王南丁 陳晉玉 李成龍 胡喬斌 雷瑗琳 張莎 李哲

研究表明,發(fā)生急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndromes,ACS)的關(guān)鍵因素是不穩(wěn)定斑塊破裂或糜爛,誘發(fā)急性血栓形成[1],所以干預(yù)這一環(huán)節(jié)對臨床防治ACS 至關(guān)重要,其中氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein,ox-LDL)被巨噬細胞攝取,泡沫細胞的形成是不穩(wěn)定斑塊發(fā)生的關(guān)鍵因素[2-3]。 充分的研究證據(jù)證實炎癥機制在不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的作用,其中大量的研究數(shù)據(jù)表明NLRP3 炎癥小體在動脈粥樣硬化進展過程中發(fā)揮重要作用[4]。 芪丹通脈片是課題組在總結(jié)長期使用益氣活血法治療動脈粥樣硬化、缺血性心臟病的臨床經(jīng)驗中形成的中藥復(fù)方,2001 年獲得新藥證書和藥品注冊批件(國藥準字:Z20090252)。 課題組前期基礎(chǔ)證明芪丹通脈片具有抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用[5-6],本實驗通過研究益氣活血配伍復(fù)方芪丹通脈片對巨噬細胞泡沫化過程及其進程中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLR pyrin domain containing 3,NLRP3)炎癥小體、下游炎性因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的影響,以深入探究其抗動脈硬化的作用靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞株與動物

RAW264.7 小鼠單核巨噬細胞株,購自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司;雄性SD 大鼠8 只,6周齡,體質(zhì)量為(280±20)g,購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗 中心。 適應(yīng) 性飼 養(yǎng) 1 周 ( 合 格 證 號:11400700180466)。

1.2 藥物、試劑與儀器

芪丹通脈片浸膏干粉(黃芪30 g、丹參30 g、當歸15 g、紅花30 g、桂枝10 g),取紅花于 60℃以下烘干,粉碎; 取丹參醇提后再濃縮成浸膏; 取炙黃芪等三味藥材和剩余量紅花粗粉及丹參藥渣用水煎煮兩次,合并二次煎液,濃縮成浸膏。 將紅花細粉與水提浸膏及醇提浸膏混合均勻,60℃以下烘干,再粉碎成細粉。 其余各組藥物浸膏制備與芪丹通脈片制備工藝大體相同。 1 g 芪丹通脈片浸膏干粉相當于生藥2.86 g[7]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法試劑盒:白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司, 貨號:E-EL-M0037c、E-EL-M0730c;CCK-8 (cell counting kit-8)試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司,貨號:CK04;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天,貨號:12658;兔多抗NLRP3 購自武漢三鷹,貨號:9771-1-AP;兔多抗半胱氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)購自英國Abcam 公司,貨號:ab62698;兔多抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)購自杭州賢至生物科技有限公司,貨號:AB-P-R001;引物合成購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;Trizol 購自中國Aidlab 生物技術(shù)有限公司,貨號:15596-018);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國GeneCopoeia 公司,貨號:QP070。

二氧化碳 CO2細胞培養(yǎng)箱(型號: MCO-20AIC),購自美國Thermo 公司;低速離心機(型號:TD5A)、高速低溫離心機(型號:KH20A)、超凈工作臺(型號:BBS-DDC)、倒置熒光相差顯微鏡(型號:IX73),均購自日本 Olympus 公司;全功能酶標儀購自Bio Tek 公司,型號:Synergy H1;磁力攪拌器購自江蘇省金壇市中大儀器廠,型號:T8-1;水平電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司,型號:JY300;移液器購自德國 Eppendorf 公司,型號:3120000011;實時熒光定量PCR 儀ABI7900 購自美國 ABI 公司,型號:7900Fast。

1.3 細胞培養(yǎng)

小鼠源巨噬細胞RAW264.7,培養(yǎng)在含10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中,置于37℃、相對濕度≥95%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2 ~3 天傳代1 次。 調(diào)整對數(shù)生長期細胞數(shù)為1×106/L 用于實驗,加入6 孔板培養(yǎng),DMEM 培養(yǎng)基誘導(dǎo)前培養(yǎng)12小時。

