侯對虎 方子寒 李西文

種質資源是藥用植物遺傳研究和品種選育的基礎。 表型性狀的測量與評價是研究種質資源多樣性最直接和簡便的研究方法,可為新品種選育提供依據。 太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根,具有益氣健脾、生津潤肺之功效。 野生太子參分布于華東、華北、東北和西北等地的陰濕下坡、林下、草從或巖石縫內。 太子參的種質資源存在豐富的多樣性[1-2]。 但由于生態(tài)環(huán)境變化,導致太子參野生資源瀕危。 目前太子參商品藥材主要來源于人工栽培品種。 近年來,關于太子參的現代科學研究主要集中在化學性質、藥理作用及種植方式的品質評價等方面。 HU 等[3]研究發(fā)現太子參多糖(PHP)具有較好的降血糖活性,可以明顯改善胰島素的耐受,抑制炎癥因子TNF-α 和抗炎因子IL-10 的表達,發(fā)揮胰島素增敏作用;蔡巧燕等[4]分離得到太子參18 株內生菌并進行體外抗氧化實驗,表明太子參內生菌具有一定的抗腫瘤、抗氧化活性,可以作為篩選抗腫瘤先導化合物的潛在資源;龍正齡等[5]以不同種源太子參種參為研究材料,從生物學性狀、生長后期病害情況等方面展開研究,結果發(fā)現種參的選擇對產量和品質尤為重要;熊厚溪等[6]基于性狀和藥材品質對貴州8 個太子參品系進行了篩選與評價;巫小宏等[7]比較不同太子參種植材料(種子繁殖、塊根繁殖)的產量、病害、經濟效應指數。 但針對太子參的種質資源多樣性研究較少,針對表型分類的資源評價更是鮮有文獻報道。 太子參種質資源混雜、栽培種植盲目引種、擴種以及生產中連作障礙等,嚴重制約了太子參藥材產業(yè)化的健康發(fā)展。 本研究通過田間太子參的表型篩選、生物學性狀測量、遺傳多樣性計算、藥用成分含量及產量分析等,評價太子參種質不同表型的差異性,以期為篩選太子參新品種選育和種群遺傳學研究奠定基礎,也為其它藥用植物表型資源評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗區(qū)

栽培太子參選用貴州黔東南地區(qū)施秉縣農家種根。 基地位于貴州省黔東南苗族侗族自治區(qū)施秉縣牛大場鎮(zhèn)黃泥田(東經 107°57′26″、北緯 27°11′24″),屬亞熱帶濕潤季風氣候區(qū),其土壤類型為沙壤土,年平均氣溫15.3℃,年降水量1232.9 mm,年日照時數1045.1 小時,年平均相對濕度83%,種植區(qū)域形狀呈“弓形狀”,以保證土壤的排水系統良好。

1.2 實驗試劑與儀器

環(huán)肽B(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號:PRF22030341),色譜級甲醇(純度>95%,賽默飛世爾科技有限公司),分析甲醇(純度>95%,北京化工廠),色譜級乙腈(純度>95%,賽默飛世爾科技有限公司),800Y 型多功能粉碎機(武義海納電器有限公司),RE52CS 旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),KQ-500DE 型數碼超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),DGG-9070B 型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司),ME204/02 型1/10 萬電子天平(上海菁海有限公司), Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS 超高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 生物學性狀測量 2020 年12 月栽種,栽種前撒入基肥,播撒種子,覆土2 ~3 cm,株行距10 cm×25 cm,3 月出苗后間苗,其它與當地栽培管理習慣進行日常管理。 太子參出苗后,于生長旺盛期,利用不同顏色標記牌記錄不同表型植株,并選取長勢一致健康植株各30 株,各表型隨機取樣13 株,分別測量株高(cm)、冠幅長(cm)、冠幅寬(cm)、葉片長(cm)、葉片寬(cm);倒苗期進行采樣,于7 月28 日至8 月3 日采挖所有表型的太子參塊根,并測量和統計中部根粗(mm)、根長(cm)、單株鮮重(g)、單株干重(g),同時根據單株鮮重和種植密度(20000株/畝),估算各表型植株的畝產量。

