吉蘭潔 李鵬輝 張芳 顧娟娟 付永祥 王銀姍 盧昭 金凱 李慧敏 閆鏞

2 型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)是常見(jiàn)的慢性病之一。 T2DM 動(dòng)物模型是研究糖尿病發(fā)病機(jī)制和臨床防治的基礎(chǔ),高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立動(dòng)物模型是一種常見(jiàn)的造模方法,該模型適應(yīng)于研究T2DM 發(fā)病機(jī)制及評(píng)價(jià)藥物降糖效果等實(shí)驗(yàn)[1]。中醫(yī)治療T2DM 注重整體調(diào)節(jié)、辨證論治、綜合調(diào)理,以達(dá)到陰陽(yáng)平衡、氣血調(diào)和、氣機(jī)調(diào)暢、臟腑協(xié)調(diào)、清升濁降、在平穩(wěn)調(diào)糖的基礎(chǔ)上,還具有緩解癥狀的優(yōu)勢(shì)[2],同時(shí)中藥通過(guò)保護(hù)胰島β 細(xì)胞及增加胰島素敏感性,改善胰島素抵抗,改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平等途徑發(fā)揮防治糖尿病的作用[3]。 連術(shù)消渴顆粒以運(yùn)脾清熱、泄?jié)犰铕鰹橹蝿t,在臨床上常用于改善T2DM 血糖、血脂、胰島素抵抗等。 本研究通過(guò)觀察連術(shù)消渴顆粒對(duì)T2DM 模型大鼠血清炎癥水平、肝臟脂代謝、氧化應(yīng)激及肝臟病理變化的影響,為進(jìn)一步研究連術(shù)消渴顆粒在T2DM 中的具體作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD 雄性大鼠,購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,體質(zhì)量200 ~ 220 g,動(dòng)物合格證號(hào)1107261911004137; 生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK (魯)20190003;實(shí)驗(yàn)室使用許可證編號(hào)SYXK(豫)2015-0005,于22 ℃、50%濕度條件下實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)后隨機(jī)分組。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

連術(shù)消渴顆粒(成人每日34.98 g)為中藥配方顆粒,相當(dāng)于含黃連30 g、炒蒼術(shù)12 g、炒枳實(shí)10 g、升麻 10 g、陳皮12 g、姜半夏 10 g、山楂 30 g、神曲10 g、澤瀉 30 g、茯苓 15 g、僵蠶 10 g、水蛭 3 g、干姜10 g、大棗10 g、甘草6 g,由廣東一方制藥有限公司統(tǒng)一提供,批號(hào):20190807。 鹽酸二甲雙胍片產(chǎn)自中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):H20023370。

檸檬酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):2017508);檸檬酸鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):2017402);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ) (上海麥克林生化科技有限公司,批號(hào):CI0584849);甲醛溶液(西隴科學(xué)股份有限公司,批號(hào):1901232);大鼠血清一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肝組織勻漿中甘油 三 酯 (triglyceride, TG)、 總 膽 固 醇 ( total cholesterol,TC)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、 丙 二 醛 ( malondialdehyde,MDA)的ELISA 檢測(cè)試劑盒均為96T,批號(hào)分別為:E20200608A、E20201022A、E20201021A、E20201124A、E20201123A、E20201218A、E20201028A、E20201123A,均產(chǎn)自蘇州卡爾文生物科技有限公司。

血糖儀[江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司,Ⅱ型(730)];血糖試紙(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司,190311);電子秤(廣東香山衡器集團(tuán)股份有限公司,EK813);電子天平[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司,AL204];高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司,KDC-160HR);可調(diào)式移液器(上海雷勃分析儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,DHG-9038A);洗板機(jī)(美國(guó)伯騰儀器有限公司,50TS8);酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD 公司,680 型);電泳儀(美國(guó)BIO-RAD 公司,mini protean 3 cell)。

