李健豪，謝麗娟，于 晶，馮慧柳，宋瑩瑩，郭暢冰，初賽君，董亞南，徐芳菲*

(吉林人參研究院·吉林 通化·134001)

人參（Panax ginseng C.A.Mey）[1]，為五加科多年生草本植物人參的干燥根，為我國傳統(tǒng)名貴中草藥，有“百草之王”的美譽(yù)[2]，人參近多年來已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品等多種領(lǐng)域，其主要化學(xué)成分為人參皂苷，人參皂苷按構(gòu)型主要分為二醇型與三醇型兩大類[3]，除此外人參中還含有多糖、氨基酸、黃酮以及各種微量元素等多種化學(xué)成分[4-6]。有實(shí)驗(yàn)研究表明人參皂苷Rb1干預(yù)下能夠減少乳酸的分泌顯著提高血清肌酸激酶的恢復(fù)從而提小鼠的耐受能力[5]，同時(shí)人參皂苷Re對藥源性所引起的肝腎損傷存在一定的緩解作用[7]，也有研究報(bào)道人參皂苷提取物能夠促進(jìn)提升中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能，恢復(fù)中老年人非特異性和淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性防御功能[8]，然而大量研究報(bào)道均集中于人參根，以往對人參其他非藥用部位的成分研究卻鮮有報(bào)道，近幾年來國內(nèi)外學(xué)者對人參化學(xué)成分的研究逐漸向非藥用部位拓展，有研究表明人參花蕾和人參莖葉中的部分皂苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人參根中，同時(shí)人參莖葉的市場價(jià)格與人參根相比較為低廉，性價(jià)比更高，且莖葉中所含葉綠素和纖維性成分更為豐富，吉林省作為人參道地主產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量約達(dá)3萬余噸，本課題組已對人參非要用部位進(jìn)行過初期探究，研究發(fā)現(xiàn)人參莖葉中主要含有5種人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd）含量與人參根種具明顯差異。本文旨在通過實(shí)驗(yàn)摸索出一種同時(shí)檢測人參莖葉中5種人參皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd）準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定檢測方法，為人參非要傳統(tǒng)用部位日后的研究提供理論依據(jù)，也對將來的進(jìn)一步分離人參莖葉中單體皂苷進(jìn)行試驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

10批次人參莖葉：分別采購自吉林集安，經(jīng)吉林人參研究院徐芳菲高級工程師鑒定為人參地上部分的干燥莖葉。乙醇、乙醚、正丁醇：（分析純）北京化工廠；甲醇、乙腈為色譜純（Fisher，USA）；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。

SQP電子天平：賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵：上海振捷儀器設(shè)備有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀、色譜柱（ZORBAX SB-C18250mm×4.6mm，5μm）。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備

分別取10批人參莖葉樣品于烘箱中55℃烘干，粉碎，過60目篩。精密稱取人參莖葉試樣粉末各1g，加50mL80%乙醇加熱回流1.5h，反復(fù)提取3次，合并濾液，蒸干。殘?jiān)?0mL水溶解并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再加30mL水飽和正丁醇萃取，重復(fù)萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸干。殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，為待測液，備用。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd對照品各2mg，加甲醇定溶至10 mL，配置成各含0.2 mg/mL混合對照品溶液，搖勻，即得。

1.2.3 HPLC檢測條件

色譜柱ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量20 μL，柱溫33℃，流速1 mL/min，檢測波長203 nm，流動相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫，0~35 min，19 %（A）81 %（B），35 min~50 min，19%~29%（A）81%~71%（B），50 min~70 min，29%（A）71%（B），70 min~80 min，29%~35%（A）71%~65%（B），80 min~100 min，35%~40%（A）65%~60%（B）；將供試品及對照品溶液分別進(jìn)入HPLC進(jìn)行檢測。

1.2.4 線性關(guān)系考察實(shí)驗(yàn)

精密吸取對照品溶液，分別稀釋成不同梯度的6種濃度，分別進(jìn)入HPLC，計(jì)錄色譜峰面積，橫坐標(biāo)（X）為進(jìn)樣質(zhì)量（μg）、縱坐標(biāo)（Y）為對應(yīng)的峰面積，并對上述5種人參皂苷的對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制。

