趙子楠 朱依琳 鄭立新 陶然 蔡祥焜 張楠 王淳 張建軍 田世民 王林元

隨著當代生活水平的提高居民膳食結(jié)構的改變,肥胖的發(fā)病率近年來迅速增加,已成為嚴重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題[1-3]。 肥胖與心血管、內(nèi)分泌代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多種領域疾病均存在相關性[4-6],其并發(fā)癥如高血壓、血脂紊亂、糖尿病等對人體健康造成嚴重危害。 肥胖作為亟需解決的健康問題,為社會造成極大經(jīng)濟負擔,因此探尋安全有效經(jīng)濟的天然減肥產(chǎn)品具有重要意義。

中醫(yī)藥自古以來對肥胖的病機與診斷治療具有深入廣泛的研究。 相比于西藥及外科手術減重,中醫(yī)藥注重辨證論治,個性化診療,具有整體調(diào)節(jié)、多靶點、安全經(jīng)濟的優(yōu)勢[7-9]。 中醫(yī)將肥胖分為脾虛濕阻、陰虛內(nèi)熱、肝瘀氣滯等多種證型,其中脾虛濕阻型肥胖臨床較為常見[10]。 據(jù)此,本研究以脾虛濕阻型肥胖大鼠為研究對象,將奧利司他和參苓白術散作為對照,探討中藥新產(chǎn)品健脾利濕泄?jié)岱綄ζ⑻摑褡栊头逝值臏p肥作用,以期為中藥類減肥產(chǎn)品的開發(fā)與合理應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性健康 SPF 級 SD 大鼠100 只,6 ~7 周,體質(zhì)量(180±20)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心SPF 級動物實驗室[SYXK(京)2018-0007]。 高熱量飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[許可證號:SCXK(京)2019-0008]。 飼養(yǎng)條件:室溫 20 ~22 ℃,相對濕度為60% ~70%,燈照周期為12 小時,7:00 ~19:00 燈照,19:00 ~7:00 黑暗。 試驗符合相關動物倫理學要求。

1.2 藥物

健脾利濕泄?jié)岱接绍蜍摺⒑扇~、山楂、葛根、澤瀉、決明子組成,飲片由北京晨益藥業(yè)有限公司提供,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院科研實驗中心李偉副主任藥師鑒定。 奧利司他膠囊(批號:201019,0.12 g/粒)、參苓白術散(批號:20111013,6 g/袋)分別購自重慶華森制藥股份有限公司和北京同仁堂制藥有限公司。

1.3 試劑與儀器

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)試劑盒(批號:20102515,購自北京利得曼生化股份有限公司)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)試劑盒(批號:20100405,購自北京利得曼生化股份有限公司)、肌酐(creatinine,CREA)試劑盒(批號:141120019,購自深圳邁瑞醫(yī)療電子股份公司)、瘦素(leptin,Lep)試劑盒(批號:20210225,購自北京康佳宏原生物科技有限公司)、 白細胞介素 6(interleukin-6,IL-6)試劑盒(批號:20210225,購自北京康佳宏原生物科技有限公司)、白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)試劑盒(批號:20210229,購自北京康佳宏原生物科技有限公司)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 試 劑 盒 ( 批 號:20210311,購自北京康佳宏原生物科技有限公司)、神經(jīng)肽 Y(neuropeptide Y,NPY) 試劑盒(批號:20210309,購自北京康佳宏原生物科技有限公司)。

日立7600 全自動生化儀(日本日立公司),Multiskan MK3 酶標儀(Thermo Fisher Scientific 公司),GC-2010 型免疫計數(shù)器(安徽中科中佳科學儀器有限公司),TGL-16c 型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.4 藥物制備

取奧利司他膠囊4 粒(120 mg/粒),去除囊皮,內(nèi)容物用100 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成4.8 mg/mL 的灌胃液,按1 mL/100 g 給大鼠灌胃。取參苓白術散3 袋,配制成0.18 g/mL 的灌胃液,按1 mL/100 g 給大鼠灌胃。

取健脾利濕泄?jié)岱教崛「筛喾?加水浸泡0.5小時,煎煮2 次,每次1.5 小時,第一次加水12 倍量,第二次加水10 倍量,濾過,合并提取液進行濃縮、干燥、粉碎、過篩得到干膏粉)溶于熱水中配制成高、中、低劑量(0.14、0.07、0.035 g/mL)灌胃液。