1.3 造模、分組及給藥

72 只成年健康SD 雄性大鼠,于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天后,隨機(jī)分為連術(shù)消渴顆粒高劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒低劑量組、二甲雙胍組、模型組及空白組,每組12 只。 空白組給予正常飼養(yǎng);其余各組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)(基礎(chǔ)飼料+1.5%膽固醇+10%蛋黃粉+10%豬油+0.25%膽鹽+5%蔗糖),飼養(yǎng)30 天后大鼠禁食12 小時(shí),腹腔注射STZ45 mg/kg(0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液,pH 4.2),空白組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。 1 周后,于大鼠尾部少量取血,T2DM 成模標(biāo)準(zhǔn)為:空腹血糖≥11.1 mmol/L, 隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L[4]。 連術(shù)消渴顆粒高、中、低劑量組大鼠分別給予 11.68、5.84、2.92 g/(kg·d)連術(shù)消渴顆粒灌胃,鹽酸二甲雙胍組大鼠給予0.17 g/(kg·d)鹽酸二甲雙胍片灌胃,空白組及模型組給予相同劑量的純凈水灌胃。 各組大鼠均每日給藥1 次,連續(xù)給藥30 天。 于每10 天稱體質(zhì)量1次,根據(jù)大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整用藥量。

1.4 血清炎癥因子相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后禁食不禁水12 小時(shí),腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,并取出完整肝臟。 留取血清,測(cè)定血清中 NO、NOS、TNF-α、SOD水平,所有操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 脂代謝及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

取一定量肝臟組織,剪碎,以無(wú)菌生理鹽水研磨為10%的組織勻漿,測(cè)定其中 TG、TC、GSH-Px、MDA 含量。

1.6 肝組織形態(tài)觀察

取部分肝組織以多聚甲醛浸泡固定24 小時(shí),按步驟脫水,包埋,切片,HE 染色,封固。 顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織形態(tài)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料符合正態(tài)分布,方差齊,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較用單因素方差分析,病理半定量分析采用Ridit 檢驗(yàn),以P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以P<0.01 為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2 結(jié)果

2.1 連術(shù)消渴顆粒對(duì)STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型血清 NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比較

與空白組相比,模型組大鼠血清中NO、NOS、TNF-α水平顯著升高(P<0.01),SOD 水平顯著降低(P<0.01)。 與模型組比,二甲雙胍組和連術(shù)消渴顆粒高劑量組可使大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平顯著降低(P<0.01),SOD 水平顯著升高(P<0.01);連術(shù)消渴顆粒中劑量組可使大鼠血清NO 水平降低(P<0.05),血清 NOS、TNF-α 水平顯著降低(P<0.01),SOD 水平顯著升高(P<0.01);連術(shù)消渴顆粒低劑量組可使大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平降低(P<0.05),SOD 水平升高(P<0.05)。 結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比較()

表1 各組大鼠血清NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比較()

注: 與空白組相比,aP<0.01;與模型組相比,bP<0.05,cP<0.01。

組別 鼠只 劑量(g/kg) NO(μmol/L) NOS(μmol/L) TNF-α(pg/mL) SOD(U/mL)94±8.79模型組 12 - 26.38±3.12a 30.04±1.58a 231.26±24.40a 134.63±6.78a二甲雙胍組 12 0.17 22.47±2.51c 26.68±2.15c 190.13±14.14c 149.40±5.47c連術(shù)消渴顆粒高劑量 12 11.68 22.89±2.68c 27.09±1.91c 191.81±21.11c 146.47±7.38c連術(shù)消渴顆粒中劑量 12 5.84 23.16±2.74b 27.57±1.9c 199.48±13.99c 145.38±9.08c連術(shù)消渴顆粒低劑量 12 2.92 23.36±2.54b 27.94±2.36b 212.72±13.35b 142.06±8.34空白組 12 - 21.29±2.74 25.99±1.39 169.30±17.84 155.b

2.2 連術(shù)消渴顆粒對(duì)STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型肝臟脂代謝、氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

與空白組比,模型組大鼠肝組織勻漿TG、TC、MDA 水平顯著升高(P<0.01),GSH-Px 水平顯著下降(P<0.01)。 與模型組比,連術(shù)消渴顆粒高、中劑量組和二甲雙胍組大鼠肝組織勻漿TG、TC、MDA 水平顯著降低(P<0.01),GSH-Px 活性顯著升高(P<0.01);連術(shù)消渴顆粒低劑量組大鼠肝組織勻漿TC 水平顯著降低(P<0.01),TG、MDA 水平下降(P<0.05),GSH-Px 水平顯著升高(P<0.01)。 結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝組織勻漿TG、TC、GSH-Px、MDA 水平的比較()

