賈旭爽，陳宇楊，鮑慧瑋，張亞杰(長春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林 長春·130117)

黃芪-甘草藥對始載于《太平惠民和劑局方·卷五治諸虛》，由黃芪-甘草兩味藥組成[1]，黃芪甘溫，補脾肺、升清陽，為補氣要品;甘草甘平，補脾胃，益中氣。兩藥相須配伍，取甘以守中，使補中益氣之力增強[2]。本課題以甘草、黃芪為研究對象，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測5種酶的mRNA表達，以此為甘草、黃芪藥對的臨床合理聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

甘草與黃芪兩種飲片均購自吉林省宏檢大藥房有限公司；RNA提取試劑盒(Biomed公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶及QSCR擴增試劑購自TransGen公司；2 xTaqPCR Master Mix(北京天根生物科技有限公司);Fast Quant第一鏈合成試劑盒(批號:KRR121221，北京天根生物科技有限公司);RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 儀器設(shè)備

臺式低溫高速離心機(上海飛鴿儀器廠);實時定量PCR儀（賽默飛世爾）；酶標儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 實驗動物

雄性Wistar大鼠，體重180～220g，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。這批大鼠的實驗動物合格證號SCXK(吉)2020-0002。大鼠喂飼標準飼料和水，飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學(xué)動物中心、12h日夜節(jié)律。

2 方法

2.1 藥物的制備與配制

按《醫(yī)林改錯》中載黃芪和甘草的規(guī)定的劑量黃芪10g、甘草2.5g進行換算，取甘草、黃芪，浸泡1h，8倍水小火煎煮30min，過濾后濾渣6倍水再煎煮30min，兩次濾液經(jīng)70℃濃縮，最終得黃芪-甘草組濃度為0.14g/mL生藥。甘草、黃芪單煎液的濃度為0.14g/mL生藥、0.028g/mL生藥。

2.2 動物分組及給藥

實驗動物隨機分為空白對照組、甘草組、黃芪組、甘草-黃芪組，每組5只，灌胃給藥，14 d后，處死動物并提取部分動物肝臟-80℃保存，以備RNA檢測。

2.3 RT-PCR技術(shù)測定大鼠肝臟mRNA表達

肝 臟 中CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1酶基因的表達是通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)來被量化。使用Trizol試劑盒從肝臟組織中提取總RNA,RNA含量通過260nm波長處的吸光度來測量。每只大鼠肝藥酶的RNA樣品純度為A260/A280比值范圍在1.8～2.2。隨后，提取的肝藥酶的RNA在FastQuant第一鏈合成試劑盒的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，加入2 x TaqPCR Master Mix和特異性引物以及ddH2O進行cDNA擴增，將5種肝藥酶和內(nèi)參基因CYC用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離辨認，在凝膠成像系統(tǒng)中對各個條帶亮度進行測定，計算CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1和CYC基因擴增條帶表達量像素灰度值比值[3]。

2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 甘草-黃芪及單藥對大鼠肝臟5種肝藥酶mRNA基因表達的影響

與空白對照組比，甘草、甘草-黃芪對CYP1A2 mRNA的表達具有顯著的上調(diào)作用(P＜0.05)，而黃芪具有上調(diào)趨勢,結(jié)果見圖1;甘草、黃芪、甘草-黃芪CYP2C19 mRNA的表達都具有顯著的下調(diào)作用(P＜0.01)，結(jié)果見圖2;各組對CYP2D6 mRNA的表達無影響，結(jié)果見圖3；各組對CYP2E1 mRNA的表達都具有顯著的上調(diào)作用(P＜0.01)，結(jié)果見圖4；甘草、黃芪、甘草-黃芪對CYP2C9 mRNA的表達都具有顯著的下調(diào)作用(P＜0.05)，結(jié)果見圖5。

圖1 甘草-黃芪以及2味單藥對大鼠肝臟CYP1A2酶mRNA表達影響（±s，n=5）Fig.1 Effects oflicorice–astragalus and its two componts drugs onmRNA expression of CYP1A2 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖2 甘草-黃芪以及2味單藥對大鼠肝臟CYP2C19酶mRNA表達影響（±s，n=5）Fig.2 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2C19 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖3 甘草-黃芪以及2味單藥對大鼠肝臟CYP2D6酶mRNA表達影響（±s，n=5）Fig.3 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2D6 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖4 甘草-黃芪以及2味單藥對大鼠肝臟CYP2E1酶mRNA表達影響（±s，n=5）Fig.4 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2E1 enzyme in rat liver（±s，n=5）

圖5 甘草-黃芪以及2味單藥對大鼠肝臟CYP2C9酶mRNA表達影響（±s，n=5）Fig.5 Effects of licorice–astragalus and its two componts drugs on mRNA expression of CYP2C9 enzyme in rat liver（±s，n=5）

4 討論

藥對是中醫(yī)用藥的的常見方式，藥對有的是來源于古代經(jīng)典名方的配伍，也可以是現(xiàn)代醫(yī)家的臨床經(jīng)驗的總結(jié)，藥對在用藥過程中可以單用，也是某些復(fù)方的組成單位。甘草和黃芪藥對既可以單獨成方“黃芪甘草湯”，也可以和其他藥物配成復(fù)方，不同藥物配伍使用的過程中會發(fā)生相互作用，其中一種可能是對肝藥酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，從而使藥物的療效和損害作用產(chǎn)生影響，研究藥物對肝藥酶的影響可以為臨床高效低毒用藥提供參考。

本研究從對肝藥酶活性、mRNA表達的層面來闡述甘草、黃芪配伍對CYP450酶的影響。結(jié)果顯示，甘草-黃芪能誘導(dǎo)CYP1A2酶和CYP2E1酶，抑制CYP2C19,CYP2C9酶。因此，如果治療過程中需要合用黃芪甘草湯或含有甘草-黃芪藥對的復(fù)方時，要注意藥物的減量或增量，提高藥物的治療效果，降低藥物治療的不良反應(yīng)發(fā)生率。