任文娟 趙曉燕

三七主要用于活血化瘀、消腫止痛等,近來(lái)發(fā)現(xiàn)其主要藥效成分三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)用于心腦血管疾病的治療。 血栓通是中藥三七的提取物,其主要成分為三七總皂苷,三七總皂苷中含多種單體皂苷成份。 血栓通注射液具有改善腦供血,增加腦灌注,抑制血小板聚集,降低血黏度等多種作用。 目前,血栓通注射液治療腦卒中意見(jiàn)不統(tǒng)一。 有學(xué)者認(rèn)為,血栓通注射液有助于腦卒中的恢復(fù),如Meng LP 等[1]發(fā)現(xiàn)PNS 可通過(guò)miR-155 調(diào)控炎癥因子的表達(dá),減輕SH-SY5Y 細(xì)胞缺血再灌注損傷。 但還有一些學(xué)者對(duì)血栓通注射液的細(xì)胞保護(hù)作用持有相反意見(jiàn),比如聶亞雄等[2]發(fā)現(xiàn)血栓通注射液治療超早期大量腦出血時(shí),可加劇早期腦水腫,引起大鼠神經(jīng)功能缺損計(jì)分增加。 在哺乳動(dòng)物中,存在三個(gè)高度保守的Hedgehog同源基因:SonicHedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh),它們分別編碼Shh、Ihh 和Dhh 蛋白。 Shh 蛋白是一種細(xì)胞外的配體,Shh 通路上的啟動(dòng)蛋白。 細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí),Shh蛋白與7 次跨膜受體Smo 蛋白結(jié)合,抑制Smo 活性,從而抑制其下游的反應(yīng)。 當(dāng)Shh 激活時(shí),Shh 結(jié)合到12 次跨膜受體Ptch 蛋白上,解除Ptch 對(duì) Smo的抑制作用,從而激活下游的Gli 家族蛋白,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、對(duì)抗凋亡、神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞增殖和自我更新,參與損傷組織修復(fù)[3-4]。 近年來(lái),Shh 通路在神經(jīng)系統(tǒng)研究也頗多,如Jin 等[5]人發(fā)現(xiàn)Shh 激動(dòng)劑激活Shh 通路可改善局灶性皮質(zhì)缺血性損傷導(dǎo)致的行為缺陷。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SY5Y)及小鼠大腦皮層神經(jīng)元,進(jìn)行AAPH 氧化應(yīng)激損傷,并將神經(jīng)元進(jìn)行氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)處理,模擬體外腦卒中,觀察神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷及缺血缺氧的作用及對(duì)Hedgohog-Patched-Smoothened 信號(hào)通路的影響,探究血栓通注射液對(duì)腦卒中神經(jīng)元的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

美國(guó)癌癥研究所(institute of cancer research,ICR)SPF 級(jí)孕15 ~17 天小鼠,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001]。 SC8 細(xì)胞、cyclopamine 為陳偉導(dǎo)師饋贈(zèng);感受態(tài)細(xì)胞為北京天壇醫(yī)院李昊文老師饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

