孫春燕 高穎 程發(fā)峰 王雪茜 徐甜 劉鳳智 徐文秀 張澤涵 王慶國(guó)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是各種腦血管因素導(dǎo)致的腦組織受損引起的以學(xué)習(xí)、記憶、計(jì)算、定向等認(rèn)知功能減退為特征的臨床綜合征。隨著腦血管病發(fā)病率的升高,VD 成為最常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型之一,約占癡呆總比例的15%[1]。 VD 嚴(yán)重影響患者的精神健康及生活質(zhì)量,給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。 VD 早期具有可逆性,但目前缺乏有效的治療手段或者藥物。 治療性血管新生通過(guò)血管新生和血管重塑來(lái)增加供血,改善缺血缺氧損傷[2],為VD 的治療提供新思路、新方法。

本課題組認(rèn)為濁毒在VD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3],基于豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以清開(kāi)靈及精制清開(kāi)靈注射液為原型,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下化裁得到由黃芩、梔子和豬膽粉三種藥物組成的新藥—芩梔豬膽方。 該方具有清熱化痰、解毒通絡(luò)功效,長(zhǎng)期小劑量服用,可以解除清竅中的痰熱瘀毒,起到以清代補(bǔ)的功效。 本研究以改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎(permanent occlusion of bilateral common carotid,2-VO)大鼠模型為研究對(duì)象,以微血管密度、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)蛋白及基因?yàn)闄z測(cè)指標(biāo),通過(guò)蘇木素—伊紅染色(Hemotaxylin-eosin staining,HE)、免疫組織化學(xué)染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)等方法,探究芩梔豬膽方對(duì)VD 大鼠血管新生的影響及其潛在作用機(jī)制,為芩梔豬膽方治療VD 的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只 SPF 級(jí)健康雄性 Wistar 大鼠,體質(zhì)量200 ~220 g,購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物許可證編號(hào):SYXK(京)2020-0033]。 飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。 設(shè)置室溫25℃,相對(duì)濕度65% ~70%,光照周期晝夜各12 小時(shí),自由飲水、飲食。 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥材及制備方法

芩梔豬膽方由黃芩(安國(guó)市安興中藥飲片有限公司,貨號(hào):200901)、梔子(安國(guó)市安興中藥飲片有限公司,貨號(hào):200801)、豬膽粉(安國(guó)市盛泰中藥飲片有限公司,貨號(hào):190901)組成。 梔子采用乙醇冷浸法提取,醇提法出膏率為16.7%;黃芩按照堿溶酸沉法提取,其出膏率為11%。 按照黃芩、梔子、豬膽粉生藥配比10 ∶6 ∶1.5 稱(chēng)取各成分,各成分中分別加入20 倍純水,在超聲中緩慢加入10%NaOH 至各成分全部溶解(PH 值不超過(guò)9),得到溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ;將3 種溶液混合,緩慢滴加10%NaOH 調(diào)整PH值至預(yù)定值;在溶液中加入0.3%活性炭,加熱煮沸15 分鐘,精濾,再次滴加10%NaOH 調(diào)整PH 值至預(yù)定值,加水至刻度,灌裝后沸水浴滅菌1 小時(shí)。

1.3 主要藥品與試劑

尼莫地平片(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字: H14022821, 20 mg), 氯化鈉注射液(NEWPROBE,貨號(hào):PB30164),4%多聚甲醛固定液(艾旗,貨號(hào):S1013),戊巴比妥鈉(購(gòu)于蘇州坤宸生物醫(yī)藥有限公司),氨芐青霉素三水物(bioruler,貨號(hào):RH30261-5g),兔 SP Kit(中杉金橋,貨號(hào):SP-9001),PBS 緩沖液(中杉金橋,貨號(hào):ZLI-9062),VEGFA 抗體(Proteintech 公司,貨號(hào):19003-1),CD34 抗體(Abcam 公司,貨號(hào):ab81289),VEGFR2抗體(Abcam 公司,貨號(hào):ab39638),RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,貨號(hào):K1622),組織細(xì)胞RNA 小量提取試劑盒(MAGEN美基,貨號(hào):R4111-02),iTaq Univer SYBR Green Supermix 1000 Rxn(BIO-rad,貨號(hào):1725122)。

