劉占艷

（山東省濱州市無(wú)棣縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心，山東濱州 251900）

高致病性禽流感、新城疫等疫病對(duì)禽類(lèi)養(yǎng)殖危害巨大，疫苗的免疫是防控該類(lèi)疫病的主要途徑，鑒于此，可借助檢測(cè)抗體的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫結(jié)果的分析與考核及時(shí)掌握群體免疫動(dòng)態(tài)，指導(dǎo)適合本場(chǎng)的免疫程序，以發(fā)揮疫苗的理想保護(hù)作用，達(dá)到最佳的免疫效果。對(duì)此，免疫抗體監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性、可靠性、穩(wěn)定性以及代表性對(duì)禽流感、新城疫等疾病的控制工作具有重要的意義與價(jià)值[1]。

血凝與血凝抑制試驗(yàn)是當(dāng)前抗體監(jiān)測(cè)的主要方法，本方法操作簡(jiǎn)單，但疏忽每一步均會(huì)直接影響最終判定結(jié)果。因此，為了更好地提高禽流感、新城疫的防控水平，提高抗體監(jiān)測(cè)效果的實(shí)效性和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，現(xiàn)對(duì)試驗(yàn)的影響因素做以下簡(jiǎn)要分析。

1 樣品采集與處理

1.1 采樣

可采集動(dòng)物血液2～3mL，也可采集禽蛋蛋黃2mL。采集所使用的器具必須在有效期內(nèi)，無(wú)菌、干燥、清潔；注射器應(yīng)避免交叉使用，每個(gè)樣品更換一次注射器或采血針，采血時(shí)的環(huán)境溫度最好為20～25℃，禽類(lèi)一般在翅靜脈采血。

進(jìn)針要準(zhǔn)確，避免動(dòng)物淤血導(dǎo)致采集血樣溶血；采血速度要適中，血液從注射器移入離心管時(shí)，應(yīng)取下針頭緩慢注入，避免大量氣泡產(chǎn)生。

采集蛋黃時(shí)應(yīng)使禽蛋大頭朝下，小頭朝上，用酒精棉球?qū)⒌皻け砻娌潦酶蓛?，輕輕敲破蛋殼，可直接去掉注射器針頭，吸取蛋黃，過(guò)程中盡量避免污染。

1.2 保存與運(yùn)輸

采集的活禽血樣可自然或離心析出血清，應(yīng)選擇2000～3000r/min 離心3～5min 避免溶血。分離析出的血清如在5d 內(nèi)檢測(cè)的可放4℃冷藏保存；待檢時(shí)間超過(guò)1 周的，需要冷凍保存。保存樣品需密封并做好標(biāo)記，避免交叉和污染。冷凍保存的血清避免反復(fù)凍融，影響抗體效價(jià)。

蛋黃為防止凝固最好在1～2d 內(nèi)做完。鴨鵝血清有時(shí)會(huì)出現(xiàn)膠凍樣血清，可用一次性移液管將膠凍樣血清挑到管壁處，擠壓幾下，會(huì)得到所需血清；若擠壓后無(wú)法析出血清的，可適當(dāng)離心。

1.3 非特異性凝集和抑制因子的處理

影響非特異性反應(yīng)的因素很多，鴨鵝血清中常含有非特異性抑制因子，在做試驗(yàn)前有必要去除。消除方法主要有：56℃水浴30min 滅活，受體破壞酶處理法（RDE)，高碘酸鹽-胰酶處理法，同種動(dòng)物細(xì)胞處理法，紅細(xì)胞吸附法等。

1.3.1 非特異性凝集素的處理

紅細(xì)胞吸附法：配制20%雞紅細(xì)胞懸液，在清潔、干燥的微量血凝板上，加入50μL 待檢血清和50μL 20%雞紅細(xì)胞懸液混勻，靜置1h 以上，試驗(yàn)時(shí)吸取上清液。