血栓通注射液為北京天壇醫(yī)院杜萬(wàn)良老師饋贈(zèng),產(chǎn)自廣西梧州制藥公司。 TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、馬血清(horse serum,HS)、胎牛血清(foetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司;臺(tái)盼藍(lán)、DNA 酶I 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所,SAG 購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1 孕15 ~17 天小鼠胎鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng) 培養(yǎng)板的預(yù)處理:25 cm 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入0.1g/L 多聚-L-賴氨酸包被2小時(shí)。 以三蒸水沖洗干燥后待用;孕15 ~17 天ICR 小鼠,常規(guī)麻醉消毒,剪開(kāi)腹部皮膚及腹膜,取出胎鼠,放入預(yù)冷的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中;將其放置于解剖顯微鏡下緩慢剝離胎鼠的頭部皮膚與顱骨,暴露兩側(cè)大腦半球,用解剖鑷小心分離并取出雙側(cè)皮層,輕輕剔除血管和腦膜組織,置于含預(yù)冷DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的6 cm 的培養(yǎng)皿中;將上述組織塊移入至15 mL 離心管中,用1 mL 槍輕輕吹打使皮層成碎片,1500 r/分鐘,離心5 分鐘;去上清,加5 mL 0.25%胰蛋白酶和100 μL DNA 酶 I,在37℃水浴箱中作用15 ~20 分鐘,其間振蕩2 ~3次,當(dāng)消化液混濁、不含有組織塊時(shí),加含10%FBS和10%HS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止;將細(xì)胞懸液用70 目細(xì)胞篩過(guò)濾后,1500 r/分鐘,離心5 分鐘;棄上清,沉淀物中加入神經(jīng)元接種培養(yǎng)基,臺(tái)盼藍(lán)染色,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),以1×105/mL 的密度將細(xì)胞種植于培養(yǎng)板中,然后置于37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);4 小時(shí)細(xì)胞貼壁后,換神經(jīng)元維持培養(yǎng)基,以后每周2 ~3次半量換液。

1.3.2 SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng) SY5Y 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2 ~3 天傳代1 次。

1.3.3 SC8 細(xì)胞培養(yǎng) SC8 細(xì)胞是U2OS 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的βarr2-GFP 和 Smothened-633(Smo-633)的細(xì)胞系。 SC8 細(xì)胞置于含10%胎牛血清和抗生素(含100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 鏈霉素)的 MEM 培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2 ~3 天傳代1 次。

1.4 CCK-8 檢測(cè)原代神經(jīng)元細(xì)胞和SY5Y 細(xì)胞存活率

1.4.1 原代神經(jīng)元細(xì)胞存活率 原代神經(jīng)元細(xì)胞以1×105/mL 的密度接種于96 孔板,每孔100 μL,培養(yǎng)7 天進(jìn)行實(shí)驗(yàn),顯微鏡下觀察神經(jīng)元之間形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、AAPH 組和AAPH+血栓通注射液組。 AAPH 組AAPH 濃度為20 mmol/L;AAPH+血栓通注射液組AAPH 濃度為20 mmol/L,血栓通注射液濃度分別為 0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL;對(duì)照組加同等體積的正常培養(yǎng)基,每組3 個(gè)復(fù)孔。 置入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 小時(shí)后,每孔加10 μL CCK-8 試劑,在 37℃孵育4 小時(shí),用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度,3 個(gè)復(fù)孔取平均值,計(jì)算細(xì)胞存活率。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%[注:As:實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8);Ac:對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8);Ab:空白孔(不含細(xì)胞和CCK-8)]。 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、OGD 組和血栓通注射液組,對(duì)照組神經(jīng)元培養(yǎng)基換成含糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2孵箱中常氧培養(yǎng),OGD 組神經(jīng)元培養(yǎng)基換成無(wú)糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 血栓通注射液組,培養(yǎng)基換成含 0.25、0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液的無(wú)糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 培養(yǎng)20 小時(shí)后,CCK-8 檢測(cè)原代神經(jīng)元存活率,檢測(cè)方法同上。

1.4.2 SY5Y 細(xì)胞存活率 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SY5Y 細(xì)胞接種于 96 孔板,100 μL/孔(約 2×105/mL),置 37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。 將SY5Y 細(xì)胞分為對(duì)照組、AAPH 組和AAPH+血栓通注射液組。 AAPH 組 AAPH 濃度為 20 mmol/L。AAPH+血栓通注射液組AAPH 濃度為20 mmol/L,血栓通注射液濃度分別為0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、 1、2 mg/mL。 對(duì)照組加同等體積的正常培養(yǎng)基,每組3 個(gè)復(fù)孔。 置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 小時(shí)后,CCK-8 檢測(cè)SY5Y 細(xì)胞存活率,檢測(cè)方法同原代神經(jīng)元的檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 的方法檢測(cè)Gli1 的表達(dá)