1.4 主要儀器

Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供),包埋機(jī)(德國(guó)Leica,EG1160),轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)型(德國(guó)Leica,RM2235),冷凍離心機(jī)(Eppdendorf,5424R),C1000 TouchTMThermal Cycler PCR 儀(BIO-rad,1851148),熒光定量 PCR 儀(BIO-rad, CFX96TMReal-Time System), 高倍顯微鏡(OLYMPUS,BX60),圖像采集系統(tǒng)(美國(guó)Diagnostic Instrument,SPOTFLEX)。

1.5 分組、造模及給藥

將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為4 組:空白對(duì)照組、模型組、芩梔豬膽組和尼莫地平組,每組6 只。除空白對(duì)照組外,其余大鼠術(shù)前禁食12 小時(shí),自由飲水,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉。 采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法復(fù)制VD 模型。 仰臥固定大鼠,備皮消毒后沿頸部正中逐層剪開(kāi),鈍性分離,用手術(shù)線結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷血流,手術(shù)線縫合皮膚。 1 周后以同樣的方式結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈。 術(shù)后連續(xù)三天注射青霉素鈉注射液0.1 mL 抗感染。 動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)眼瞼下垂、眼裂變小表明造模成功。

造模成功后第二天開(kāi)始干預(yù)。 根據(jù)文獻(xiàn)[4-5]描述,按照成人用藥劑量,換算芩梔豬膽組大鼠給藥量為31.25 mg/kg;尼莫地平組:根據(jù)成人用藥劑量,換算為62.5 mg/kg,用去離子水按照給藥體積為3 mL/kg 的比例配置為混合溶液。 空白對(duì)照組及模型組給予等體積的去離子水灌胃。 各組每日干預(yù)1 次,每周根據(jù)動(dòng)物體重變化調(diào)整給藥劑量,持續(xù)4 周。

1.6 行為學(xué)評(píng)價(jià)

采用Morris 水迷宮試驗(yàn)。 水迷宮裝置包括直徑150 cm、高60 cm 的圓形水池、逃避平臺(tái)和視頻定位儀器。 每天由固定人員在固定時(shí)間進(jìn)行測(cè)試,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持室內(nèi)安靜,避免周?chē)庠醇霸胍舻母蓴_。 (1)定位航行實(shí)驗(yàn):將大鼠面向池壁分別從4個(gè)象限放入水中,自由探索游泳,計(jì)時(shí)120 秒,記錄其尋找隱藏在水下平臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期,若超過(guò)120 秒未找到平臺(tái),逃避潛伏期記為120 秒。連續(xù)訓(xùn)練4 天。 (2)空間探索試驗(yàn):第5 日撤去水池中平臺(tái),將大鼠從原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限放入水池,記錄其在120 秒內(nèi)穿越原平臺(tái)的次數(shù)。

1.7 HE 染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化

腹腔麻醉后開(kāi)胸暴露心臟,將灌注針插入心尖,剪開(kāi)右心耳,依次迅速灌注0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛各200 mL,至流出液無(wú)血色、四肢及頸部僵硬時(shí)停止灌注。 后迅速取腦,將新鮮腦組織放入4%多聚甲醛中固定1 周。 常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚4 μm。 HE 染色,顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) CD34、VEGFA、VEGFR2 表達(dá)水平

按照免疫組化試劑盒步驟進(jìn)行染色。 微血管密度測(cè)定參照WEIDNER 法,不論有無(wú)血管管腔,單個(gè)獨(dú)立陽(yáng)性染色內(nèi)皮細(xì)胞或多個(gè)陽(yáng)性染色內(nèi)皮細(xì)胞緊密排列均為一個(gè)血管計(jì)數(shù)。 以細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGFA、VEGFR2 陽(yáng)性。 每組3 只大鼠,隨機(jī)選取2 ~3 張切片,每例標(biāo)本隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野,計(jì)算每只大鼠平均值。