表2 各組大鼠肝組織勻漿TG、TC、GSH-Px、MDA 水平的比較()

注: 與空白組相比,aP<0.01;與模型組相比,bP<0.05,cP<0.01。

組別 鼠只 劑量(g/kg) TG(mmol/L) TC(mmol/L) GSH-Px(U/L) MDA(nmol/mL).43模型組 12 - 1.53±0.15a 6.35±0.97a 98.88±10.40a 8.04±0.55a二甲雙胍組 12 0.17 1.28±0.11c 5.14±0.37c 105.10±7.01c 7.25±0.42c連術(shù)消渴顆粒高劑量 12 11.68 1.32±0.71c 5.29±0.21c 106.34±11.56c 7.35±0.52c連術(shù)消渴顆粒中劑量 12 5.84 1.35±0.73c 5.40±0.25c 107.40±8.08c 7.50±0.27c連術(shù)消渴顆粒低劑量 12 2.92 1.41±0.67b 5.59±0.41c 111.56±10.64c 7.67±0.23空白組 12 - 1.22±0.88 4.93±0.28 121.47±10.32 7.17±0 b

2.3 連術(shù)消渴顆粒對(duì)STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型肝臟組織形態(tài)比較

經(jīng)Ridit 檢驗(yàn),與空白組相比,模型組大鼠肝組織病理變化顯著(P<0.01),肝小葉結(jié)構(gòu)散亂,肝細(xì)胞凝固性壞死、重度水腫,肝細(xì)胞索和肝竇排列無(wú)規(guī)律不規(guī)則。 與模型組相比,連術(shù)消渴顆粒高劑量組和二甲雙胍組大鼠肝組織病理變化顯著改善(P<0.01),連術(shù)消渴顆粒中劑量組大鼠肝臟病理變化有改善(P<0.05),連術(shù)消渴顆粒低劑量組大鼠肝臟病理變化有改善的趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)果詳見(jiàn)表 3 及圖 1。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)比較(HE 染色,×20)

表3 各組大鼠肝組織病理變化比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“糖尿病”常歸于中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇。 研究發(fā)現(xiàn),濕熱互結(jié)證已成為當(dāng)代T2DM 常見(jiàn)的主要證型之一,同時(shí)糖尿病體質(zhì)類型中濕熱質(zhì)尤為常見(jiàn)[5-7]。 “痰、熱、瘀、毒”,為 T2DM 發(fā)生發(fā)展的重要病機(jī)之一[8],且“炎癥”“氧化應(yīng)激”的發(fā)生機(jī)理與中醫(yī)學(xué)“毒”邪理論亦有密切相關(guān)性[9],具有祛濕、清熱、解毒作用的中藥及復(fù)方均可抑制炎癥[10]。課題組結(jié)合T2DM 發(fā)病特點(diǎn),總結(jié)認(rèn)為飲食不節(jié),脾失健運(yùn),濕熱互結(jié)是其主要病機(jī)之一,其中脾失健運(yùn)為其始動(dòng)因素,濕熱耗傷氣陰是T2DM 發(fā)病的內(nèi)在因素,瘀血貫穿于疾病始終,據(jù)證立法,以法組方,提出運(yùn)脾清熱,泄?jié)犰铕龅闹饕蝿t,創(chuàng)制連術(shù)消渴方。 方中黃連、蒼術(shù)共為君藥,以順應(yīng)脾性,燥濕運(yùn)脾。 升麻、枳實(shí)相伍,一升一降,以助脾運(yùn)。 陳皮、姜半夏、茯苓、澤瀉四味合用,使?jié)駸o(wú)所聚,痰無(wú)由生;山楂、神曲運(yùn)脾開(kāi)胃,通利血脈;僵蠶、水蛭合用以攻積久之滯,以上諸藥共為臣藥。 干姜溫護(hù)中焦,以為佐藥,大棗健脾益氣、甘草補(bǔ)脾和中,用以為使。 全方標(biāo)本兼顧,使脾運(yùn)、濁化、瘀消,則氣機(jī)調(diào)達(dá),三焦、經(jīng)絡(luò)通暢,消渴自已。 前期臨床研究顯示,連術(shù)消渴顆?？捎行Ы档蚑2DM(痰熱互結(jié)型)患者血糖、血脂水平,改善其臨床癥狀及體征,改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[11-14]。 實(shí)驗(yàn)研究顯示,連術(shù)消渴顆粒可以降低T2DM 模型大鼠的空腹血糖及糖基化血清蛋白水平、改善大鼠飲食量、飲水量、體重等表觀指標(biāo)[15],修復(fù)并保護(hù)其腸黏膜屏障功能,促進(jìn)結(jié)腸水通道蛋白的表達(dá)[16],可見(jiàn)該方對(duì)T2DM 具有一定的防治作用。

