向如雙 段寶忠 孫偉 宋馳 王艷 Atia tul Wahab 孟祥霄

臘腸樹(Cassia fistulaL.)屬于豆科決明屬植物,在我國南部及西南部地區(qū)有種植[1],它原產(chǎn)于印度,廣泛分布于世界各地[2],是一種具有較高的藥用、觀賞與工業(yè)經(jīng)濟價值的天然藥用植物[1]。 臘腸樹在許多傳統(tǒng)醫(yī)藥系統(tǒng)中被使用,包括:印度采用的阿育吠陀體系、我國采用的傳統(tǒng)醫(yī)藥體系和巴基斯坦采用的希臘阿拉伯體系[3-4],臘腸樹的果實、種子、樹皮、樹根、葉和花等部位均可入藥,在印度,它被用于治療肝臟疾病、糖尿病、結(jié)核病和泌尿道感染等[1,5-6],在巴基斯坦它被用于治療便秘、感冒、發(fā)燒[7],在我國,它被用于通便與抗菌[1]。

現(xiàn)代研究表明,因臘腸樹不同部位均富含大量活性化學物質(zhì),且這些活性化學物質(zhì)大多數(shù)尚未被開發(fā),它整體的藥理作用不明確[8],所以目前國內(nèi)外大多數(shù)研究主要集中于化學成分研究[3,9-10]和藥理作用研究[6,11-12]。 但是,在植物分類領(lǐng)域?qū)W術(shù)界對決明屬(Cassia)植物種類的劃分一直存在著較大爭議[13-15]。 近年來,隨著分子生物學領(lǐng)域研究的發(fā)展,葉綠體基因組研究越來越受到廣大科研人員的青睞,葉綠體基因組分析方法的出現(xiàn)為植物物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究提供了可靠手段[16],基于葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育研究已為毛重樓[17]、人參[18]、虎杖[19]等藥用植物更好地發(fā)揮其應用價值提供了理論基礎(chǔ),由于臘腸樹分子生物學領(lǐng)域方面的研究進程緩慢,極大地限制了臘腸樹的開發(fā)與利用。

鑒于此,本研究使用Illumina 測序技術(shù)及生物信息學方法對臘腸樹進行了葉綠體基因組特征和系統(tǒng)發(fā)育分析,以期從基因組學層面為決明屬植物分類提供依據(jù),并為臘腸樹資源的有效開發(fā)、保護和利用奠定理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品的新鮮葉片采自廣東省云浮市云安區(qū)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移工業(yè)園靄霖花園路邊(N23°2′5″, E112°10′52″),經(jīng)昆明采智生物技術(shù)有限公司鑒定為臘腸樹C.fistula,憑證標本(標本號:GD20220115)存放于中國中醫(yī)科學院中藥研究所國家中藥基因庫。

1.2 基因組DNA 的提取和測序

葉片基因組總DNA 使用天根植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)提取,總DNA 檢測合格后,通過安諾優(yōu)達基因科技有限公司高通量測序平臺Illumina NovaSeq(Illumina,美國)進行文庫構(gòu)建與測序[20]。 采用 SOAPnuke[21](版本:1.3.0)軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾,原始測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI 序列讀取檔案(SRA,登錄號:SRR18556254)。

1.3 葉綠體基因組的組裝與注釋

采用GetOrganelle[22](版本:1.7.5;參數(shù):-R 10)軟件對過濾后的數(shù)據(jù)進行基因組拼接;采用Bandage[23](版本:0.8.1)軟件手動解環(huán)得到完整的葉綠體基因組全序列;然后,以布魯斯特決明C.brewsteri(F.Muell.) Benth.(序列號:NC_047376)為參考序列,采用CPGAVAS2[24](網(wǎng)址:http:/ /47.96.249.172:16019/analyzer/home)對葉綠體全基因組序列進行注釋,組裝、注釋的葉綠體基因組已上傳至GenBank(登錄號:ON099431);采用在線工具Chloroplot ( 網(wǎng) 址: https:/ /irscope.shinyapps.io/Chloroplot/)繪制葉綠體全基因組的物理圖譜。

1.4 重復序列和密碼子使用分析

采用Codon W[25](版本:1.4.4)軟件對葉綠體全基因組密碼子偏好性進行分析,統(tǒng)計同義密碼子相對使用度(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU) 的值。 采用 REPuter[26](網(wǎng)址: https:/ /bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)在線工具(參數(shù):minimal repeat size 30 bp; Hamming Distance 3; Maximum Computed Repeats 5000.)分析葉綠體基因組中的散在長重復序列片段。 簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)分析采用MISA[27](版本:1.0;參數(shù):默認;unit size:1-10 2-5 3-4 4-3 5-3 6-3)軟件分析。