1.9 qRT-PCR 檢測(cè) VEGFA、VEGFR2 mRNA 含量

(1)腦標(biāo)本采集:將每組剩余3 只大鼠麻醉抽血后迅速斷頭取腦,在冰上解剖出海馬組織,迅速放入凍存管中,并轉(zhuǎn)移至液氮中保存?zhèn)溆谩?(2)組織總RNA 的提取:取30 mg 海馬組織提取總RNA,取A260/A280≥1.8。 (3)cDNA 合成:按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟操作。 (4)mRNA 合成引物序列。 (5)mRNA 檢測(cè):qRT-PCR System CFX96 RT-qPCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性(95℃,30 秒),40 個(gè)循環(huán)變性(95℃,30 秒),退火(60℃,30 秒),以 GAPDH 為內(nèi)參,以公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。 引物序列具體見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,方差齊,以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,數(shù)據(jù)采用單因素分差分析進(jìn)行比較,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.1.1 逃避潛伏期比較 隨著訓(xùn)練天數(shù)的延長(zhǎng),各組大鼠逃避潛伏期逐漸減少,并趨于穩(wěn)定。 與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠逃避潛伏期均增加(P<0.05),芩梔豬膽組、尼莫地平組與其比較無(wú)明顯差異。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組逃避潛伏期均縮短(P<0.05);芩梔豬膽組與尼莫地平組之間逃避潛伏期無(wú)明顯差異。 見(jiàn)表2。

表2 各組VD 大鼠逃避潛伏期比較(,n=6,秒)

表2 各組VD 大鼠逃避潛伏期比較(,n=6,秒)

注: 同一時(shí)間節(jié)點(diǎn),與空白對(duì)照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01。

組別 第一天 第二天 第三天 第四天空白對(duì)照組 61.58±49.20 42.08±37.98 27.29±22.89 20.96±12.90模型組 98.13±34.21a 79.54±39.76b 56.38±43.54b 47.79±44.72b芩梔豬膽組 63.67±36.93c 45.54±36.59c 28.25±18.01d 22.71±21.65c尼莫地平組 63.58±48.16c 45.96±39.05c 29.67±21.65d 21.92±20.07d

2.1.2 穿越平臺(tái)次數(shù)比較 與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01),芩梔豬膽組、尼莫地平組與其比較無(wú)明顯差異。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)。 芩梔豬膽組與尼莫地平組之間穿越平臺(tái)次數(shù)比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。 見(jiàn)表3。

表3 各組VD 大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較(,次)

表3 各組VD 大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較(,次)

注: 與空白對(duì)照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05,cP<0.01。

組別 鼠只 穿越平臺(tái)次數(shù)空白對(duì)照組 6 3.00±1.26c模型組 6 0.83±0.75a芩梔豬膽組 6 2.83±1.47b尼莫地平組 6 2.50±1.38b

2.2 大鼠海馬CA1 區(qū)病理形態(tài)比較

空白對(duì)照組大鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞排列規(guī)整,細(xì)胞核清晰可見(jiàn),形狀近似圓形,細(xì)胞核和細(xì)胞漿對(duì)比鮮明;模型組大鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞排列紊亂,數(shù)量減少,變性壞死細(xì)胞較多,神經(jīng)元錐體細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、破裂、溶解;芩梔豬膽組和尼莫地平組大鼠海馬CA1 區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰,神經(jīng)元凋亡、壞死現(xiàn)象較模型組明顯減輕。 如圖1 所示。

圖1 大鼠海馬CA1 區(qū)HE 染色(×400)

2.3 大鼠海馬CA1 區(qū)微血管密度比較

與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠微血管密度增加(P<0.01),芩梔豬膽組及尼莫地平組微血管密度均明顯增加(P<0.01)。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠微血管密度明顯增加(P<0.01)。芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠微血管密度無(wú)明顯差異(P>0.05)。 見(jiàn)表4,圖2。

圖2 大鼠海馬CA1 區(qū)CD34 免疫組化染色(×400)

表4 各組VD 大鼠海馬CA1 區(qū)微血管密度比較(,個(gè))

表4 各組VD 大鼠海馬CA1 區(qū)微血管密度比較(,個(gè))

注: 與空白對(duì)照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01。

組別 鼠只 微血管密度空白對(duì)照組8.40±1.77模型組 3 11.53±0.55a芩梔豬膽組 3 17.57±1.40ab尼莫地平組 3 16.77±1.27 3 ab