1.5 造模與給藥

大鼠適應性喂養(yǎng)7 天后按體質(zhì)量隨機分成2組,10 只大鼠給予維持飼料作為空白對照組,90 只給予高熱量飼料(在維持飼料中添加15% 蔗糖、15%豬油)作為模型對照組。 每周記錄攝食量,稱重體質(zhì)量1 次。 喂養(yǎng)2 周后,給予高熱量飼料的大鼠按體質(zhì)量增重排序,淘汰體質(zhì)量增重較低的1/3肥胖抵抗大鼠,篩選肥胖敏感大鼠。

將篩選出的60 只肥胖敏感大鼠按體質(zhì)量隨機分成6 組,分別為模型對照組、奧利司他組、參苓白術散組和健脾利濕泄?jié)岱降?120.4 mg/kg)、中(240.8 mg/kg)、高(361.2 mg/kg)劑量組,每組10只。 其中健脾利濕泄?jié)岱降蛣┝肯喈斢谲蜍摺蔀a飲片劑量各為143.3 mg/kg,荷葉、葛根、決明子飲片劑量各為86.0 mg/kg,山楂飲片劑量為57.3 mg/kg。

給藥組給予高熱量飼料,空白對照組給予維持飼料。 各給藥組大鼠灌胃相應劑量的受試樣品,空白對照組和模型對照組大鼠給予等量蒸餾水,連續(xù)6 周。 實驗第43 天,采用1%戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈取血,保存血清和血漿;同時固定部分肝組織,液氮凍存肝臟、脾臟、胃和小腸組織。

1.6 檢測指標

1.6.1 一般狀態(tài)觀察 記錄各組大鼠給藥后毛發(fā)、精神狀態(tài)等體征。

1.6.2 大鼠攝食量、體質(zhì)量、體內(nèi)脂肪含量及脂/體比的變化 記錄各組大鼠每周平均攝食量、體質(zhì)量及給藥后大鼠附睪周圍脂肪、腎周脂肪含量的變化,稱重并計算脂/體比。 脂/體比=[腎周脂肪(g)+附睪脂肪(g)]/體質(zhì)量(g)×100%。

1.6.3 大鼠血清ALT、冬氨酸酶AST 及肌酐CREA含量檢測 收集大鼠血清,采用IFCC 速率法按照試劑盒方法測定血清ALT、AST 水平;采用免疫比濁法按照試劑盒方法測定CREA 水平,具體操作方法嚴格按照說明書進行。

1.6.4 大鼠血清 IL-6、IL-10、TNF-α、Lep 和 NPY 含量檢測 收集大鼠血清,采用酶聯(lián)免疫法按照試劑盒方法測定 IL-6、IL-10 和 TNF-α 含量,具體操作方法嚴格按照說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較

模型對照組大鼠造模后出現(xiàn)毛發(fā)干枯,倦怠少動,糞便形狀不規(guī)則等情況。 與模型對照組比較,參苓白術散組、奧利司他組和健脾利濕泄?jié)岱礁鲃┝拷M對上述狀況均有一定改善。

2.2 各組大鼠攝食量的變化情況

給藥后,模型對照組大鼠與健脾利濕泄?jié)岱降?、中、高三個劑量給藥組大鼠的攝食量變化不大,最后一周略有降低。 與模型對照組相比,各給藥組大鼠攝食量數(shù)據(jù)無顯著性差異。 給藥期間各組大鼠均無死亡情況,無腹痛腹瀉情況,飲食狀態(tài)、精神狀態(tài)良好,表明健脾利濕泄?jié)岱骄哂辛己玫陌踩浴?見表1。

表1 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠攝食量變化情況(,n=10,g)

表1 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠攝食量變化情況(,n=10,g)

±13.41模型對照組 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63奧利司他組 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13參苓白術散組 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48低劑量組 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63中劑量組 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48高劑量組 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33組別 給藥前 第一周 第二周 第三周 第四周 第五周 第六周空白組 204.84±17.77 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.40

2.3 各組大鼠干預前后體質(zhì)量變化比較

給藥前各組大鼠體質(zhì)量之間無顯著性差異。第1 周,與空白組比較,模型對照組體質(zhì)量顯著升高(P<0.01),參苓白術散組體質(zhì)量明顯低于模型對照組(P<0.05),其余各組無顯著性差異;第2、3周,與模型對照組比較,健脾利濕泄?jié)岱降蛣┝拷M和參苓白術散組體質(zhì)量顯著降低(P<0.05);第4周至第6 周,各給藥組體質(zhì)量均顯著低于模型對照組(P<0.05,P<0.01)。 見表 2。