1.5 基因組比較分析

從NCBI 下載了與臘腸樹同屬的布魯斯特決明C.brewsteri(NC_047376)、美麗決明Senna spectabilis(DC.) H.S.Irwin et Barneby.(NC_054185)、山扁豆Chamaecrista mimosoidesStandl.(NC_047400)、望江南S.occidentalis(Linnaeus) Link.(NC_038222)、鐵刀木S.siamea(Lamarck)H.S.Irwin & Barneby.(MN525772)和決明S.tora(Linnaeus) Roxburgh.(NC_030193)的葉綠體基因組,使用Perl 中的SVG模塊,可視化了反向重復區(qū)(inverted repeat regions,IRa 和 IRb)、大單拷貝區(qū)(large single copy, LSC)和小單拷貝區(qū)(small single copy, SSC)區(qū)域的邊界差異信息。 并采用mVISTA 對其進行全基因組比對分析。

1.6 系統(tǒng)進化分析

為探討臘腸樹C.fistula的系統(tǒng)發(fā)育位置,本研究從NCBI 下載了7 條葉綠體基因組序列(6 條為近緣物種葉綠體基因組序列,1 條為外類群)構(gòu)建最大似然(maximum likelihood, ML)系統(tǒng)發(fā)育樹。 采用MAFFT(版本:7.471)軟件[28]對葉綠體基因組序列進行比對;采用RAxML(版本:8.2.12;核苷酸模型:GTRGAMMA;重復迭代次數(shù):1000)軟件[29]使用ML構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)

臘腸樹C.fistula葉綠體基因組是全長為161,724 bp 的四分體結(jié)構(gòu),包括一對反向重復序列(IRA和IRB,26,032 bp)、小單拷貝區(qū)(SSC, 18,616 bp)和大單拷貝區(qū)(LSC, 91,044 bp)(圖1 和表1),葉綠體基因組總GC 含量為36.1%。 在決明屬已發(fā)布葉綠體基因組的物種中除了鐵刀木S.siamea和山扁豆Ch.mimosoides葉綠體全基因組序列長度較短外,其余物種的葉綠體基因組的序列長度特征均與臘腸樹具有相似性(表1)。

表1 決明屬葉綠體基因組的序列特征列表

圖1 臘腸樹葉綠體基因組圖譜

2.2 葉綠體基因組功能及分類

經(jīng)CPGAVAS2 注釋結(jié)果顯示,其葉綠體基因組共包含128 個基因,其中83 個蛋白質(zhì)編碼基因,37個 tRNA 基因和8 個 rRNA 基因(表 2)。 這些基因主要分為四類:與光合作用相關(guān)的基因、自我復制相關(guān)的基因、功能未知的基因,以及成熟酶(matK)、蛋白酶(clpP)等其他基因。 在這些基因中,共有17個基因是雙拷貝基因,包括6 個蛋白質(zhì)編碼基因,7個tRNA 編碼基因和4 個rRNA 編碼基因。 決明屬已發(fā)布葉綠體基因組的物種中,美麗決明S.spectabilis和鐵刀木S.siamea注釋基因較少,其余物種的葉綠體基因組的基因個數(shù)與臘腸樹具有相似性(表3)。

表2 臘腸樹葉綠體基因組基因列表

表3 決明屬葉綠體基因組的基因個數(shù)統(tǒng)計表

2.3 散在長重復序列及SSR 分析

在臘腸樹葉綠體基因組中,共有62 條散在長重復序列,包括4 種類型,正向重復序列(forward,F)28 條、回文重復序列(palindromic,P)25 條、反向重復序列(reverse,R) 7 條、互補重復序列(complement,C)2 條。 四種類型片段的長度范圍均在30 ~52 bp 長度,而且長度為30 bp 的長重復序列數(shù)量最多,包括正向重復序列10 條,回文重復序列9 條,反向重復序列5 條(圖2)。 在臘腸樹葉綠體基因組中共檢測到113 個SSRs 位點,SSRs由77 個單核苷酸、15 個二核苷酸、10 個三核苷酸、7 個四核苷酸、4 個五核苷酸組成,SSR 的類型主要以 A/T 為主(77 個),而且大多數(shù) SSRs 以 A或T 結(jié)尾(圖3)。 SSR 位點在很大程度上分布在基因間隔區(qū)(intergenic spacer, IGS) 區(qū)(78 個,68%),其次是編碼區(qū)(19 個,17%)和內(nèi)含子區(qū)(16 個,15%)(圖 3)。