1.4 芪丹通脈片含藥血清的制備

大鼠每天按體重灌胃一日2 次,每次2 mL,芪丹通脈片浸膏干粉混懸3.24 g/(kg·d), 7 天后分離腹主動脈取血,用離心機離心后,用無菌試管取血清 3 mL,56℃滅活 30 分鐘,-20℃ 冰箱中密封凍存。

1.5 分組及泡沫細胞方向誘導(dǎo)

細胞融合達到40% ~50%,從對照組至復(fù)方組更換培養(yǎng)液(含非沉默siRNA),復(fù)方+ siRNA 組換培養(yǎng)液 (復(fù)方 + 含 NLRP3siRNA)。 取 DEPC 水125 μL加入含有 NLRP3siRNA 或非沉默 RNA 凍干粉中混勻,配置終濃度為20 μM。 在 jet PRIME 緩沖液中加入siRNA 溶液或siCon 溶液充分混勻后加入jet PRIME 試劑,室溫靜置10 分鐘混勻,在培養(yǎng)液中加入轉(zhuǎn)染混合液混勻,誘導(dǎo)前24 小時分別加入等量試劑于各組細胞中共同培養(yǎng)。 按照實驗要求分別處理各組細胞,對照組:DMEM 高糖培養(yǎng)液(10%FBS);ox-LDL 誘導(dǎo)組:同等濃度培養(yǎng)液+ox-LDL(50 mg/L),于37℃環(huán)境下同孵24 小時;益氣組:同等濃度培養(yǎng)液+ 黃芪含藥血清共培育12 小時后加入ox-LDL(50 mg/L)培育24 小時;活血組:同等濃度培養(yǎng)液+丹參含藥血清共培育12 小時后加入 ox-LDL (50 mg/L) 培 育 24 小 時; 復(fù) 方 組(QDTM):同上培養(yǎng)液+15%芪丹通脈片含藥血清共培育12 小時后加入ox-LDL(50 mg/L)培育24 小時。 復(fù)方+ siRNA 組:轉(zhuǎn)染后處理同復(fù)方組。 油紅染色后使用Image-Pro Plus 軟件分析各組細胞泡沫化誘導(dǎo)率(以油紅O 著色面積/細胞總面積分析)。

1.6 ELISA 法檢測細胞上清液中 IL-1β 及 IL-18 的表達水平

裂解細胞,收集細胞DNA 及蛋白,保存?zhèn)溆?。清液保存?20℃。 采用ELISA 法按照試劑盒(Life Technologies)說明書分別檢測外周血中 IL-1β 和IL-18 水平,每組重復(fù)5 次。

1.7 實時熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)分析各組細胞NLRP3、Caspase-1 的表達情況

提取細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,RT-PCR 法測定NLRP3、Caspase-1 基因表達。 反應(yīng)條件:擴增條件:50℃ 2 分鐘,95℃ 10 分鐘;95℃ 30 秒,60℃ 30秒,40 循環(huán)。 以 GAPDH 作為內(nèi)參。 由計算機自動計算得出CT 值進行分析。 引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 免疫印跡法(western blot,WB)分析各組細胞NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達情況

將細胞裂解后勻漿,取上清,由BCA 法檢測蛋白濃度,以40 μg 蛋白/每泳道上樣,電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜,分別加入兔多抗 NLRP3(1 ∶1000)、Caspase-1(1 ∶800)及 GADPH(1 ∶1000)一抗,4℃孵育過夜。 洗膜 5 ~6 次,5 分鐘/次,HRP 標記二抗,1 ∶50000 稀釋,37℃搖床孵育2 小時。 洗膜5 ~6 次,5 分鐘/次。 曝光顯色后用 BandScan 5.0 分析膠片灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0 軟件。 本實驗計量資料均符合正態(tài)分布且方差齊,以均值±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANONA),組間兩兩比較采用LSD檢驗(獨立樣本t檢驗),P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞泡沫化程度的油紅O 染色分析

