朱冠宇，朱成喜，李玉葉，陳立興，韓曉新

（1.江蘇理工學(xué)院 電氣信息工程學(xué)院，江蘇 常州 213001；2.江蘇大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

黃曲霉毒素B1（AFB1）是一種常見(jiàn)真菌毒素，主要由黃曲霉和寄生曲霉等霉菌產(chǎn)生，廣泛存在于發(fā)霉的谷物及其制品中[1]。作為最危險(xiǎn)的生物污染物之一，AFB1對(duì)人類(lèi)具有強(qiáng)致癌性，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為1類(lèi)致癌物，已嚴(yán)重威脅到人類(lèi)健康。AFB1在農(nóng)產(chǎn)品和食品中被頻繁檢到，從而引起了全球關(guān)注[2]，因此，發(fā)展簡(jiǎn)便、靈敏、快速的AFB1檢測(cè)技術(shù)對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品和食品質(zhì)量安全至關(guān)重要。目前，AFB1的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[3]、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）[4]、酶 聯(lián) 免 疫 法[5]、熒 光分析法[6]等。例如，Andrade等人[7]利用低溫液-液微萃取技術(shù)構(gòu)建的HPLC和熒光光譜相結(jié)合的傳感平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中AFB1低至5 pg/mL的靈敏檢測(cè)。利用上述分析技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素靈敏、可靠的檢測(cè)，但是需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，且儀器昂貴、分析成本高，因此難以在基層實(shí)驗(yàn)室或快速檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)推廣使用[8]。

電化學(xué)傳感技術(shù)是一種利用待測(cè)物電化學(xué)性質(zhì)，通過(guò)建立電信號(hào)與被測(cè)物濃度之間的線性關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)的方法。與前述方法相比，電化學(xué)方法具有儀器簡(jiǎn)單、響應(yīng)快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為構(gòu)建新型真菌毒素檢測(cè)方法提供了良好的基礎(chǔ)[9-10]。傳統(tǒng)的電化學(xué)傳感器主要利用待測(cè)物在修飾材料的電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)的特性，根據(jù)產(chǎn)生的電流大小檢測(cè)目標(biāo)物濃度，體系的選擇性較差[11]。為了提高電化學(xué)傳感器的靈敏度和選擇性，研究人員對(duì)適配體開(kāi)展了深入的研究。適配體是一種人工合成的單鏈DNA或RNA，對(duì)靶標(biāo)具有高特異性親和力。適配體的結(jié)構(gòu)多樣，可形成發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聯(lián)體等復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)，與目標(biāo)分子發(fā)生類(lèi)似抗原-抗體反應(yīng)的構(gòu)象識(shí)別[12]。相較于抗體，除了親和力高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)外，適配體還具有靶標(biāo)范圍廣、篩選周期短、成本低、穩(wěn)定性好、便于修飾等優(yōu)點(diǎn)。利用適配體作為識(shí)別元件的電化學(xué)傳感器，可以獲得更高的檢測(cè)靈敏度和選擇性，在真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力[13]。

在電化學(xué)適配體傳感策略中，為了獲得針對(duì)目標(biāo)物的電響應(yīng)信號(hào)，往往需要加入與DNA（適配體）或納米材料有特殊親和力的電活性小分子作為氧化還原探針，如亞甲基藍(lán)（MB）、二茂鐵（Fc）、硫堇（Thi）等[14-15]。利用電化學(xué)探針標(biāo)記適配體或互補(bǔ)DNA，通過(guò)目標(biāo)誘導(dǎo)電極表面DNA的構(gòu)象變化，改變探針與電極表面的距離（距離調(diào)控策略），或目標(biāo)物加入后產(chǎn)生的位阻變化，導(dǎo)致探針電化學(xué)特征的變化（位阻效應(yīng)策略），實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的電化學(xué)適配體傳感[16]。Yuan等人[17]利用互補(bǔ)DNA與Thi修飾DNA/AuNPs納米復(fù)合物來(lái)放大Thi的電流信號(hào)，構(gòu)建的電化學(xué)適配體傳感器對(duì)miRNA的檢出限低至11 amol/L。上述研究為檢測(cè)AFB1提供了新的、有效的方法和途徑。