1.3.2 非特異性抑制素的處理

受體破壞酶處理法（RDE)：用25mL 無(wú)菌生理鹽水溶解RDE，50μL 血清加200μL RDE 混勻后37℃水浴過(guò)液。然后加250μL 檸檬酸鈉56℃水浴加熱30min 以滅活RDE。待冷卻至室溫后將50%紅細(xì)胞50μL和RDE 處理的血清500μL混勻，靜置1h，1000r/min 離心10min 取上清液待檢。

2 器材選用

2.1 微量血凝板

國(guó)標(biāo)中選用96 孔V 型微量血凝板。一般血凝板可反復(fù)使用，也有一次性的。每次試驗(yàn)后要仔細(xì)清洗板孔，避免用尖銳物撮孔底導(dǎo)致板孔受損；多次使用后的血凝板應(yīng)按清洗程序清洗；過(guò)分磨損的血凝板應(yīng)棄置。

2.2 微量移液器

微量液器有單道和多道兩種，試驗(yàn)中都需要用到。微量移液器使用也要掌握好技巧，盡可能減少誤差。

2.2.1 移液器量程選擇

移液器的可用量程范圍是移液器最大量程的10%～100%，最佳使用量程范圍是其最大量程的1/3 到其最大量程，可根據(jù)試驗(yàn)所需選擇合適規(guī)格的移液器。

2.2.2 移液器使用方法

設(shè)定移液體積：調(diào)節(jié)旋紐從大量程調(diào)至小量程，若從小量程調(diào)節(jié)至大量程則應(yīng)先調(diào)至超過(guò)設(shè)定體積刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，以保證移液器的精確度。

裝配移液槍頭：將移液槍垂直插入槍頭，左右旋轉(zhuǎn)上緊即可。嚴(yán)禁移液器撞擊槍頭。

吸液及放液：槍頭尖端垂直浸入液面3mm 以下，吸液前槍頭先在液體中預(yù)潤(rùn)洗3 次左右。排液時(shí)將槍頭口貼到容器內(nèi)壁并保持10～40° 傾斜，平穩(wěn)地把按鈕壓到一擋，停約1s 后再壓到二擋，排出剩余液體。

2.2.3 注意事項(xiàng)

當(dāng)移液器槍頭內(nèi)有液體時(shí)切勿將移液器水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞。使用完畢，將移液器刻度調(diào)至最大量程，并將其垂直掛在移液槍架上。在日常使用中，應(yīng)避免混用而導(dǎo)致吸取的液體體積不準(zhǔn)或放液不完全，嚴(yán)禁使用移液器吹打混勻液體。

安裝吸頭應(yīng)穩(wěn)固，避免漏氣和掉落，保證吸取液體液面在同一平行線上。吸頭管嘴避免過(guò)深插入液體。吸放的力度要均勻，吸取液體應(yīng)緩慢平穩(wěn)，以防液體吸入過(guò)快而沖入加樣器內(nèi)腐蝕柱塞造成漏氣或產(chǎn)生氣泡；致使所吸液體數(shù)量不準(zhǔn)，而放液時(shí)應(yīng)干脆利落。吸頭與移液器最好配對(duì)，減少誤差。

移液應(yīng)選用潔凈、無(wú)污染的移液槽，“專(zhuān)液專(zhuān)用”對(duì)不同液體應(yīng)標(biāo)識(shí)清楚，避免污染，影響試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)后應(yīng)及時(shí)清洗干凈，晾干或37℃恒溫箱烘干備用。

3 試驗(yàn)操作

3.1 緩沖液

緩沖液體系在整個(gè)血凝及血凝抑制試驗(yàn)過(guò)程中需要保持一致性，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)選用0.01mol/L pH=7.2 的等滲磷酸緩沖液（PBS)。緩沖液使用HCl和NaOH 調(diào)節(jié)pH，并需要滅菌處理，PBS 一經(jīng)使用，于4℃保存不超過(guò)2 周。緩沖液的酸堿度會(huì)對(duì)滴度造成影響，最好選擇精確度高的pH 計(jì)調(diào)節(jié)pH。