對照組細胞幾乎沒有油紅O 著色,誘導(dǎo)后的各組細胞均出現(xiàn)不同程度的油紅O 著色;ox-LDL 誘導(dǎo)組細胞油紅著色面積比值最高,其余四組油紅O 著色面積比值與ox-LDL 誘導(dǎo)組比較降低均具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中復(fù)方組及復(fù)方+siRNA 組油紅著色面積比值最低,與益氣組及活血組比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果提示:益氣活血中藥能明顯減低細胞泡沫化進程,其中益氣活血配伍組作用優(yōu)于益氣組、活血組。 如圖 1、表 2 示。

圖1 各組巨噬細胞泡沫化誘導(dǎo)后油紅O 染色結(jié)果(×100)

表2 各組細胞泡沫化誘導(dǎo)后油紅O 染色結(jié)果()

表2 各組細胞泡沫化誘導(dǎo)后油紅O 染色結(jié)果()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與 ox-LDL 誘導(dǎo)組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05 ; 與活血組相比,dP<0.05。

組別 油紅O 著色面積/細胞總面積(%)0±0 ox-LDL 誘導(dǎo)組 14.94±1.78a益氣組 4.90±0.57b活血組 3.36±0.37b復(fù)方組 1.89±0.35bcd復(fù)方+siRNA 組 1.37±0.29對照組bcd

2.2 各組細胞IL-1β 及IL-18 的表達水平分析

如表3 所示:對照組中 IL-1β 及 IL-18 含量最低,與對照組比較其它各組的IL-1β 及IL-18 含量均升高,與ox-LDL 誘導(dǎo)組比較益氣組、活血組、復(fù)方組、復(fù)方+siRNA 組 IL-1β 及 IL-18 含量降低具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中復(fù)方組與復(fù)方+siRNA 組 IL-1β 及IL-18 含量較益氣組、活血組降低具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 各組細胞IL-1β、 IL-18 表達水平比較()

表3 各組細胞IL-1β、 IL-18 表達水平比較()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與ox-LDL 誘導(dǎo)組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05; 與活血組相比,dP<0.05。

組別 IL-1β(pg/mL) IL-18(pg/mL)22.69±1.86 106.01±4.13 ox-LDL 誘導(dǎo)組 53.16±2.87a 155.71±8.48a益氣組 42.31±1.49b 137.60±6.82b活血組 41.26±1.15b 127.41±4.01b復(fù)方組 32.61±2.14bcd 109.80±4.23bcd復(fù)方+siRNA 組 30.19±1.39bcd 105.91±3.48對照組bcd

2.3 各組細胞 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 表達水平分析

如表4 所示:對照組的 NLRP3、Caspase-1 含量最低;ox-LDL 誘導(dǎo)組 NLRP3、Caspase-1 含量均最高;藥物干預(yù)的四組與ox-LDL 誘導(dǎo)組相比兩個指標降低均具有統(tǒng)計學(xué)意義,其中復(fù)方組 NLRP3、Caspase-1 含量較益氣組、活血組降低具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組細胞NLRP3、 Capase-1 mRNA相對表達水平()

表4 各組細胞NLRP3、 Capase-1 mRNA相對表達水平()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與ox-LDL 誘導(dǎo)組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05; 與活血組相比,dP<0.05。

1.13±0.12 1.17±0.09 ox-LDL 誘導(dǎo)組 6.48±0.84a 3.57±0.32a益氣組 4.80±0.90b 3.20±0.35b活血組 3.70±0.59b 2.50±0.26b復(fù)方組 1.87±0.34bcd 1.71±0.21bcd復(fù)方+siRNA 組 1.78±0.31bcd 1.53±0.15 NLRP3 mRNA Capase-1 mRNA對照組組別bcd

2.4 各組細胞NLRP3、Caspase-1 的蛋白表達水平分析

從Western-blot 檢測結(jié)果來看,ox-LDL 誘導(dǎo)組NLRP3、Caspase-1 含量最高,與 ox-LDL 誘導(dǎo)組比較,其它各組的NLRP3、Caspase-1 含量均明顯降低;其中復(fù)方組及復(fù)方+siRNA 組 NLRP3、Caspase-1 的含量較益氣組、活血組降低具有統(tǒng)計學(xué)意義。 見圖2、表 5。