圖2 臘腸樹葉綠體基因組長序列重復類型

圖3 臘腸樹葉綠體組SSR 統(tǒng)計及SSR 位點分布

2.4 葉綠體基因組密碼子偏好性分析

本研究計算了臘腸樹葉綠體基因組密碼子RSCU 的值,統(tǒng)計結(jié)果顯示(圖4),檢測到共有20 種氨基酸被編碼,最常見的氨基酸是Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Ser(絲氨酸),AUG 是20 種編碼氨基酸中最常用的密碼子(RSCU 值為3)。 同時,頻率最低的密碼子是 AGC(RSCU 值為 0.3509)。RSCU 值>1 的密碼子數(shù)量為32 個,其中以 A 結(jié)尾的有13 個,以U(T)結(jié)尾的有19 個,表明臘腸樹葉綠體基因組主要偏好以A 和U(T)結(jié)尾的密碼子。

圖4 臘腸樹葉綠體基因組密碼子RSCU 分布情況

2.5 IR 邊界分析

臘腸樹與六個同屬物種(布魯斯特決明C.brewsteri、山扁豆Ch.mimosoides、望江南S.occidentalis、鐵刀木S.siamea、美麗決明S.spectabilis和決明S.tora)的葉綠體基因組的IR 邊界及基因分布見圖5。結(jié)果顯示,臘腸樹與六個同屬物種的葉綠體基因組共存在 4 個邊界,分別是 LSC/IRB、IRB/SSC、SSC/IRA 和IRA/LSC 邊界。 7 個決明屬物種的LSC/IRB邊界較為保守,LSC/IRB 邊界均位于rps19 基因內(nèi),且該基因跨越IRB 區(qū)域的長度范圍在103 ~109 bp內(nèi)。 所有物種在IRB/SSC 處邊界存在較大分化,僅有布魯斯特決明和鐵刀木的ndhF基因位于該邊界區(qū)域,其余物種的該基因均位于SSC 區(qū)域。 SSC/IRA 邊界除了望江南,其余物種的ycf1 基因均位于該邊界。 所有物種的IRA/LSC 邊界均與基因trnH存在著0 ~12 bp 的間隙。

圖5 臘腸樹葉綠體基因組的大單拷貝、小單拷貝和反向重復區(qū)邊界區(qū)域的比較分析

2.6 臘腸樹葉綠體基因組的比較分析

本研究嘗試將臘腸樹與NCBI 中上述六個同屬物種的葉綠體基因組的物種進行比較,因鐵刀木物種的psaB、psaA和ycf3 等多個基因或基因間隔區(qū)大概缺失達5200 bp,因此,本研究以組裝的臘腸樹葉綠體基因組為參照,將臘腸樹與其余5 個同屬物種進行比較。 結(jié)果顯示(圖6),6 條葉綠體基因組序列中LSC 區(qū)序列變異明顯大于SSC 區(qū),非編碼區(qū)域序列變異高于編碼區(qū)域。 結(jié)果顯示,絕大多數(shù)基因的相似度均在90%以上,變異較大的基因有rpoc2、ycf1 和ndhF等由圖可見。 六個決明屬植物的基因間區(qū),如:trnK-UUU-rps16、rps16-trnQ-UGG、trnSGCU-trnG-UCC、trnC-GCA-petN、trnT-UGU-trnLUAA、ndhC-trnV-UAC、rps8-rp114、ycf2-trnL-CAA、trnN-GUU-ndhF等,其基因間區(qū)變異均大于基因區(qū)。

2.7 臘腸樹葉綠體基因組的比較分析

為了確定臘腸樹的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,使用8 條葉綠體基因組序列(包括1 條豆科任豆屬的任豆Zenia insignisChun.序列為外類群,7 條豆科決明屬序列),構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果顯示(圖7),各節(jié)點的自展支持率均為100%,表明聚類結(jié)果的可靠性較高。 7 個決明屬物種被聚為3 個支,美麗決明S.spectabilis、 望 江 南S.occidentalis、 鐵 刀 木S.siamea和決明S.tora聚為一支,臘腸樹C.fistula與布魯斯特決明C.brewsteri聚為一支,山扁豆Ch.mimosoide單獨聚為一支,且臘腸樹親緣關(guān)系與布魯斯特決明C.brewsteri的親緣關(guān)系最近。