本文提出了一種基于二茂鐵標(biāo)記適配體的電化學(xué)適配體傳感器，用于靈敏檢測(cè)玉米中的AFB1。該傳感器通過(guò)在金電極上順序組裝巰基化互補(bǔ)DNA（cDNA）、巰基己醇（MCH）、二茂鐵修飾AFB1適配體（Fc-Apt）形成基于雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的傳感界面。當(dāng)AFB1存在時(shí)，其與適配體的特異性結(jié)合導(dǎo)致Fc-Apt從電極上釋放，使IFc降低，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的靈敏檢測(cè)。該傳感器具有較高的靈敏度和選擇性、良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，可成功應(yīng)用于對(duì)玉米中AFB1的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與藥品

氯化鉀、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀（均為國(guó)藥試劑）；6-巰基己醇（Adamas公司）；羥甲基氨基甲酸（Tris）（Alfa Aesar公司）；黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2（AFB2）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏馬菌素B1（FB1）（均為Aladdin試劑）。本研究所用的試劑均為分析純，所用水均為超純水。適配體和DNA鏈由生工生物公司提供，序列如表1所示。

表1 適配體和DNA鏈的序列

1.2 儀器設(shè)備

所有電化學(xué)測(cè)量，包括循環(huán)伏安（CV）、交流伏安（ACV）、電化學(xué)阻抗譜（EIS），均在CHI660E電化學(xué)工作站（上海辰華）進(jìn)行。

1.3 電化學(xué)測(cè)量

所有的電化學(xué)測(cè)量均在室溫下使用三電極體系進(jìn)行。以鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl（飽和KCl）為參比電極，金電極（AuE，直徑3 mm）為工作電極。EIS測(cè)量是在含有5 mmol/L Fe（CN）63-/4-的0.1 mol/L KCl中進(jìn)行，頻率范圍為0.1 Hz～10 kHz，直流電壓為0.25 V。使用ZSimpWin軟件基于Randles等效電路，對(duì)阻抗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。ACV測(cè)量是在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中進(jìn)行，掃描電位為0.2～0.7 V、階躍電位為4 mV、頻率為25 Hz、振幅為25 mV。

1.4 傳感器的構(gòu)建及檢測(cè)機(jī)理

該傳感器的構(gòu)建過(guò)程如圖1所示，步驟如下：首先，將6 μL的cDNA溶液滴加到Au電極上，室溫下放置6 h，使cDNA通過(guò)Au-SH鍵組裝在AuE電極表面；其次，將所得電極在1 mmol/L的MCH中浸泡1 h，以阻斷Au的特異性結(jié)合位點(diǎn)；然后，滴 加6 μL的Fc-Apt溶 液，孵 育1 h，利 用DNA雜交將Fc-Apt組裝于電極表面，用Tris-HCl緩沖液洗滌后，得到AFB1適配體傳感器，記為AuE/cDNA/MCH/Fc-Apt。

圖1 電化學(xué)AFB1適配體傳感器的構(gòu)建和檢測(cè)示意圖

為了檢測(cè)AFB1，將上述傳感器浸泡在AFB1溶液中孵育一定時(shí)間，然后用Tris-HCl緩沖液洗滌后進(jìn)行ACV測(cè)量。ACV測(cè)量過(guò)程如下：以上述洗滌后的電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl（飽和KCl）為參比電極，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，以掃描電位0.2～0.7 V、階躍電位4 mV、頻率25 Hz、振幅25 mV進(jìn)行ACV測(cè)量。傳感器的檢測(cè)機(jī)理如下：目標(biāo)物AFB1加入后，其與適配體的特異性識(shí)別導(dǎo)致Fc標(biāo)記適配體（Fc-Apt）從電極表面剝離，隨著Fc在電極表面吸附量的降低，F(xiàn)c的氧化電流（IFc）降低；通過(guò)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)濃度AFB1溶液的電流信號(hào)IFc，建立AFB1濃度對(duì)應(yīng)IFc的標(biāo)準(zhǔn)線性曲線；將所測(cè)得的IFc代入標(biāo)準(zhǔn)線性曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的電化學(xué)靈敏檢測(cè)。

1.5 實(shí)際樣品處理

玉米樣品采購(gòu)自本地超市（江蘇常州）。樣品的處理過(guò)程如下[18]：首先，玉米經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，加入一定量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫下干燥6 h；其次，將10 mL甲醇-水混合液（體積比6∶4）添加到處理過(guò)的樣品中，震蕩2 h后，以8 000 rpm將混合物離心10 min，上清液使用過(guò)濾器（0.22 μm）過(guò)濾；最后，用Tris-HCl緩沖液將所得溶液稀釋為1、2、5、10 ng/mL四個(gè)樣本，并在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的電化學(xué)表征