1.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取對照品溶液中5種標(biāo)準(zhǔn)品任一濃度，按照“1.2.3”中色譜條件吸取20μL，進(jìn)行HPLC分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，分別記錄峰面積的變化情況，計(jì)算RSD值。

1.2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次樣品，分別取樣6份，采用“1.2.1”方法平行制備6個(gè)供試品溶液，分別根據(jù)“1.2.3”中色譜條件，進(jìn)行HPLC分析測定，計(jì)算樣品中5種人參皂苷的含量及RSD值

1.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“1.2.1”方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24、48h時(shí)間段進(jìn)樣，記錄5種人參皂苷的峰面積，計(jì)算含量及RSD值。

1.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取人參莖葉試樣粉各末1g，共6份，均分別加入上述5種人參皂苷對照品各0.5mg（0.2 mg/mL，2.5mL），按照“1.2.1”處理方法進(jìn)行供試品制備，利用HPLC分析，計(jì)算回收率及RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品含量測定結(jié)果

對5種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測，由圖2可見，其分離度良好，同時(shí)，由表1可知10批次人參莖葉中5種人參皂苷含量，不難看出人參莖葉中人參皂苷Rg1、Re、Rd含量較為突出，人參皂苷Rb1、Rc的含量較低。

圖2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd標(biāo)準(zhǔn)樣品

表1 人參莖葉中5種人參皂苷成分的含量（mg/g）

2.2 方法學(xué)結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系

結(jié)果表明，5種人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，分別得到Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5種人參皂苷的線性關(guān)系，R2≥0.9992。

表2 5種人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.2.2 精密度

分別測得5種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd峰面積的RSD值（n=6）分別為0.46%、0.57%、0.61%、0.59%、0.67%，表明此方法精密度良好。

2.2.3 重現(xiàn)性

表3充分顯示，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的含量平均值分別為5.382mg/g、11.364 mg/g、0.623 mg/g、1.772mg/g、6.329mg/g，RSD值 在1.57%～2.27%之間，表明該方法重現(xiàn)性良好。

表3 5種人參皂苷重線性

2.2.4 穩(wěn)定性

經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出5種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd峰面積的RSD值別為0.51%、0.53%、0.49%、0.72%、0.64%表明供試品溶液在0～48 h內(nèi)趨于穩(wěn)定，其穩(wěn)定性較為良好。

2.2.5 加樣回收率

5種人參皂苷對照品加樣回收率值分別為Rg1：75.2%～84.6%、Re：65.7%～79.6%、Rb1：74.7%～89.6%、Rc：67.3%～78.4%、Rd：72.8.2%～82.9%，平均回收率RSD值均＜3%（n=6）。

其方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果充分表明該方法可用于人參莖葉中5種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的含量測定，其方法快速準(zhǔn)確，穩(wěn)定性良好。?

人參莖葉作為人參非傳統(tǒng)藥用部位，其主要成分中皂苷種類與人參相差無幾，但部分皂苷含量有區(qū)別于人參，其中人參皂苷Rd尤為明顯。人參皂苷Rd能夠通過抑制Caspase-3的活化，增加Akt和GSK-3β磷酸化，提高Bcl-2/Bax的比值繼而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)心肌的作用，其良好的生物活性，有待對其分離純化的工藝進(jìn)行更深入的研究。同時(shí)，人參莖葉同產(chǎn)的不同批次中5種人參皂苷含量存在一定的差異，其原因是否與其采收時(shí)間，生長環(huán)境，抑或者是其種質(zhì)資源的差異性不同而導(dǎo)致，都需進(jìn)一步探討。本研究對人參莖葉中5種人參單體皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd）含量進(jìn)行了分析，建立了一個(gè)快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性較好的人參莖葉多種皂苷類成分的定量檢測方法旨在為更好地控制人參莖葉的質(zhì)量，多方面開發(fā)人參莖葉的食藥價(jià)值提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，希望更多的專家學(xué)者對人參非傳統(tǒng)藥用部位進(jìn)行多元化、全方面的開發(fā)利用，加速推動人參產(chǎn)業(yè)更快更好的發(fā)展。