圖7 基于葉綠體全基因組序列構(gòu)建ML 系統(tǒng)進化樹

3 討論

植物葉綠體基因組在基因結(jié)構(gòu)、基因組成等方面具有一定的保守性,進化速度相對適中[30-32],為植物物種鑒定、系統(tǒng)進化、遺傳多樣性提供了有價值的信息[33]。 本研究完成了葉綠體基因組組裝、注釋、密碼子的偏好性、簡單重復序列及系統(tǒng)發(fā)育分析等。 葉綠體全基因組分析結(jié)果顯示,臘腸樹綠體基因組全長為161,724 bp,有典型的環(huán)狀DNA 雙鏈結(jié)構(gòu),葉綠體基因組結(jié)構(gòu)、基因功能分類與已發(fā)表的決明屬物種一致[34];重復序列分析結(jié)果顯示,臘腸樹葉綠體基因組中共檢測到113 個SSRs 位點,并且SSR 位點在很大程度上分布在基因間隔區(qū),這與苦馬豆[Sphaerophysa salsula(Pall.) DC.][35]、苦參(Sophora flavescensAlt.)[36]和黃丹木姜子[Litsea elongata(Wall.ex Nees) Benth.et Hook.f.][37]等眾多植物分析結(jié)果一致,臘腸樹葉綠體基因組中檢測到的SSRs 位點可為決明屬植物分子標記開發(fā)提供理論依據(jù)。 葉綠體基因組序列變異分析結(jié)果顯示,非編碼區(qū)域序列變異高于編碼區(qū)域,變異較大的基因位點(rpoc2、ycf1、ndhF)和基因間區(qū)位點(trnK-UUU-rps16、rps16-trnQ-UGG、trnS-GCU-trnG-UCC等),為決明屬植物的分子鑒定提供了位點資源。

在之前的研究中, 學術(shù)界對決明亞族(Cassiinae)植物種類的劃分、學名的應用、屬下分類系統(tǒng)等方面一直存在著較大爭議[13-15]。 決明屬(Cassia)是由 Linnaeus 首次發(fā)表,1964 年 Hutch 使用了該屬名稱[13]。 Irwin 和Barneby[15,38]將其提升為決明亞族(Cassiinae),其下拆分成3 個屬,包括決明屬(Cassia)、山扁豆屬(Chamaecrista)和番瀉決明屬(Senna)。 而1988 版《中國植物志》[39]中決明族只分為長角豆屬(Ceratonia)、任豆屬(Zenia)和決明屬(Cassia)3 個屬,記載決明屬的物種有22 種[14],并且有些決明屬的物種在中國植物志上搜索顯示學名、拉丁名已被修訂,如Cassia siamea、Cassia spectabilis、Cassia tora拉丁名已修訂為Senna siamea、Senna spectabilis、Senna tora,而含羞草決明Cassiamimosoides的學名、拉丁名分別被修訂為山扁豆Chamaecrista mimosoides。 但在 2010 版的 Flora of China[40]中,豆科決明亞族下有決明屬、番瀉決明屬、長角豆屬和山扁豆屬4 個屬[14]。 本研究結(jié)果表明,基于葉綠體基因組的ML 樹顯示,7 個物種被聚為3 支,美麗決明S.spectabilis、望江南S.occidentalis、鐵刀木S.siamea和決明S.tora聚為一支,臘腸樹C.fistula與布魯斯特決明C.brewsteri聚為一支,山扁豆Ch.mimosoide單獨聚為一支。 從葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育的角度來看,本研究支持2010 版的 Flora of China 的決明亞族植物種類的劃分結(jié)論[40],臘腸樹C.fistula歸為決明屬(Cassia), 美麗決明S.spectabilis、望江南S.occidentalis、鐵刀木S.siamea和決明S.tora歸為番瀉決明屬(Senna),山扁豆Ch.mimosoide應歸為山扁豆屬(Chamaecrista)。 關(guān)于決明亞族植物種類的劃分存在的問題,仍需要后續(xù)更多分子生物學和形態(tài)學的研究去提供證據(jù)。本研究的臘腸樹的葉綠體基因組特征和系統(tǒng)發(fā)育分析可為決明亞族植物種類的劃分提供重要的參考依據(jù),對臘腸樹資源的有效開發(fā)、保護和利用奠定理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。