原代神經(jīng)元細(xì)胞以1×105/mL 的密度接種于6孔板上,每孔2 mL,培養(yǎng)至第7 天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、SAG 組、cyclopamine 組、血栓通注射液組、SAG+cyclopamine 組和SAG+血栓通注射液組。對(duì)照組神經(jīng)元培養(yǎng)基換成無(wú)糖Earle's 緩沖液,于37℃ 、5%CO2低氧孵箱中 1% O2培養(yǎng)。 SAG 組,培養(yǎng)基換成含 0.05、0.1、0.25 μmmol/L SAG 的無(wú)糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 cyclopamine 組,培養(yǎng)基換成含 2 μmmol/L cyclopamine 的無(wú)糖 Earle's 緩沖液,于 37℃、5%CO2低氧孵箱中1% O2培養(yǎng)。 血栓通注射液組,培養(yǎng)基換成含 0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液的無(wú)糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 SAG+cyclopamine 組,換成同時(shí)含 0.05、0.1 μmmol/LSAG 和含 2 μmmol/L cyclopamine 的無(wú)糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 SAG+血栓通注射液組,換成同時(shí)含0.05、0.1 μmmol/L SAG 和含 2 mg/mL 血栓通注射液的無(wú)糖Earle's 緩沖液,于 37℃、5% CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 Trizol 法提取 RNA,用實(shí)時(shí)定量 PCR 儀檢測(cè)神經(jīng)元中Gli1 的表達(dá)。

1.6 共聚焦顯微鏡觀察SC8 細(xì)胞中βarr2-GFP 的分布情況

將 SC8 細(xì)胞分為 4 組:對(duì)照組、SAG 組、cyclopamine組和血栓通注射液組。 對(duì)照組將培養(yǎng)基換成無(wú)糖Earle's 緩沖液,于 37℃、5%CO2低氧孵箱中 1%O2培養(yǎng)。 SAG 組,培養(yǎng)基換成含 0.25 μmmol/L SAG 的無(wú)糖 Earle's 緩沖液,于 37℃ 、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 cyclopamine 組,培養(yǎng)基換成含2 μmmol/L cyclopamine 的無(wú)糖 Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中 1%O2培養(yǎng)。 血栓通注射液組,培養(yǎng)基換成含2 mg/mL 血栓通注射液的無(wú)糖Earle's 緩沖液,于37℃、5%CO2低氧孵箱中1%O2培養(yǎng)。 20 小時(shí)后,隨機(jī)選取多個(gè)視野,激光共聚焦顯微鏡觀察SC8 細(xì)胞中βarr2-GFP 的分布情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行分析處理。本研究計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布且方差齊,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn),組間比較用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血栓通注射液對(duì)AAPH 造成SY5Y 細(xì)胞損傷的影響

AAPH 作為一個(gè)氧自由基誘發(fā)劑,可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)。 當(dāng)20 mmol/L AAPH 作用SY5Y 細(xì)胞6小時(shí)后,與對(duì)照組相比,SY5Y 細(xì)胞存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重了AAPH 造成的SY5Y 細(xì)胞的損傷,其中血栓通注射液濃度為 0.015625、0.03125、0.0625、0.125 mg/mL 時(shí),細(xì)胞存活率與AAPH 組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 當(dāng)血栓通注射液濃度為0.25、0.5、1、2 mg/mL 時(shí),細(xì)胞存活率下降,與 AAPH 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 見(jiàn)表1。

表1 不同濃度血栓通注射液對(duì)AAPH 造成SY5Y 細(xì)胞損傷的影響()

表1 不同濃度血栓通注射液對(duì)AAPH 造成SY5Y 細(xì)胞損傷的影響()