1.3.2 環(huán)肽B 含量測定 (1) 對照品溶液的制備[8]。 精密稱取太子參環(huán)肽B 對照品1.65 mg,置于5 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容,作為對照品儲備液。 精密吸取環(huán)肽B 1.45 mL 置10 mL 量瓶中,用甲醇定容,即得環(huán)肽B 濃度為47.85 μg/mL 的對照品溶液。 (2)供試品溶液的制備。 取太子參藥材粉末(過四號篩)約2 g,用萬分之一天平精密稱定,精密加入甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理45 分鐘,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液25 mL,至圓底燒瓶中,利用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干,殘渣加甲醇溶解,轉移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻0.22 μm 濾膜過濾,取濾液作為樣品溶液。 (3)色譜條件。 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS 超高效液相色譜條件測定,XBridge C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,2.5 μm),以乙腈為流動相A,H20 為流動相B,按照梯度洗脫:0 分鐘,98%(A) ~2%(B);10 分鐘,72%(A) ~28%(B);20 分鐘,42% (A) ~ 58% (B),流速為0.5 mL/min,柱溫35℃,檢測波長為203 nm。 用太子參環(huán)肽HB(Heterophyllin B)的對照品做標樣。 精確吸取2 μL 樣品溶液進行分析測定,記錄峰面積,根據對照品與樣品的峰面積計算太子參環(huán)肽HB(Heterophyllin B)的含量。

1.4 數據處理與分析

Shannon-Weaver 多樣性指數[9]生物學性狀根據每個性狀的平均觀測值(x)和標準差(σ),按照x=kσ(其中 k=0、0.5、1、1.5、2)將每一性狀的觀測值劃分為10 個等級,分級后的數據按照公式H′ =-計算多樣性指數(H′),其中,P表i示某性狀第? 等級的分布頻率,該頻率為處于第?等級的材料個數占總材料之比。

使用 Excel2021 進行數據記錄和整理;利用IBM SPSS 24.0 軟件進行單因素方差分析,Duncan法檢驗顯著性,主成分分析,并利用在線軟件(https:/ /www.metabo)[10]對8 個生物學性狀進行相關性分析,使用Origin2022 進行繪圖。

2 結果

2.1 太子參生物學性狀分析與表型分類

2.1.1 太子參地上植株特點及表型分類 按照葉寬分類。 在太子參生長旺盛期,觀察并記錄太子參地上部植物學特征,可根據葉寬分為3 類:大葉型(葉片寬>4.0 cm)、中葉型(葉片寬3.5

圖1 太子參3 種表型葉片特征

2.1.2 按照花和莖分類 太子參一般頂端著生一朵花(少量2 ~3 朵),花瓣5。 田間發(fā)現部分太子參為聚傘花序,成簇狀分布(圖2A1、2),將其命名為多花型。 大部分太子參植株在莖部表現為主莖單一,而部分植株莖頂端主莖均等一分為二(圖2B1、2)。 依據其生物學特征,將其命名為雙柱型。 其形態(tài)學特征為莖頂端均等分裂,葉片表面有絨毛。

圖2 多花型和雙株型的形態(tài)特征

2.1.3 太子參根部特點 通過對5 個表型的根長(SRL)、中部根粗(MT)、單株鮮重(FWP)比較分析(表1),發(fā)現不同表型根部特征和單株鮮重存在顯著性差異,并且雙柱型和多花型的單株鮮重差異極顯著。 大葉型表現為根細,塊根紡錘形,須根少,根表皮為黃色,塊根少而小;小葉型中部根直徑較粗,塊根圓棒形且較多,根表皮為淡黃色,可作為高產繁殖材料;中葉型根部形狀細而長呈長圓條形,根表皮為淡黃色,上部較粗,往下依次變細;雙柱型根表皮為黃色,莖較粗,須根較少,下部有明顯的主莖,頂部為雙莖型,塊根多而細;多花型須根較多,塊根較細,表皮呈淡黃色。 小葉型中部根粗區(qū)別于其他表型較粗。 從根長性狀差異分析表明,中葉型的根長(表1)與其他的表型呈現極顯著差異性(P<0.01),而大葉型與小葉型之間差異性不明顯。

表1 太子參不同生物學性狀比較(, n=65)

表1 太子參不同生物學性狀比較(, n=65)

注: a、b、c 代表不同表型生物學性狀間存在顯著差異(aP、bP、cP、dP<0.05,aP、bP、cP、dP<0.01)。

性狀 大葉型 小葉型 中葉型 雙柱型 多花型株高(cm) 9.79±1.93b 7.58±1.46a 10.48±1.57b 12.28±2.20c 9.79±2.44b冠幅長(cm) 16.14±1.31d 9.76±0.90a 15.33±1.22cd 14.22±2.58bc 13.12±3.38b冠幅寬(cm) 14.20±1.35d 9.02±0.99a 12.99±2.52cd 11.87±1.74bc 11.15±2.15b葉片長(cm) 7.97±0.53c 4.87±0.48a 7.65±0.60c 6.81±1.02b 6.64±1.69b葉片寬(cm) 4.94±0.37c 2.76±0.19a 3.29±0.29b 3.54±0.51b 3.50±0.79b單株鮮重(g) 11.50±0.97b 18.02±1.31d 17.17±1.54d 14.42±3.29c 8.59±1.25a中部根粗(mm) 4.16±0.75b 5.14±0.45c 4.49±0.54b 4.32±0.59b 2.97±0.39a根長(cm) 6.55±1.39b 7.03±1.19b 11.02±2.22d 9.47±1.44c 4.42±1.31a