3.2 1%紅細(xì)胞懸液

配制紅細(xì)胞懸液應(yīng)采集3 只以上成年SPF 雞或非免疫健康雞，采血量與等量阿氏液混合，減少個(gè)體雞只對(duì)病毒敏感差異以及自凝現(xiàn)象。洗滌紅細(xì)胞一定要充分，轉(zhuǎn)速1000r/min，離心10min，洗滌3 次。最后一次洗滌后，如果上清液呈紅色，說(shuō)明有溶血現(xiàn)象，則該紅細(xì)胞懸液不能使用。建議使用與血清來(lái)源相同的禽種紅細(xì)胞，以避免產(chǎn)生非特異性凝集[2]。

1%紅細(xì)胞懸液4℃冷藏保存，使用1%紅細(xì)胞懸液時(shí)，應(yīng)輕搖至混合均勻，保證每個(gè)孔紅細(xì)胞濃度一致。

3.3 病毒抗原

采集血樣時(shí)，應(yīng)向場(chǎng)主了解該禽群免疫疫苗的情況，為選擇病毒抗原提供依據(jù)。首先應(yīng)該選擇與禽群免疫疫苗相同亞型株型的病毒抗原；其次選擇與疫苗同一廠家的抗原做檢測(cè)，提高檢測(cè)的靈敏度。

病毒抗原試劑應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定保存和使用，為避免感染和反復(fù)凍融，可無(wú)菌操作分成小包裝。

3.4 4 個(gè)血凝單位（HAU）抗原

先對(duì)病毒抗原做血凝試驗(yàn)，能使紅細(xì)胞完全凝集（100%凝集，++++)的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，根據(jù)該血凝效價(jià)，配制4 個(gè)血凝單位（HAU)抗原。（如血凝效價(jià)為1:512（29)則4HAU=512/4=128，取12.7mLPBS 加抗原0.1mL 即配成1 : 128 的4HAU 抗原。)

4HAU 抗原應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，若有2 孔凝集，2 孔不凝集則視為抗原配置正確。為確保4HAU 抗原準(zhǔn)確，應(yīng)對(duì)4HAU 抗原做回歸試驗(yàn)，否則應(yīng)重新確定血凝效價(jià)。如圖1 所示（第5 孔為對(duì)照)

圖1 4HAU 回歸試驗(yàn)結(jié)果

配好的抗原室溫下放置不得超過(guò)4h，4h 以上再使用時(shí)必須做回歸試驗(yàn)，確保4HAU 抗原的準(zhǔn)確性和下一步血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的靈敏度。

4HAU 抗原標(biāo)定：在96 孔V 型板中第1～5 孔均加入PBS 25μL，然后第1 孔加入待檢4HAU 抗原25μL倍比稀釋至4 孔，5 孔作為對(duì)照，再在第1～5孔均加入1%紅細(xì)胞懸液25μL混勻。將V 型板放在室溫靜置40min 讀數(shù)。4HAU 抗原以凝集到第2 孔（1:4)為準(zhǔn)，若凝集效價(jià)高于2 孔則表明配置的工作抗原效價(jià)偏高，低于2 孔則表示配置工作抗原效價(jià)偏低，根據(jù)凝集結(jié)果進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

因此每次試驗(yàn)前要根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量計(jì)算一下本次試驗(yàn)需要多少4 單位抗原和1%紅細(xì)胞懸液，依據(jù)計(jì)算結(jié)果適當(dāng)配制避免因多配而引起浪費(fèi)。