注: 與對(duì)照組比較,aP<0.01;與AAPH 組比較,bP<0.01。

組別 n 細(xì)胞存活率(%)3 1.00±0.03 AAPH 組 3 0.52±0.04a AAPH+血栓通注射液(0.015625 mg/mL)組 3 0.50±0.07 AAPH+血栓通注射液(0.03125 mg/mL)組 3 0.46±0.05 AAPH+血栓通注射液(0.0625 mg/mL)組 3 0.48±0.04 AAPH+血栓通注射液(0.125 mg/mL)組 3 0.43±0.08 AAPH+血栓通注射液(0.25 mg/mL)組 3 0.32±0.03b AAPH+血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.29±0.03b AAPH+血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.22±0.06b AAPH+血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.14±0.02對(duì)照組b

2.2 血栓通注射液對(duì)AAPH 造成神經(jīng)元損傷的影響

當(dāng)20 mmol/L AAPH 作用神經(jīng)元4 小時(shí)后,與正常對(duì)照組相比,神經(jīng)元存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重AAPH 造成神經(jīng)元損傷,其中血栓通注射液濃度為0.125、0.25、0.5 mg/mL 時(shí),神經(jīng)元存活率與 AAPH組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 當(dāng)血栓通注射液濃度為1、2 mg/mL 時(shí),神經(jīng)元存活率下降至(0.29±0.06)、(0.16±0.06),與 AAPH 組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 見(jiàn)表 2。

表2 不同濃度血栓通注射液對(duì)AAPH造成神經(jīng)元損傷的影響()

表2 不同濃度血栓通注射液對(duì)AAPH造成神經(jīng)元損傷的影響()

注: 與對(duì)照組比較,aP<0.01;與AAPH 組比較,bP<0.05,cP<0.01。

組別 n 細(xì)胞存活率(%)3 1.00±0.02 AAPH 組 3 0.40±0.07a AAPH+血栓通注射液(0.125 mg/mL)組 3 0.43±0.08 AAPH+血栓通注射液(0.25 mg/mL)組 3 0.45±0.05 AAPH+血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.41±0.04 AAPH+血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.29±0.06b AAPH+血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.16±0.06對(duì)照組c

2.3 血栓通注射液對(duì)低氧條件下神經(jīng)元的存活率的影響

神經(jīng)元的存活率降至(0.76±0.03), 較對(duì)照組明顯下降(P<0.01)。 血栓通注射液作用后,加重了神經(jīng)元的損傷,當(dāng)血栓通注射液濃度為0.5、1、2 mg/mL時(shí),神經(jīng)元的存活率分別為(0.67±0.02)、(0.57±0.03)、(0.53±0.04),與 OGD 組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。 PSN 可加重低氧條件下神經(jīng)元的損傷,且呈劑量依賴性,隨著血栓通注射液濃度的增加,神經(jīng)元的存活率降低更加明顯。 見(jiàn)表3。

表3 不同濃度下血栓通注射液對(duì)低氧條件下神經(jīng)元存活率的影響()

表3 不同濃度下血栓通注射液對(duì)低氧條件下神經(jīng)元存活率的影響()

注: 與對(duì)照組比較,aP<0.01;與OGD 組比較,bP<0.01。

組別 n 細(xì)胞存活率(%)3 1.00±0.02 OGD 組 3 0.76±0.03a OGD+血栓通注射液(0.25 mg/mL)組 3 0.72±0.03 OGD+血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.67±0.02b OGD+血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.57±0.03b OGD+血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.53±0.04對(duì)照組b

2.4 血栓通注射液對(duì)低氧條件下神經(jīng)元Gli1 表達(dá)的影響

在低氧環(huán)境中,0.25 μmmol/L SAG 可使 Gli1表達(dá)明顯升高(P<0.01),與對(duì)照組比較增加(3.56±0.65 ) 倍。 Hedgehog 通 路 的 抑 制 劑cyclopamine可使Gli1 表達(dá)量下降,當(dāng)cyclopamine 濃度為 2 μmmol/L 時(shí),Gli1 表達(dá)量下降至(0.14±0.03)倍。 同樣發(fā)現(xiàn) 0.5、1、2 mg/mL 血栓通注射液也可抑制 Gli1 的表達(dá),Gli1 表達(dá)量分別下降至(0.30±0.08)、(0.16±0.04)、(0.15±0.03)倍,與cyclopamine 作用一致。 見(jiàn)表 4。