2.2 基于生物學性狀的太子參遺傳多樣性分析

對太子參的8 個生物學性狀進行多樣性分析(表2),變異系數為21.1% ~ 36.0%,平均值為24.7%。 根長(SRL)的變異系數最大,其次是葉片長(LL),冠幅寬(CW)最小,變異系數大小排列順序為根長>單株鮮重>株高>葉片寬>冠幅長>葉片長=中部根粗>冠幅寬。 變異系數較大為根長、單株鮮重、株高,表明這3 個生物學性狀變異幅度較大;而變異系數較小的為葉片長、中部根粗、冠幅寬,表明這3 個生物學性狀的變異幅度較小,遺傳特性較為穩(wěn)定。 在遺傳多樣性指數方面,冠幅寬(CW)、單株鮮重(FWP)、根長(SRL)的多樣性指數最高,均超過2.00,其他的表型多樣性指數都超過1.90。 8 個生物學性狀平均多樣性指數達到1.97。 綜合表明,太子參種質資源各性狀之間具有顯著性差異和明顯的多樣性。

表2 太子參不同生物學性狀多樣性分析(n=65,cm)

圖3 太子參5 種表型根部性狀特征

2.3 太子參不同生物學性狀的相關性分析

太子參不同表型生物學性狀相關性分析結果(圖4) 表明,葉片寬與單株鮮重呈現極顯著(P<0.01)負相關,植株葉片越大,其地下生物量的積累量越少;株高與冠幅寬、葉片寬、葉片長呈極顯著(P<0.01)正相關,而與中部根粗、單株鮮重顯著負相關,根長與中部根粗、葉片寬呈顯著負相關,與葉片長、株高顯著正相關,綜合比較太子參的地上性狀與地下部分相關性,結果表明地上生物量的積累與地下生物量的積累呈負相關。

圖4 太子參不同生物學性狀相關系數

2.4 太子參不同生物學性狀的主成分分析及差異性分析

對太子參8 個生物學性狀進行主成分分析,以特征值大于1 為標準提取主成分,得到3 個主成分,累計貢獻率達83.415%(表3),能反映太子參表型性狀的基本特征。 第1 主成分的特征值為3.643,貢獻率為45.537%,主要是冠幅長、冠幅寬、葉片長、葉片寬等,其特征向量都在0.5 以上,此類生物學性狀均與地上生物量的積累有關。 表明第一主成分基本代表了地上生物量特征。 第2 主成分的特征值為1.933,貢獻率為24.168%,主要由單株鮮重、中部根粗、根長等決定,該類性狀主要反映地下生物量的積累。 第3 主成分的特征值為1.097,貢獻率為13.709%,主要反映的是株高的形態(tài)特征。

表3 太子參不同生物學性狀主成分分析(n=65)

2.5 太子參藥用成分含量及產量分析

不同表型的樣品環(huán)肽B 測量3 次重復,每個處理方法相同。 含量結果如表4,其HB 標準品的保留時間為tR=19.581 分鐘;試樣保留時間為tR=19.578 分鐘,通過其峰面積和標準曲線計算可知,中葉型太子參HB 含量(表4)達到藥典標準(不少于0.02%)。 評估不同表型太子參的產量,結果表明大葉型、多花型、雙柱型3 個表型的產量之間呈現極顯著性差異(P<0.01),而中葉型和小葉型之間沒有顯著性差異。 大葉型(230.15±19.43)顯著高于多花型(171.84 ±24.96),而顯著低于雙柱型(288.31±65.85)。 中葉型(343.38±30.78)與小葉型(360.31±26.28)沒有顯著差異。 綜合評價可知小葉型可以作為一種高產種質材料,而中葉型可以作為環(huán)肽B 含量較高的種質材料。

表4 太子參5 種表型的含量和畝產量測定結果比較(n=65)