使用EIS技術(shù)對(duì)AFB1傳感器的構(gòu)建和目標(biāo)識(shí)別過(guò)程進(jìn)行了研究。EIS結(jié)果用Nyquist圖表示，并使用Randles等效電路進(jìn)行了擬合，見(jiàn)圖2。擬合參數(shù)包括電解質(zhì)溶液電阻（Rs）、常相角元件（Q）、電荷轉(zhuǎn)移電阻（Ret）和擴(kuò)散電阻（Zw）。其中，Ret反映了氧化還原探針在電極界面的電荷轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)，其阻值可以通過(guò)計(jì)算Nyquist圖的半圓直徑來(lái)估算。如圖2所示，Au電極的Ret值（曲線a）為90 Ω，表明其良好的導(dǎo)電性。隨后，cDNA/AuE的Ret值顯著增加到1 924 Ω（曲線b），表明cDNA已成功固定在Au電極上，阻礙了氧化還原探針與電極之間的電子傳遞。使用MCH封閉Au非特異性位點(diǎn)后，Ret增加到2 407 Ω（曲線c）。Fc-Apt加入后，Ret進(jìn)一步增加到2 656 Ω（曲線d），表明Fc-Apt已在電極表面組裝。加入目標(biāo)物AFB1后，電極的Ret降低到2 264 Ω（曲線e），表明目標(biāo)物與適配體之間的特異性識(shí)別導(dǎo)致Fc-Apt從傳感器表面解離。以上EIS結(jié)果表明，該電化學(xué)適配體傳感器已經(jīng)構(gòu) 建成功。

圖2 不同修飾電極的EIS響應(yīng)曲線

為了驗(yàn)證所構(gòu)建傳感器用于AFB1檢測(cè)的可行性，測(cè)量了傳感器對(duì)不同濃度AFB1的ACV響應(yīng)。如 圖3所 示，F(xiàn)c-Apt/MCH/cDNA/AuE電 極在+0.42 V處有明顯Fc氧化峰（曲線a），其峰值電流為2.92 μA。當(dāng)AFB1存在時(shí)，其與適配體的特異性識(shí)別導(dǎo)致Fc-Apt從電極表面解離，IFc降低；AFB1濃度為0.1 ng/mL時(shí)，IFc值為2.6 μA（曲線b）；而當(dāng)AFB1濃度為1.0 ng/mL時(shí)，IFc值降低為2.37 μA（曲線c）。以上結(jié)果證實(shí)了該適配體傳感器用于檢測(cè)AFB1的良好可行性。

圖3 傳感器檢測(cè)AFB1的可行性

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了獲得最優(yōu)的信號(hào)響應(yīng)，對(duì)傳感器制備和AFB1檢測(cè)過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。電極上的Fc組裝量會(huì)嚴(yán)重影響電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度，而Fc的組裝量依賴于Fc標(biāo)記的cDNA的濃度。如圖4（a）所示，隨著AFB1的加入cDNA的濃度不斷增大，ΔIFc先快速增大，在cDNA濃度為2.4 μmol/L時(shí)達(dá)到峰值，然后有所下降。這是由于cDNA濃度的增加會(huì)引起空間位阻和靜電排斥，導(dǎo)致cDNA在電極表面形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力下降。因此，適宜選用2.4 μmol/L的cDNA構(gòu)建適配體傳感器。

AFB1與適配體反應(yīng)的孵育時(shí)間是適配體傳感器的另一個(gè)重要參數(shù)。如圖4（b）所示，隨著孵育時(shí)間的增加ΔIFc的值開(kāi)始快速增加，但40 min后無(wú)明顯變化。說(shuō)明40 min足以進(jìn)行AFB1檢測(cè)時(shí)的特異性識(shí)別。因此，選擇40 min作為檢測(cè)AFB1的最佳孵育時(shí)間。