表4 不同濃度血栓通注射液對(duì)低氧條件下神經(jīng)元Gli1 的表達(dá)的影響()

表4 不同濃度血栓通注射液對(duì)低氧條件下神經(jīng)元Gli1 的表達(dá)的影響()

注: 與對(duì)照組比較,aP<0.01。

3 1.00±0.04 SAG 組 3 3.56±0.65a Cyclopamine 組 3 0.14±0.03a血栓通注射液(0.5 mg/mL)組 3 0.30±0.08a血栓通注射液(1 mg/mL)組 3 0.16±0.04a血栓通注射液(2 mg/mL)組 3 0.15±0.03水平對(duì)照組組別 n Gli1 a

2.5 血栓通注射液對(duì)低氧條件下SAG 導(dǎo)致的Gli1表達(dá)升高的影響

0.05 和 0.1 μmmol/L SAG 均可增加 Gli1 的表達(dá),分別為(3.09±0.31)倍和(5.75±0.68)倍(P均<0.01),0.1 μmmol/L SAG 組 Gli1 增加更明顯。 2 mg/mL 血 栓 通 注 射 液 和 2 μ mmol/L cyclopamine 均可降低Gli1 的表達(dá),分別降至(0.19±0.06)倍和(0.08±0.01)倍(P均<0.01),結(jié)果與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 然而,當(dāng)SAG 和血栓通注射液或cyclopamine 同時(shí)作用神經(jīng)元時(shí),發(fā)現(xiàn)血栓通注射液可抑制SAG 誘導(dǎo)的的Gli1 表達(dá)增加,血栓通注射液使0.1 μmmol/L SAG 組 Gli1 增加(5.75±0.68)倍降至增加(2.56±0.35)倍,使 0.05 μmmol/L SAG 組Gli1 增加(3.09±0.31)倍降至增加(1.7±0.21)倍(P均<0.01),作用與 cyclopamine 相似。 見(jiàn)表 5。

表5 血栓通注射液對(duì)低氧條件下SAG 導(dǎo)致的Gli1 表達(dá)升高的影響()

表5 血栓通注射液對(duì)低氧條件下SAG 導(dǎo)致的Gli1 表達(dá)升高的影響()

注: 與對(duì)照組比較,a P<0.01;與 SAG(0.1 μmmol/L)組比較,bP<0.01;與 SAG(0.05 μmmol/L)組比較,cP<0.01。

3 1.00±0.04 Cyclopamine 組 3 0.08±0.01a血栓通注射液組 3 0.19±0.06a SAG(0.1 μmmol/L)組 3 5.75±0.68a SAG(0.1 μmmol/L)組+Cyclopamine 組 3 2.23±0.38b SAG(0.1 μmmol/L)組+血栓通注射液組 3 2.56±0.35b SAG(0.05 μmmol/L)組 3 3.09±0.31a SAG(0.05 μmmol/L)組+Cyclopamine 組 3 1.95±0.23c SAG(0.05 μmmol/L)組+血栓通注射液組 3 1.71±0.21水平對(duì)照組組別 n Gli1 c

2.6 血栓通注射液對(duì)Smothened 的影響

根據(jù)激光共聚焦顯微鏡觀察SC8 細(xì)胞中βarr2-GFP 的分布情況,判斷血栓通注射液對(duì)Smothened(Smo)的作用。 對(duì)照組βarr2-GFP 呈點(diǎn)狀聚集分布在細(xì)胞質(zhì)(圖 1A)。 當(dāng) 2 μmmol/L cyclopamine 作用SC8 細(xì)胞時(shí),βarr2-GFP 的分布發(fā)生變化,在細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布(圖1B)。 2 mg/mL 血栓通注射液處理SC8 細(xì)胞,βarr2-GFP 仍呈點(diǎn)狀聚集分布在細(xì)胞質(zhì)(圖1C)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察SC8細(xì)胞中βarr2-GFP 的分布情況