3.5 加樣

在試驗(yàn)中，要向96 孔V 型微量血凝板加樣的過(guò)程應(yīng)注意：移液器移取液體體積要準(zhǔn)確一致，要加到板孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出；倍比稀釋待檢血清時(shí)，吸頭盡量不要離開(kāi)液面，按壓移液器時(shí)要?jiǎng)蛩倭?，避免產(chǎn)生氣泡影響吸取體積；加入抗原和1%紅細(xì)胞懸液時(shí)，要充分混勻，按照低倍到高倍的順序，避免交叉。

3.6 溫度和時(shí)間

試驗(yàn)前，樣品和試劑均需緩慢恢復(fù)至室溫，充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢悠窇?yīng)先離心至澄清后再檢測(cè)；孵育溫度控制在室溫20～25℃內(nèi)，溫度過(guò)低反應(yīng)速度變慢，溫度過(guò)高時(shí)反應(yīng)結(jié)果洗脫。孵育時(shí)間也有嚴(yán)格要求，時(shí)間過(guò)短，反應(yīng)未完全滴度偏低，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，反應(yīng)紅細(xì)胞洗脫導(dǎo)致滴度偏高。孵育時(shí)間大約在30～40min，以紅細(xì)胞對(duì)照孔完全沉淀前后5min 判定結(jié)果最佳[3]。

4 控制策略

為了更好地提高血凝和凝血抑制試驗(yàn)效果，可以采取以下措施進(jìn)行改進(jìn)。

4.1 數(shù)值處理

首先，確保血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作過(guò)程的合理性，務(wù)必保障每一位檢測(cè)人員的操作方式、步驟要符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于不合理操作出現(xiàn)的數(shù)據(jù)均需要重新檢測(cè)。

其次，要明確血凝和血凝抑制試驗(yàn)的誤差處理方式，檢測(cè)過(guò)程中至少需要2 名專(zhuān)業(yè)人員（1 名檢測(cè)、1名審核)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取與記錄，讀數(shù)時(shí)應(yīng)注意兩點(diǎn)：第一是讀取時(shí)視線的合理性，將V 型板傾斜成60 度角觀察。第二是讀取時(shí)間的合理性，室溫（20～25℃)孵育40min，HA 試驗(yàn)觀察紅細(xì)胞有無(wú)淚珠狀流淌，HI試驗(yàn)觀察對(duì)照孔的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)讀數(shù)。

4.2 結(jié)果分析

在血凝和血凝抑制試驗(yàn)中常見(jiàn)有以下2 種異常情況，需要對(duì)異常數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確性分析。

圖2 完全不凝集

圖3 完全凝集

檢測(cè)人員需要對(duì)異常數(shù)據(jù)的檢測(cè)過(guò)程、結(jié)果等進(jìn)行全面分析，明確異常數(shù)據(jù)的形成原因，如果異常數(shù)據(jù)屬于檢測(cè)失誤導(dǎo)致的，要圍繞這一失誤進(jìn)行總結(jié)反思，對(duì)結(jié)果異常的樣本或試劑需要重新檢測(cè)。工作人員還要根據(jù)實(shí)際情況采取相應(yīng)方式進(jìn)行處理，保障處理結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5 小結(jié)

影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)效果的因素很多，主要涉及樣本采集/處理、試劑配制、儀器的選擇和使用、人員的操作和結(jié)果判定、環(huán)境溫度等。因此，要嚴(yán)格按照規(guī)程認(rèn)真操作。

在實(shí)際抗體監(jiān)測(cè)中，必須全程進(jìn)行嚴(yán)格要求和管理，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題要及時(shí)糾正。試驗(yàn)中除要注意試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)外，平時(shí)應(yīng)多組織實(shí)驗(yàn)室人員參加省市級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力比對(duì)和兄弟縣市實(shí)驗(yàn)室之間的比對(duì)與交流，以助于提高試驗(yàn)質(zhì)量和結(jié)果。只有保障試驗(yàn)結(jié)果的可靠性才能真正做好對(duì)疫苗免疫效果評(píng)價(jià)，做好對(duì)禽流感、新城疫等病的預(yù)防工作，為動(dòng)物疫病防控工作提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。