表2 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠體質(zhì)量變化情況(,n=10,g)

表2 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠體質(zhì)量變化情況(,n=10,g)

注: 與模型對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

組別 給藥前 第一周 第二周 第三周 第四周 第五周 第六周空白組 332.80±35.05 385.21±22.21b 422.03±25.09b 445.79±29.66b 464.61±35.71b 485.99±39.06b 499.57±41.96b模型對照組 365.68±19.31 428.84±28.82 481.51±36.50 524.45±46.88 562.95±53.07 604.21±59.10 645.01±63.32奧利司他組 358.54±15.46 415.28±24.70 463.87±32.34 500.75±39.00 530.76±44.91b 558.72±48.31a 583.71±52.00b參苓白術散組 355.68±14.50 407.27±24.28a 455.48±30.41a 493.37±37.96a 516.33±45.20b 547.76±50.43b 566.49±52.98b低劑量組 357.92±18.16 414.88±27.42 461.78±30.07a 493.37±37.38a 522.62±44.66b 554.37±52.29b 572.31±47.85b中劑量組 356.95±14.03 416.92±23.74 465.83±30.92 503.99±39.54 534.99±47.51a 569.97±53.65a 582.34±51.89b高劑量組 360.01±16.54 412.39±19.20 464.33±23.23 498.96±28.75 527.28±35.23a 557.47±40.59a 582.16±46.05b

2.4 各組大鼠體內(nèi)脂肪及脂/體比結(jié)果比較

模型對照組大鼠附睪周圍脂肪、腎周脂肪及相應的脂/體比顯著高于空白對照組(P<0.01)。 參苓白術散組與健脾利濕泄?jié)岱降蛣┝拷M體內(nèi)脂肪及脂/體比顯著低于模型對照組(P<0.01),健脾利濕泄?jié)岱街袆┝拷M附睪周圍脂肪及脂/體比、腎周脂/體比顯著降低(P<0.05,P<0.01),健脾利濕泄?jié)岱礁邉┝拷M僅腎周脂/體比顯著下降(P<0.05);奧利司他組附睪體周圍脂肪、附睪體周圍脂/體比、腎周脂/體比下降顯著(P<0.01)。 見表3。

表3 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠附睪腎周脂肪含量及相應脂/體比比較(,n=10)

表3 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠附睪腎周脂肪含量及相應脂/體比比較(,n=10)

注: 與模型對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

組別 附睪周圍脂肪(g) 附睪周圍脂/體比(%) 腎周脂肪(g) 腎周脂/體比(%)空白組 8.46±1.73b 1.67±0.60b 3.62±1.73b 0.65±0.18b模型對照組 21.03±7.86 3.51±0.80 7.65±2.49 1.27±0.24奧利司他組 17.98±2.02b 2.73±0.62b 6.28±2.02 0.97±0.19b參苓白術散組 17.98±2.02b 2.27±0.68b 5.26±2.03b 0.81±0.27b用藥低劑量組 14.58±2.28b 2.09±0.57b 5.24±2.28b 0.75±0.29b用藥中劑量組 16.41±2.69a 2.59±0.66b 6.00±2.69 0.94±0.34b用藥高劑量組 17.30±1.35 3.07±0.64 6.04±1.35 1.04±0.20a

2.5 各組大鼠血清ALT、AST、CREA 含量比較

模型對照組較空白對照組大鼠ALT、AST 以及CREA 指標沒有明顯變化,各給藥組ALT、AST 以及CREA 與模型對照組對比均無顯著性差異,提示可能給藥后未對大鼠肝腎功能造成損傷。 見表4。

表4 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠ALT、AST以及CREA 含量比較(,n=10)

表4 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠ALT、AST以及CREA 含量比較(,n=10)

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2.6 各組大鼠血清 IL-6、IL-10 及 TNF-α 含量比較

模型對照組大鼠血清IL-6、TNF-α 含量顯著高于空白對照組(P<0.01),IL-10 含量顯著低于空白對照組(P<0.01)。 與模型對照組比較,奧利司他組、參苓白術散組以及健脾利濕泄?jié)岱降椭懈呓M血清 IL-6、TNF-α 含量均顯著降低(P<0.01),IL-10 含量顯著上升(P<0.01)。 與奧利司他組、參苓白術散組比較,健脾利濕泄?jié)岱降蛣┝拷MIL-6 含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),健脾利濕泄?jié)岱街?、高劑量組 IL-6、TNF-α 含量顯著降低(P<0.01),IL-10 含量顯著升高(P<0.01)。 見表5。