3 討論

腦卒中是由腦血管病變引起的腦部疾病的總稱,故又稱為“腦血管病”。 腦缺血再灌注損傷是腦卒中很重要的病理生理過(guò)程,再灌注損傷主要是通過(guò)引起自由基過(guò)度產(chǎn)生及其“瀑布式”連鎖反應(yīng)等一系列氧化應(yīng)激變化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子如核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等的氧化損傷,從而引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[6-7]。

AAPH 作為一個(gè)氧自由基引發(fā)劑,可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化損傷,產(chǎn)生各種病理變化,在氧化應(yīng)激疾病模型中廣泛應(yīng)用[8-9]。 目前研究腦卒中的方法主要有體內(nèi)大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)和體外 OGD[10-11]。 如 MO ZT[11]以PC12 細(xì)胞OGD 為模型,模擬腦卒中,并探索石菖蒲提取物β-細(xì)辛腦對(duì)細(xì)胞自噬的作用等。 本研究以AAPH 作用造成氧化應(yīng)激損傷及OGD 處理模擬體外缺血性腦卒中狀態(tài)。 AAPH 可造成SY5Y 細(xì)胞及神經(jīng)元損傷;神經(jīng)元經(jīng)OGD 處理20 小時(shí)后,神經(jīng)元的存活率較正常對(duì)照組明顯下降(P<0.01)。 這與缺血性腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞受損結(jié)果一致。

課題組還發(fā)現(xiàn),血栓通注射液可加重AAPH造成的SY5Y 細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞損傷;且血栓通注射液降低低氧條件下神經(jīng)元的存活率,當(dāng)血栓通注射液 濃度為 0.5、1、 2 mg/mL 時(shí),與 OGD 組相比各組均(P<0.01),且呈劑量依賴性。 血栓通注射液是中藥血栓通的主要成分,血栓通的主要成分為血栓通注射液,包含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷 R1 等。 在 MCAO 造成的大鼠腦梗死模型中,血栓通注射液能明顯改善腦功能,改善腦血管滲漏,減少腦組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行OGD 處理,發(fā)現(xiàn)血栓通注射液可降低TNF-α、IL-8 及RIG-I 受體通路調(diào)控的下游細(xì)胞因子水平,血栓通注射液可能是通過(guò)RIG-I 信號(hào)通路發(fā)揮腦缺血時(shí)抗炎作用[12]。 HU SN 等[13]發(fā)現(xiàn)三七皂苷可通過(guò)激活PI3K/Akt/Nrf2通路,從而保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞因缺血再灌注誘導(dǎo)的血腦屏障破壞。 但是,部分學(xué)者對(duì)血栓通注射液的細(xì)胞保護(hù)作用持有相反意見(jiàn)。 在探索血栓通注射液對(duì)腦出血大鼠腦水腫超早期影響的研究[2]中發(fā)現(xiàn),較腦出血模型組,血栓通注射液可加重大鼠神經(jīng)缺損癥狀,增加腦含水量及鈉離子含量,說(shuō)明血栓通注射液治療超早期腦出血,可加劇腦水腫,加重大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀。 LI SY等[14]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rd 本身對(duì)BASMCs 細(xì)胞無(wú)毒性作用,但可加重H2O2造成BASMCs 細(xì)胞存活率的下降,并且呈現(xiàn)濃度依賴性。 H2O2作用BASMCs 細(xì)胞后,早期凋亡率為(20.9±3.8)%,10 μmmol/L人參皂苷 Rd 預(yù)處理 30 分鐘,細(xì)胞凋亡率下降到(31.5±3.6)%,人參皂苷可加重H2O2造成的促凋亡蛋白Bax 的增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的降低和Bcl-2/Bax 比率的降低,增加細(xì)胞色素C的釋放和caspase-9/caspase-3 激活,并降低線粒體膜電位的穩(wěn)定性。