表5 各組細胞NLRP3、 Capase-1 蛋白相對表達水平比較()

表5 各組細胞NLRP3、 Capase-1 蛋白相對表達水平比較()

注: 與對照組相比,aP<0.05;與 ox-LDL 誘導(dǎo)組相比,bP<0.05;與益氣組相比,cP<0.05 ; 與活血組相比,dP<0.05。

0.97±1.19 0.15±0.02 ox-LDL 誘導(dǎo)組 3.40±0.26a 0.45±0.33a益氣組 2.42±0.21b 0.32±0.02b活血組 2.43±0.20b 0.29±0.03b復(fù)方組 1.61±0.17bcd 0.19±0.01bcd復(fù)方+siRNA 組 1.23±0.32bcd 0.16±0.02 NLRP3 Capase-1對照組組別bcd

圖2 各組細胞NLRP3、Caspase-1 蛋白的表達

3 討論

研究預(yù)測2030 年,我國心血管疾病患者將增加2100 余萬,與心血管相關(guān)疾病導(dǎo)致死亡的人數(shù)或?qū)⒃黾?70 萬[8]。 因此,冠心病導(dǎo)致的心腦血管事件已經(jīng)成為影響國民健康及影響醫(yī)療財政支出的重要因素。 從不穩(wěn)定斑塊的初始形成至發(fā)展成冠心病再到出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥及惡性心血管事件這一中間進程其實是需要一定時間的,那么在中醫(yī)“未病先防,已病傳變”思想的指導(dǎo)下,針對動脈粥樣硬化的治療方案及靶點迫在眉睫。 強調(diào)在冠心病不穩(wěn)定斑塊形成的早期提早干預(yù)不穩(wěn)定斑塊的發(fā)生、發(fā)展、破裂對治療冠心病、預(yù)防心腦血管事件至關(guān)重要。

粥樣硬化斑塊的形成是冠心病的早期表現(xiàn),中醫(yī)“心痛、胸痹”等范疇可涵蓋冠心病的概念,認為ACS 發(fā)病及進展多為本虛標實,本虛以氣虛為主,標實則多為血瘀、痰濁。 其中血瘀病機貫穿冠心病治療的始終。 近年來眾多實驗研究表明益氣活血中藥通過影響脂質(zhì)代謝、抗炎、保護血管內(nèi)皮、抑制平滑肌增殖等方面起到穩(wěn)定斑塊的作用[9-11],因此對益氣活血藥物的研究可能為臨床穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊,防治ACS 提供一個重要的方向。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)芪丹通脈片具有抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用[12]。 本實驗結(jié)果表明芪丹通脈片能抑制 ox-LDL 誘導(dǎo)后炎性因子 IL-1β 及IL-18 的分泌,可減少巨噬細胞泡沫化。 同時可顯著下調(diào)NLRP3、Caspase-1 的表達水平,抑制 NLRP3 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 既往研究發(fā)現(xiàn)芪丹通脈片通過調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB 信號通路發(fā)揮干預(yù)斑塊的作用[13-14],而NLRP3 炎性小體活化需要活化核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)參與[15-16],既然益氣活血中藥可以同時調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB 信號通路及干預(yù)NLRP3 炎癥小體及其下游炎性因子,那么它是否通過調(diào)節(jié)該靶通路影響NLRP3 炎癥小體的激活來發(fā)揮作用呢? TLR4-NF-κB 信號通路及NLRP3炎癥小體在益氣活血藥抗炎的過程中是否具有協(xié)同作用? 有待進一步探索。

綜上所述,炎癥反應(yīng)參與動脈粥樣硬化斑塊易損化進程中,芪丹通脈片能顯著下調(diào) NLRP3、Caspase-1 及其下游炎性因子IL-1β 及IL-18 的表達水平,減少泡沫細胞形成,這可能是其穩(wěn)定斑塊的作用機制之一,此外,研究表明益氣活血配伍后的療效明顯優(yōu)于單一治法組,從而豐富了中醫(yī)經(jīng)典益氣活血配伍的科學(xué)內(nèi)涵。