圖4 構(gòu)建傳感器的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3 傳感器的分析性能

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)該適配體傳感器檢測(cè)AFB1的分析性能進(jìn)行了評(píng)估。如圖5所示，隨著AFB1濃度增大，IFc逐漸降低，表明可以用IFc的值來(lái)表征AFB1的濃度。圖6給出了IFc與AFB1濃度對(duì)數(shù)的線性回歸曲線?？芍?，傳感器對(duì)AFB1的線性響應(yīng)范圍為1.0 pg/mL～1.0 μg/mL，檢出限為0.33 pg/mL，線性回歸方程 為IFc=0.228-0.145 LogCAFB1，相 關(guān) 系 數(shù)（R2）為0.995。

圖5 傳感器對(duì)不同濃度AFB1的ACV響應(yīng)曲線

圖6 傳感器檢測(cè)AFB1的線性回歸曲線

表2列出本文構(gòu)建的傳感方法與已報(bào)道的AFB1檢測(cè)方法的對(duì)比。結(jié)果表明，與HPLC-MS[4]、比色法[19]、熒光[6]、電化學(xué)發(fā)光[20]等檢測(cè)方法相比，本文構(gòu)建的適配體傳感器具有更低的檢出限。與電化學(xué)DPV（基于絲網(wǎng)印刷電極）[22]、電化學(xué)阻抗EIS（基于MWCNTs/RTIL修飾玻碳電極）[23]等方法相比，本文構(gòu)建的適配體傳感器具有相當(dāng)或更低的檢出限，表明該傳感器具有優(yōu)越的分析性能。

表2 本研究構(gòu)建的傳感方法與已報(bào)道的AFB1檢測(cè)方法分析性能對(duì)比

2.4 傳感器的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了評(píng)估該傳感器的選擇性，使用一些常見(jiàn)真菌毒素進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)，干擾物包括OTA、FB1、ZEN和AFB2。其中，AFB1濃度為10 ng/mL，干擾物濃度均為100 ng/mL。如圖7所示，對(duì)干擾物的響應(yīng)幾乎與背景信號(hào)相同，只有AFB1能引起明顯的電流響應(yīng)。結(jié)果表明，該適配體傳感器對(duì)AFB1具有良好的選擇性。

圖7 傳感器對(duì)AFB1與AFB2、ZEN、OTA、FB1的響應(yīng)對(duì)比

此外，使用6根不同傳感電極檢測(cè)相同濃度的AFB1（1ng/mL），以評(píng)估傳感器的重現(xiàn)性。由圖8可知，6組測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為2.0%，表明傳感器具有較高的重現(xiàn)性。此外，我們還研究了該適配體傳感器的穩(wěn)定性，見(jiàn)圖9。在4℃冰箱中儲(chǔ)存后，傳感器對(duì)AFB1響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%，表明傳感器具有較滿意的穩(wěn)定性（7 d）。

圖8 傳感器6次平行測(cè)量1 ng/mL AFB1的重現(xiàn)性

圖9 傳感器的7 d穩(wěn)定性

2.5 實(shí)際樣品分析

將該傳感方法應(yīng)用于玉米樣品中AFB1的檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的實(shí)用性。表3列出了該傳感方法對(duì)玉米樣品中AFB1進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果?？芍搨鞲蟹椒▽?duì)AFB1檢測(cè)的回收率為93.0%～102.5%。相對(duì)較低的RSD表明，該方法用于實(shí)際樣品檢測(cè)具有較高的實(shí)用性。

表3 玉米樣品中AFB1的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了一種基于二茂鐵標(biāo)記適配體的電化學(xué)適配體傳感器，用于靈敏檢測(cè)玉米中的AFB1。適配體的引入提高了電化學(xué)傳感的選擇性，電化學(xué)探針Fc的引入提高了傳感器的靈敏度。該傳感策略結(jié)合了電化學(xué)檢測(cè)與基于DNA構(gòu)象變化的開(kāi)關(guān)探針的優(yōu)點(diǎn)，因而構(gòu)建的傳感器具有較高的靈敏度和選擇性。其對(duì)AFB1的線性檢測(cè)范圍為1.0 pg/mL～1.0 μg/mL，檢出限低至0.33 pg/mL。此外，還將該傳感器應(yīng)用于加標(biāo)玉米樣品中AFB1的檢測(cè)，結(jié)果回收率為93.0%～102.5%，RSD低于4.6%，表明具有較好的實(shí)用性。通過(guò)改變目標(biāo)物的適配體，該策略可以很容易地拓展到對(duì)各種生物分子的檢測(cè)，具有很好的應(yīng)用潛力。