3 討論

野生太子參為多年生草本植物,人工馴化栽培后其生活史由多年生變?yōu)樵侥晟?生態(tài)壞境、生活型的改變使太子參表現型出現多樣性。 隨著太子參的相繼引種,各個產地和品種間種植材料的交流,也直接影響太子參品質和含量的均一性。 本研究以太子參主產區(qū)貴州省施秉縣的人工栽培植株為研究對象,從太子參表型分類、生長發(fā)育特征以及經濟性狀等方面,對不同表型太子參的生物學性狀、有效成分、產量進行比較分析,以探討太子參不同表型與經濟測量指標之間的相關性。 通過單因素方差分析可知,5 種不同的表型組間在產量上有顯著性差異(P< 0.01)。 5 個表型的8 個生物學性狀的相關性分析表明,葉片寬對于地下生物量的影響呈現負相關(圖4),說明葉片越大,地下生物量越小,這與文獻報道一致[11]。 葉片是地上生物量積累的主要營養(yǎng)器官,塊根是太子參的地下生物量積累的營養(yǎng)器官,塊根的膨大與否,和地上是否有足夠的營養(yǎng)轉化有直接相關。 在一定條件下,大葉型的葉片數較少,葉片總表面積及地上生物量較少,可能光合轉化效率較小葉型低或暗呼吸效率高導致,光合總積累少于小葉型。 小葉型的種質可作為培育高產品種的潛在材料。

本研究結果顯示,根長和單株鮮重2 個生物學性狀多樣性豐富,變異系數(CV)和Shannon-Weaver多樣性指數(H')較高,冠幅寬變異系數(CV)值最低,說明冠幅寬在種間的穩(wěn)定性較好,可視為今后優(yōu)良品種選育的主要指標性狀;8 個生物學性狀主成分分析結果顯示,3 個主成分的累計貢獻率達83.415%,其中第1、2 主成分分別反映地上生物量和地下生物量的基本特征,此類累計貢獻率較高的性狀可便于區(qū)別其他雜種優(yōu)勢種質。

太子參花為二型花,即開放花和閉鎖花,閉花受精作為植物非常特殊的繁育系統,同時存在正常開放可進行異交的開放花和閉鎖不開放進行自交的閉鎖花。 植物產生閉鎖花進行后代延續(xù),是被子植物適應壞境的一種非常有效的繁殖保障策略。LUO 等[12]人選用二型閉花受精植物石竹科孩兒參(pseudostellaria heterophylla)作為研究材料,利用轉錄組測序分析發(fā)現在開放花和閉鎖花芽中一些花發(fā)育相關基因存在明顯區(qū)別,認為閉鎖花的產生與環(huán)境密切相關,閉鎖花在花結構上表現為不同程度的退化,例如花很小,無花瓣,雄蕊數目和子房數目減少。 本研究在田間觀察發(fā)現,太子參花的形態(tài)主要以開放花為主,表現為萼片5,花瓣5,同時發(fā)現少部分太子參花在形態(tài)學上與前人研究的閉鎖花相異,其花瓣呈現簇狀成球形,與文獻報道的聚散花序相近,將其定義為新的表型-多花型。 另外,在太子參頂端存在莖二等分裂,表現為主莖粗壯,將其定義為雙柱型,在后期田間觀察比較發(fā)現其抗性能力較強,關于其抗性的評估尚需進一步研究。

藥用植物種質資源的選育目標不僅要考慮其產量,還要考慮其品質。 目前沒有明確的指標性成分評價太子參的品質,如2010 年《中華人民共和國藥典(一部)》規(guī)定太子參含量測定項以環(huán)肽B 作為質量指標,而2015、2020 年《中華人民共和國藥典(一部)》中并未出現該含量測定項。 本研究僅以2010 年《中華人民共和國藥典(一部)》[13]的環(huán)肽B含量的檢測方法對比不同表型含量差異,研究發(fā)現僅有中葉型太子參(表4)的含量達到標準(不少于0.02%),推測部分原因可能是由于種質資源的混雜;其次,缺乏新品種,種質退化導致。 因此,在太子參藥材產業(yè)化中,需要不斷的純化、繁育,才可形成性狀更穩(wěn)定的純系種質。 中葉型太子參不僅指標成分最高,產量也較高,可作為高產、高品質優(yōu)良品種選育的首選種質材料。 楊昌貴等[14]研究不同種源的太子參的環(huán)肽B 含量表明,不同的生長環(huán)境(林下、大田)對于太子參環(huán)肽B 的積累有明顯的差異,林下比大田的環(huán)肽B 含量高,遮陰在一定程度上有利于環(huán)肽B 的積累。 因此,可以模擬遮陰處理提高其太子參的環(huán)肽B 的含量。 另外,在種質資源圃選址的同時,考慮水分可能對于太子參的影響較大,因此選擇具有坡度的地勢,保證貴州頻繁降雨帶來的經濟損失。 本研究在表型分類的基礎上從生物學性狀、藥用成分含量和產量等方面開展了太子參的種質資源評價。 種質的遺傳背景相同,材料基因型穩(wěn)定,避免了常規(guī)以產地作為評價方式而忽視了遺傳混雜的弊端,為太子參農田栽培生產管理措施的優(yōu)化以及優(yōu)良新品種選育奠定了基礎,同時可為其它中藥材種質資源的評價提供參考。