葉片萎焉，≤5%葉片枯死；3級為部分葉片萎焉或有病斑，枯死的葉片占總?cè)~片數(shù)的5%～10%；5 級為10%～25%葉片萎焉或枯死，或枯死葉片或花葶出現(xiàn)白色菌絲或菌絲團(tuán)；7級為25%～50%葉片萎焉或枯死，或枯死葉片或花葶出現(xiàn)白色菌絲或菌絲團(tuán)；9級為50%以上的葉片萎焉或枯死，或心葉萎焉，花葶倒伏，葉片或花葶出現(xiàn)菌絲團(tuán)或菌核。

1.6 非洲菊菌核病病情調(diào)查方法

病情調(diào)查一般在接種后20～25 d，也可根據(jù)對照品種發(fā)病至最高病級時的時間作適當(dāng)調(diào)整。每小區(qū)均調(diào)查全部植株，調(diào)查發(fā)病株數(shù)和發(fā)病病級并記錄。

1.7 菌核病抗感的劃分

根據(jù)上述病情指數(shù)，將其劃分為6個類型。免疫(I)：無病；高抗(HR)：病情指數(shù)為0～10；抗病(R)：病情指數(shù)為>10～30；中抗(MR)：病情指數(shù)為>30～50；感病(S)：病情指數(shù)為>50～70；高感(HS)：病情指數(shù)為>70～100。

2 結(jié)果與分析

2.1 非洲菊菌核病的田間癥狀

菌核病發(fā)病初期表現(xiàn)為老葉枯死增加，長勢衰弱，分蘗減少，隨著病原菌的進(jìn)一步侵入，多個葉片萎焉，葉片出現(xiàn)枯黃色的枯死病斑，甚至新葉或花葶萎焉，全株枯死。在濕度高時可見發(fā)病部位出現(xiàn)大量白色菌絲和菌核。低溫高濕有利于促進(jìn)菌核病的發(fā)生[6]，秋冬季為非洲菊菌核病發(fā)生的主要時期。

2.2 非洲菊的菌核病菌的形態(tài)鑒定

菌核病菌菌株在PDA平板上25 ℃黑暗培養(yǎng)下生長迅速，放射狀生長，平鋪于培養(yǎng)基表面，生長速度為2.3 cm·d-1。菌絲白色，長絮狀，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌落邊緣菌絲集結(jié)成團(tuán)，初為白色，后漸變?yōu)楹谏?，表面粗糙，圓形或不規(guī)則形菌核，直徑2～10 mm(圖1)。

圖1 非洲菊菌核病田間癥狀及病原菌在PDA上的生長情況

2.3 非洲菊的菌核病菌的分子鑒定

本研究擴(kuò)增獲得非洲菊菌核病菌jh-fzj-1的16S rDNA基因序列，得到1條大小約為589 bp的產(chǎn)物，將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知多個序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并以Botrytiscinereastrain strain QS-1(MN589850.1)為外組。結(jié)果(圖2)表明，本研究分離獲得的菌株jh-fzj-1與已發(fā)表的Sclerotiniasclerotiorum株系為同一個分枝，但相似率較低。因此，侵染非洲菊的菌核菌為Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary，這與曹奕鴦[7]的結(jié)果一致。

2.4 非洲菊對菌核病的品種抗病性篩選

對21個非洲菊品種進(jìn)行田間接種鑒定，接種5 d后部分非洲菊葉片可見明顯病斑，隨著時間的推移，病斑持續(xù)擴(kuò)展，接種20 d后調(diào)查病害發(fā)生情況。如表1所示，不同非洲菊品種感染菌核病的病情指數(shù)差異顯著，對菌核病抗性水平也不相同。其中高抗的品種為有3個，占鑒定材料的14.3%；抗病和中抗病品種分別為11和3個，分別占鑒定材料的52.4%和14.3%；感病和高感品種分別為3個和1個，分別占鑒定材料的14.3%和4.8%。其中常規(guī)種植品種基本為抗病，僅水粉為中抗；其中新引進(jìn)的品種中，抗病及高抗病品種占比為62.5%，大大降低了非洲菊種植過程中菌核病的發(fā)病率。

3 討論

菌核病是一種世界性分布的土傳真菌性病害，其中核盤菌引起的菌核病就可危害約75 科278屬408種植物。菌核病作為非洲菊生產(chǎn)栽培過程中發(fā)生最為嚴(yán)重的土傳病害，整個生育期均可發(fā)病，并且條件適宜時發(fā)病迅猛，導(dǎo)致產(chǎn)區(qū)持續(xù)缺苗死苗。目前該病的防控主要以栽培管理、化學(xué)藥劑防治和局部土壤消毒為主要技術(shù)手段，但由于土地資源的限制，輪作困難，菌核病的病害發(fā)生頻繁。應(yīng)用抗病品種是非洲菊菌核病防治中最經(jīng)濟(jì)有效的方法，而當(dāng)前非洲菊的品種選育仍以花型、花色、株高、葉形等栽培指標(biāo)為衡量標(biāo)準(zhǔn)，花卉的抗病性育種研究起步晚，相關(guān)的研究論文少，對非洲菊的抗性等級和評價指標(biāo)研究尚屬空白。本研究對浙江地區(qū)非洲菊菌核病的優(yōu)勢菌種進(jìn)行了鑒定，確定了非洲菊菌核病的菌種為Sclerotiniasclerotiorum(Lib.) de Bary。同時也對市場上普遍種植和最新引進(jìn)的共21個非洲菊品種進(jìn)行了菌核病的抗性篩選，發(fā)現(xiàn)不同非洲菊品種對菌核病的抗性具有顯著差異性。高抗或抗菌核病的非洲菊品種占66.7%以上，中抗及以下的非洲菊品種約占33.3%，常規(guī)種植品種和新引進(jìn)的品種均以抗病品種為主，這為非洲菊菌核病的發(fā)生提供了較好的天然屏障。

圖2 基于ITS 核苷酸序列非洲菊菌核病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 非洲菊品種對菌核病的抗性評價