表5 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠血清IL-6、IL-10 及 TNF-α 含量比較(,n=10)

表5 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠血清IL-6、IL-10 及 TNF-α 含量比較(,n=10)

注: 與模型對照組相比,a P<0.05,b P<0.01;與奧利司他組相比,cP<0.05,dP<0.01;與參苓白術散組對比,eP<0.05,fP<0.01。

組別 IL-6(pg/mL) IL-10(pg/mL) TNF-α(pg/mL)空白組 52.24±7.61b 70.50±6.70b 60.98±9.44b模型對照組 110.14±19.12 44.12±5.60 75.14±5.20奧利司他組 86.63±5.63b 62.97±7.39b 68.33±5.35a參苓白術散組 88.50±14.95b 60.11±6.57b 65.58±5.18b用藥低劑量組 70.59±16.07bde 64.46±6.68b 59.34±6.52b用藥中劑量組 61.23±14.22bdf 73.20±5.02bdf 56.06±6.77bdf用藥高劑量組 52.03±14.67bdf 77.27±8.37bdf 50.57±7.82bdf

2.7 各組大鼠Lep 和NPY 含量比較

模型對照組大鼠Lep 含量顯著高于空白對照組(P<0.01),NPY 含量顯著低于空白對照組(P<0.05)。與模型對照組比較,奧利司他組、參苓白術散組以及健脾利濕泄?jié)岱礁鲃┝拷M血清Lep 含量均顯著降低(P<0.01),健脾利濕泄?jié)岱礁邉┝拷MNPY 含量顯著上升(P<0.01);與奧利司他組比較,健脾利濕泄?jié)岱礁鲃┝拷MLep 含量均顯著降低(P<0.01),健脾利濕泄?jié)岱礁邉┝拷M NPY 含量顯著上升(P<0.01);與參苓白術散組比較,健脾利濕泄?jié)岱街袆┝拷MLep 含量顯著降低(P<0.05),健脾利濕泄?jié)岱礁邉┝拷MNPY 含量顯著上升(P<0.05)。 見表6。

表6 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠血清Lep、血漿NPY 含量比較(,n=10)

表6 各組脾虛濕阻型肥胖大鼠血清Lep、血漿NPY 含量比較(,n=10)

注: 與模型對照組相比,a P<0.05,b P<0.01;與奧利司他組相比,cP<0.05,dP<0.01;與參苓白術散組對比,eP<0.05,fP<0.01。

組別 Lep(ng/mL) NPY(pg/mL)空白組 1.28±0.32b 115.27±24.95a模型對照組 3.89±0.83 90.02±29.96奧利司他組 2.90±1.25b 94.29±26.30參苓白術散組 2.60±0.84b 93.59±20.61用藥低劑量組 2.09±0.48bd 107.73±45.86用藥中劑量組 1.95±0.68bde 111.82±28.33用藥高劑量組 2.10±0.46bd 126.26±35.82bde

3 討論

本研究健脾利濕泄?jié)岱揭攒蜍?、荷葉、山楂、葛根、澤瀉、決明子組方,茯苓為君藥,荷葉和山楂為臣藥,具有健脾養(yǎng)胃、利濕化濁和消積導滯功效[11-14]。 依據(jù)“飲食自倍,腸胃乃傷”,建立高熱量飼料誘導的脾虛濕阻型肥胖大鼠模型。 通過觀察模型對照組大鼠精神萎靡,倦怠少動,毛發(fā)干枯體征狀態(tài)及攝食量、體質(zhì)量、體內(nèi)脂肪含量等各項現(xiàn)代科學指標,表明模型符合“過食油膩厚味、滋膩肥甘,損傷脾胃;氣虛沉困怠惰,缺乏體力活動,使痰濕停滯,造成脾濕健運、濕痰內(nèi)阻”的脾虛濕阻型肥胖證候特點。