近年來(lái),Shh 通路在缺血性腦病的研究中越來(lái)越多。 Shh 通路通過(guò)上調(diào)緊密連接(TJ)蛋白促進(jìn)血腦屏障完整性,對(duì)卒中后血腦屏障破壞產(chǎn)生保護(hù)作用[15]。 ZHANG J 等[16]發(fā)現(xiàn) SD 大鼠經(jīng)過(guò) MCAO后,立即給予側(cè)腦室注射 Shh 通路抑制劑cyclopamine,24 小時(shí)后與對(duì)照組比較,cyclopamine組Gli1、Ptch1 與SOD1 表達(dá)下降,梗死面積增加,腦水腫明顯,神經(jīng)行為缺損加重。 這些數(shù)據(jù)表明,抑制Shh 通路后,加重腦卒中的神經(jīng)損傷。 在本實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)血栓通注射液可以抑制神經(jīng)元OGD 后Gli1 的表達(dá)。 SAG 是 Shh 通路 Smo 的激活劑,可使 Gli1 表達(dá)升高,cyclopamine 是Smo 的抑制劑,可使Gli1 表達(dá)下降,因此選用SAG 和cyclopamine 作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥物。 神經(jīng)元經(jīng)過(guò)OGD 處理后,0.25 μmmol/L SAG 可使 Gli1 表達(dá)明顯升高(P<0.01),2 μmmol/L cyclopamine 可使 Gli1 表達(dá)量下降,0.5、1、2 mg/mL血栓通注射液也可抑制Gli1 的表達(dá),與cyclopamine作用一致。 并且,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究,課題組發(fā)現(xiàn)血栓通注射液可抑制 SAG 導(dǎo)致的 Gli1 的升高。 當(dāng)SAG 和血栓通注射液或cyclopamine同時(shí)作用神經(jīng)元時(shí),發(fā)現(xiàn)血栓通注射液可抑制SAG 誘導(dǎo)的的Gli1 表達(dá)增加,作用與cyclopamine 相似。

Smo 受體激動(dòng)劑具有保護(hù)神經(jīng)和促進(jìn)缺血性腦損傷后再生的作用[17]。 Smo 激活后對(duì)G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor,GPCR)信號(hào)通路有重要作用,它可以磷酸化GPCR,招募βarr2 蛋白聚集,發(fā)揮內(nèi)吞作用[18]。 在正常情況下,βarr2 均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng) Smo 或者 Smo-633 過(guò)表達(dá)時(shí),βarr2 在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生點(diǎn)狀聚集,經(jīng)過(guò)cyclopamine處理后,βarr2 又重新均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中[18]。 課題組發(fā)現(xiàn),SC8 細(xì)胞中由于Smo-633 過(guò)表達(dá),βarr2-GFP 呈點(diǎn)狀聚集分布在細(xì)胞質(zhì),給予cyclopamine 處理,發(fā)現(xiàn)βarr2-GFP 均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中,與之前研究相似。 為了驗(yàn)證血栓通注射液是否通過(guò)Smo 抑制Gli1 的降低,故用血栓通注射液作用SC8 細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)血栓通注射液組,βarr2-GFP 呈點(diǎn)狀聚集分布在細(xì)胞質(zhì),說(shuō)明血栓通注射液不能抑制Smo,可能抑制Smo 下游信號(hào)分子。

綜上所述,血栓通注射液加重體外低氧后神經(jīng)元的損傷,可能通過(guò)抑制Hedgehog 通路發(fā)揮作用,血栓通注射液抑制低氧條件SAG 導(dǎo)致的Gli1 表達(dá)升高,而不影響Smo,說(shuō)明其可能通過(guò)抑制Smo 下游因子來(lái)抑制Gli 的表達(dá)。 因此,中藥血栓通注射液應(yīng)用于腦血管病的治療時(shí)要“辨證論治”,依據(jù)中醫(yī)理論和中藥藥理學(xué)辨證選藥,科學(xué)、規(guī)范、系統(tǒng)地治療腦血管病。 本實(shí)驗(yàn)亦有不足之處,體外低氧狀態(tài)模擬腦卒中有一定的局限性,需進(jìn)一步的驗(yàn)證。