血清TNF-α 常作為評(píng)價(jià)機(jī)體炎癥狀態(tài)的重要指標(biāo),可誘導(dǎo)胰島細(xì)胞損傷[17]。 SOD、GSH-Px 是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶[18],能夠清除過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),保持細(xì)胞氧化還原處于平衡狀態(tài)。 NO、NOS 與機(jī)體氧化應(yīng)激關(guān)系密切,在T2DM 發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]。 NOS 在高糖狀態(tài)下過(guò)度表達(dá),從而生成大量的 NO,損傷機(jī)體[20]。 MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化裂解生成的最終產(chǎn)物[21],常作為反映氧化應(yīng)激的關(guān)鍵生物標(biāo)志物之一,T2DM 體內(nèi)MDA 水平可能高于正常者,其濃度與細(xì)胞損傷程度相關(guān)[22]。

本研究結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平及肝組織勻漿 TG、TC、MDA水平顯著升高,血清SOD 水平及肝組織勻漿GSH-Px水平顯著降低,且肝臟組織形態(tài)顯示肝小葉結(jié)構(gòu)散亂,肝細(xì)胞凝固性壞死、重度水腫,肝細(xì)胞索及肝竇排列無(wú)規(guī)律不規(guī)則,病理變化顯著(均P<0.01),這與現(xiàn)代研究結(jié)果一致。 現(xiàn)代研究表明,T2DM 者體內(nèi)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)常不同程度減弱機(jī)體調(diào)節(jié)脂肪代謝的能力,對(duì)脂肪的分解代謝產(chǎn)生抑制作用,使肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪堆積[23],久而形成脂肪肝,肝臟抗氧化能力降低;胰島素抵抗又可促使外周脂肪動(dòng)員增強(qiáng),使血中游離脂肪酸生成增多,產(chǎn)生炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)[24]。 T2DM 機(jī)體胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)與炎癥及氧化應(yīng)激狀態(tài)長(zhǎng)期共存[25],且關(guān)系密切。

本研究結(jié)果中,各劑量組連術(shù)消渴顆粒均能降低 T2DM 模型大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平及肝組織勻漿中 TG、TC、MDA 水平,升高血清 SOD 及肝組織勻漿GSH-PX 水平,與模型組比,連術(shù)消渴顆粒高劑量組可使大鼠肝臟病理變化顯著改善(P<0.01),連術(shù)消渴顆粒中劑量組可使大鼠肝臟病理變化改善(P<0.05),連術(shù)消渴顆粒低劑量組大鼠肝臟病理變化有改善的趨勢(shì)(P>0.05)。 可見(jiàn)連術(shù)消渴顆粒具有調(diào)節(jié)T2DM 模型大鼠脂代謝,改善炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用,且可改善大鼠肝臟組織病理。

綜上所述,連術(shù)消渴顆粒能夠有效降低T2DM大鼠肝組織勻漿TG、TC 水平,起到降糖調(diào)脂的作用,其機(jī)制可能與降低炎癥因子水平、改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)及肝臟病理變化相關(guān),為臨證防治T2DM提供了依據(jù)。 但該方作用途徑尚未明確,有待進(jìn)一步研究,以期充分闡明連術(shù)消渴顆粒具體作用機(jī)制。