ALT 和AST 是臨床診斷肝損傷的金指標,能反映肝功能的損傷情況,血清ALT、AST 水平降低可反映肝組織損傷得到改善[15]。 CREA 目前被用作評價腎功能的最常用指標之一,研究表明當腎臟組織病理性受損,腎小球過濾程度降低時,CREA 顯著升高[16]。 本實驗研究對象為具有減肥功能的中藥復方,針對人群為亞健康狀態(tài)的肥胖人群,在造模時避免造成病理性損害較大的動物模型。 實驗結(jié)果表明,模型對照組大鼠ALT、AST 及CREA 含量較空白組大鼠無顯著性差異,健脾利濕泄?jié)岱降椭懈邉┝拷M大鼠三項指標較模型對照組大鼠無顯著性差異。 結(jié)果顯示造模及健脾利濕泄?jié)岱骄磳Υ笫笤斐筛文I損傷,健脾利濕泄?jié)岱皆诎l(fā)揮顯著減肥作用的同時兼具安全性。

肥胖是一種由炎癥因子誘導的低級別炎癥狀態(tài),在脂肪生長中有多種脂肪因子在參與炎癥免疫反應中發(fā)揮重要作用,炎癥是造成肥胖發(fā)生發(fā)展的主要病理機制之一[17-20]。 研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者體內(nèi)炎癥因子TNF-α 以及IL-6 表達明顯增加,能促進脂肪生成及脂肪組織堆積[21];抗炎癥因子IL-10 含量在肥胖人群中表達水平下降,導致炎癥增加[22]。 同時炎癥細胞因子也兼具促血管生成功能[23],研究認為脂肪組織中的血管生成是通過炎癥驅(qū)動的,內(nèi)皮細胞功能障礙是肥胖發(fā)病的早期事件[24]。 實驗結(jié)果顯示,模型對照組大鼠炎癥因子TNF-α 與IL-6 水平較空白對照組顯著升高,抗炎癥因子IL-10 水平顯著降低,表明肥胖大鼠產(chǎn)生明顯炎癥狀態(tài)。 給藥組較模型對照組炎癥因子TNF-α 與IL-6 顯著降低,抗炎癥因子IL-10 水平顯著升高,且健脾利濕泄?jié)岱街笜藘?yōu)于陽性藥對照組,提示其能改善肥胖狀態(tài)炎癥因子水平,進而發(fā)揮調(diào)節(jié)脂肪作用,其減肥作用可能與調(diào)節(jié)機體炎癥免疫水平相關。

能量攝入與利用失衡是導致患者超重的直接原因,是肥胖發(fā)生發(fā)展的主要病理機制之一[25]。Lep 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)能量代謝的關鍵調(diào)節(jié)因子之一,由肥胖基因編碼通過激活其受體傳遞調(diào)節(jié)脂肪堆積、抑制能量代謝信號[26]。 一方面,Lep 直接作用于脂肪組織[27],抑制脂肪合成,加速脂肪儲存能量轉(zhuǎn)化和釋放,抑制肥胖發(fā)生[28];另一方面,NPY可以通過調(diào)控脂肪組織產(chǎn)熱,發(fā)揮機體能量調(diào)節(jié)作用[29]。 臨床研究表明,肥胖患者Lep 水平較高,但由于能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)受損,升高的Lep 并不能降低體重,存在Lep 抵抗現(xiàn)象,從而引起食欲調(diào)節(jié)通路功能障礙和進一步的能量平衡紊亂,而Lep 不敏感已成為導致肥胖的關鍵原因之一[30]。 本實驗模型對照組Lep 顯著升高,NPY 明顯降低,提示存在能量平衡紊亂,能量代謝異?，F(xiàn)象。 給藥組較模型對照組Lep 顯著降低,NPY 明顯升高,其中健脾利濕泄?jié)岱侥苷{(diào)節(jié)模型大鼠上述指標,且優(yōu)于陽性藥對照組,提示健脾利濕泄?jié)岱娇赡芡ㄟ^增強瘦素敏感性,調(diào)節(jié)能量代謝及脂肪堆積,發(fā)揮減肥減重作用。

綜上,健脾利濕泄?jié)岱骄哂幸欢ǖ臏p肥作用,且指標上整體優(yōu)于陽性藥奧利司他和參苓白術散。通過研究炎癥免疫及能量代謝相關指標,探討其減肥作用,其作用機制可能與調(diào)節(jié)機體脂肪存儲分解合成,調(diào)節(jié)能量代謝平衡,改善炎癥反應等有關,為揭示肥胖機制及指導中藥類減肥產(chǎn)品開發(fā)應用提供重要的研究價值。