2.4 大鼠海馬CA1 區(qū)VEGFA、VEGFR2 表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較,模型組、芩梔豬膽組和尼莫地平組大鼠 VEGFA、VEGFR2 表達(dá)水平增加(P<0.05)。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組VEGFA、VEGFR2 表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。芩梔豬膽組與尼莫地平組VEGFA、VEGFR2 表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。 見(jiàn)表5,圖3、4。

圖3 大鼠海馬CA1 區(qū)VEGFA 免疫組化染色(×400)

表5 各組VD 大鼠海馬CA1 區(qū)VEGFA、VEGFR2表達(dá)水平比較(,個(gè))

表5 各組VD 大鼠海馬CA1 區(qū)VEGFA、VEGFR2表達(dá)水平比較(,個(gè))

注: 與空白對(duì)照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,c P<0.05,dP<0.01。

VEGFA VEGFR2空白對(duì)照組組別 鼠只3 54.70±3.80 12.57±0.76模型組 3 67.90±1.08a 16.47±0.97b芩梔豬膽組 3 86.30±11.30bd 21.43±0.51bd尼莫地平組 3 81.97±3.09bc 20.90±1.95bd

2.5 大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平比較

與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠 VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平無(wú)明顯差異,但存在升高趨勢(shì)(P>0.05);芩梔豬膽組及尼莫地平組大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平明顯增加(P<0.01)。 與模型組比較,芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平明顯增加(P<0.01)。 芩梔豬膽組與尼莫地平組大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。 見(jiàn)表6。

圖4 大鼠海馬CA1 區(qū)VEGFR2 免疫組化染色(×400)

表6 各組VD 大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA水平比較()

表6 各組VD 大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA水平比較()

注: 與空白對(duì)照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.01。

VEGFA mRNA VEGFR2 mRNA空白對(duì)照組組別 鼠只3 0.75±0.13 0.74±0.00模型組 3 0.95±0.04 1.02±0.04芩梔豬膽組 3 1.33±0.15ab 1.54±0.05ab尼莫地平組 3 1.34±0.19ab 1.63±0.34ab

3 討論

“毒損腦絡(luò)”為VD 的核心病機(jī),濁毒為害是血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[3,6-7]。 “毒”是因臟腑功能和氣血運(yùn)行失常使體內(nèi)的生理和病理產(chǎn)物不能及時(shí)排出,蘊(yùn)積體內(nèi)過(guò)多形成,包括痰毒、瘀毒、熱毒等。 痰熱瘀毒三者互為因果,相互轉(zhuǎn)化,相互為患。 解毒以祛除致病因素,通絡(luò)以暢通氣血對(duì)腦絡(luò)的滲灌,使神機(jī)恢復(fù),是VD 治療的關(guān)鍵所在。

針對(duì)VD 的治療,本團(tuán)隊(duì)主張慢病緩調(diào),清熱類(lèi)中藥小劑量長(zhǎng)期服用,解除清竅中的熱毒;VD 病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí),痰、熱、毒邪進(jìn)一步耗損正氣,清熱化痰開(kāi)竅又可以起到以清代補(bǔ)的功效。 研究發(fā)現(xiàn),黃連解毒湯可以增加腦血流量,尤其是增加缺血邊緣處的血流量,改善VD 患者的臨床癥狀[3]。清開(kāi)靈注射液能增加腦灌注,明顯改善VD 患者認(rèn)知水平[8]。 精制清開(kāi)靈注射液能夠上調(diào)慢性缺血損傷大鼠海馬組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá),改善慢性缺血缺氧損傷,提高認(rèn)知記憶能力[9]。 基于對(duì)臨床需要和藥物療效的分析和權(quán)衡,課題組在前期研究成果精制清開(kāi)靈注射液的基礎(chǔ)上化裁得到治療VD 的方劑——芩梔豬膽方,藥物主要包括黃芩、梔子和豬膽粉,三藥共奏清熱化痰解毒通絡(luò)的功效。研究表明,芩梔豬膽方可以調(diào)節(jié)腦內(nèi)Treg 與Th17細(xì)胞的拮抗作用,調(diào)動(dòng)外周免疫系統(tǒng),減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥反應(yīng),改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4-5]。

Morris 水迷宮主要由定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩部分組成。 定位航行實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)迫大鼠游泳,大鼠通過(guò)視覺(jué)線索,學(xué)習(xí)并找到藏匿于水下固定位置的平臺(tái);多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)不斷加深大鼠對(duì)于空間和路線的記憶,測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)能力。 空間探索試驗(yàn)觀察撤去水下固定平臺(tái)后,大鼠對(duì)原平臺(tái)位置區(qū)域的探索,以評(píng)估大鼠記憶能力[10-11]。 本研究發(fā)現(xiàn),芩梔豬膽組大鼠與模型組比較,定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期明顯縮短,空間探索試驗(yàn)中穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加,證明芩梔豬膽方可以改善VD 大鼠的記憶學(xué)習(xí)能力。

VD 的特點(diǎn)是由于大腦的血流量減少,導(dǎo)致腦細(xì)胞缺血、缺氧。 海馬是人類(lèi)學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位,同時(shí)也是對(duì)腦缺血的敏感區(qū)域。 短暫性腦缺血即可造成海馬區(qū)神經(jīng)元不可逆性結(jié)構(gòu)損傷[12]。H?CKEL M 等[13]首創(chuàng)治療性血管新生理論,在缺血缺氧等情況下以治療手段促進(jìn)血管新生,發(fā)揮修復(fù)血管損傷作用,通過(guò)血管新生和血管重塑來(lái)增加供血,改善缺血缺氧損傷[2]。 研究表明,腦缺血發(fā)生后,海馬區(qū)微血管的增生可以改善海馬區(qū)微循環(huán)及周?chē)M織的血氧含量[12]、減輕白質(zhì)[14]和神經(jīng)元[15]損傷、增加神經(jīng)元數(shù)量[16],促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),從而提高學(xué)習(xí)記憶能力。

微血管密度是衡量血管新生的重要指標(biāo)。CD34 是高度糖基化的跨膜糖蛋白,能較好的表達(dá)于分化早期的血管內(nèi)皮細(xì)胞,在新生血管內(nèi)皮中表達(dá)率明顯高于成熟血管內(nèi)皮。 因此,將CD34 作為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)志[17]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組比空白對(duì)照組微血管密度增加,表明腦缺血可以誘導(dǎo)血管新生,但是這種誘導(dǎo)能力相對(duì)有限。芩梔豬膽組和尼莫地平組微血管密度較模型組和空白對(duì)照組均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明芩梔豬膽方可以促進(jìn)VD 大鼠海馬組織血管新生。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是目前研究最清楚、作用最明確的促進(jìn)血管生長(zhǎng)的因子[18]。 VEGF 作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、巨噬細(xì)胞等,可以促進(jìn)缺血區(qū)血流灌注、保護(hù)缺血神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)突再生等,被廣泛地應(yīng)用于缺血性腦血管病的研究中[19]。 如今VEGF 基本泛指VEGF-A,其在組織和細(xì)胞中含量最豐富,是VEGF 家族中促內(nèi)皮細(xì)胞分化和血管新生作用最強(qiáng)的因子[19-20]。 VEGF 有三類(lèi)受 體, 即 VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3。 VEGF/VEGFR2 激活的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是VEGF 信號(hào)通路的主要生物學(xué)效應(yīng),可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成,促進(jìn)血管新生[21]。 本試驗(yàn)結(jié)果顯示,VEGFA 在神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。 芩梔豬膽組大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 蛋白表達(dá)較模型組明顯升高,與陽(yáng)性對(duì)照藥尼莫地平無(wú)明顯差異。 基因水平上,芩梔豬膽組大鼠海馬組織VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平升高,與空白對(duì)照組、模型組存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述,芩梔豬膽方可以提高VD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制可能與提高海馬組織VEGFA、VEGFR2 蛋白及mRNA 水平,促進(jìn)血管新生有關(guān)。芩梔豬膽方組方精簡(jiǎn),實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)有效,臨床應(yīng)用價(jià)值較高,但仍需多中心隨機(jī)對(duì)照臨床研究數(shù)據(jù)和更深層次的機(jī)制及藥物成分研究以提供廣泛的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。